冠心病和冠心病合并糖尿病检测靶标及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及冠心病和冠心病合并糖尿病检测靶标及其应 用，更具体的涉及冠心病和冠心病合并糖尿病检测靶标FRG1及其应用。
【背景技术】
[0002] 冠心病(coronary heart disease，CHD)即冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称，指 冠状动脉发生粥样硬化引起的管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏 病，也称为缺血性心脏病。我国每年约有几百万人死于心血管病，在这之中尤其以冠心病对 人民健康的威胁最大。关于动脉粥样硬化现在己经确立了多种危险因素，其中以糖尿病特 别突出，糖尿病患者与非糖尿病人群相比冠心病发病率常高出数倍，病情进展十分迅速，约 75%糖尿病患者最后死于冠心病。随着糖尿病的患病率的增加，其患病人群中的青壮年人 逐年增长，对社会和家庭的危害更加严重。虽然多年来对关于动脉粥样硬化的基础和临床 研究的取得了很大的进步，发现其发病与遗传、炎症、免疫、代谢等紧密相关，但是其具体机 制仍未完全阐明，此外，冠心病合并糖尿病的发病机制研究更少，目前临床迫切需要寻找冠 心病、冠心病合并糖尿病的分子诊断标记，进行早预防、早治疗，尤其是对冠心病合并糖尿 病患者，早期诊断将有效提高患者生存率。
[0003] 为解决目前冠心病和冠心病合并糖尿病早期分子诊断标记稀缺的问题，发明人对 2例单纯冠心病患者，6例冠心病合并糖尿病患者及10例健康人对照外周血样本进行高通量 测序，结合生物信息学方法分析进行靶点基因的筛选，挑选出候选基因 FRG1，进一步，通过 实验证实了 FRG1基因与冠心病和冠心病合并糖尿病具有很好的相关性，并且可以用来区分 这两种疾病，为临床的防治提供参考，进一步，发明设计了针对FRG1的高效干扰RNA，为后续 治疗制剂的研制提供基础。本发明提供的冠心病和冠心病合并糖尿病辅助诊断靶标具有很 好的临床应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供检测FRG1基因和/或其表达蛋白的制剂在制备冠心病和/ 或冠心病合并糖尿病诊断制剂中的应用。
[0005] 进一步，冠心病和/或冠心病合并糖尿病的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基 因芯片方法检测外周血中FRG1基因和/或FRG1蛋白的表达。
[0006] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的 初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0007] 基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚 合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶 基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针 阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速 简便;三是可同时检测多种疾病。
[0008] 用于荧光定量PCR方法检测冠心病和/或冠心病合并糖尿病中FRG1基因的产品含 有一对特异性扩增FRG1基因的引物;所述的基因芯片包括与FRG1基因的核酸序列杂交的探 针。
[0009] 进一步，冠心病和/或冠心病合并糖尿病的诊断制剂包括用免疫方法检测FRG1蛋 白的表达。优选所述免疫检测方法检测冠心病和冠心病合并糖尿病中FRG1蛋白表达的为 western blot和/或ELISA和/胶体金检测方法。
[0010] 酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA JLISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸 酶(AP)。
[0011]常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作 载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应 的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金 标记试剂(抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上 后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的 抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集 在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。 [00 12]进一步，检测FRG1蛋白的ELI SA法为使用ELI SA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体 可采用市售的FRG1单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括:包被FRG1单克隆抗体的固相载 体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
[0013] 进一步，检测FRG1蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的 FRG1单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗 滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗FRG1单克隆 抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0014] 本发明的目的在于提供一种检测冠心病和/或冠心病合并糖尿病的荧光定量PCR 试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因 FRG1，采用特异的上游引物和下游引物，上游引 物序列为SEQ ID N0.12,下游引物序列为SEQ ID N0.13。
[0015] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵 敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0016] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、焚光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID N0.12， 下游引物序列为SEQIDN0.13。所述内参引物为β-aCtin内参引物，上游引物序列为SEQID NO. 14,下游引物序列为SEQ ID NO. 15。
[0017] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0018] 本发明目的是提供了一种冠心病和/或冠心病合并糖尿病检测试剂盒，所述的检 测试剂盒检测FRG1蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0019] 本发明目的是提供了一种检测冠心病和冠心病合并糖尿病的基因芯片，所述的基 因芯片包括与FRG1基因的核酸序列杂交的探针。
[0020] 本发明的目的在于提供FRG1基因和/或其蛋白抑制剂在制备抗冠心病和/或冠心 病合并糖尿病制剂中的应用。
[0021] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因 FRG1，继而通过分子生物学方法验证了 FRG1与冠心病和冠心病合并糖尿病的关系:FRG1 与冠心病和冠心病合并糖尿病具有很好的相关性，可用于制备抗冠心病和冠心病合并糖尿 病制剂和/或冠心病和冠心病合并糖尿病诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
[0022]进一步，抗冠心病和/或冠心病合并糖尿病制剂是指可以抑制FRG1基因的表达的 制剂。本领域人员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种:通过激 活FRG1基因的抑制基因、激活FRG1基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制FRG1 基因表达、激活促进FRG1基因 mRNA降解的mi cr oRNA、导入促进FRG1基因编码蛋白降解的分 子、抑制促进FRG 1基因表达的因子及蛋白的表达。