即通过激活FRG 1基因的抑制基因、激活抑 制FRG 1基因表达的蛋白、导入抑制FRG 1基因表达的s iRNA、激活促进FRGImRNA降解的 m i cr oRNA、导入促进FRG 1蛋白降解的分子、抑制促进FRG 1基因表达的因子及蛋白的表达。 [0023] RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA 特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内 某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。s iRNA设计 完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉 淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体 试剂法等途径转染细胞。
[0024] 进一步，所述抑制FRG1基因表达的siRNA靶点序列选自下列序列中的一种和/或几 种：SEQ ID N0.USEQ ID N0.4、SEQ ID N0.7。优选siRNA靶点序列为SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3〇
[0025] 进一步，所述抑制FRG1基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种： SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9。优选 siRNA序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9。
[0026] 本发明的目的在于提供一种抗冠心病和/或冠心病合并糖尿病制剂，抗冠心病和/ 或冠心病合并糖尿病制剂抑制FRG1基因的表达。进一步，抗冠心病和/或冠心病合并糖尿病 制剂中含有抑制FRG1基因表达的siRNA。
[0027] 本发明的目的在于提供检测FRG1基因和/或FRG1蛋白的制剂在区别冠心病和冠心 病合并糖尿病中的应用。
[0028] 进一步，检测FRG1基因的制剂用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测FRG1基因 和/或FRG1蛋白的表达。
[0029]用于荧光定量PCR方法的制剂中含有一对特异性扩增FRG1基因的引物;基因芯片 方法的制剂中包括与FRG1基因的核酸序列杂交的探针。
[0030] 进一步，检测FRG1蛋白的制剂用免疫方法检测FRG1蛋白的表达。优选所述免疫检 测方法为we s t ern b 1 〇 t和/或EL ISA和/胶体金检测方法。
【附图说明】
[0031] 图1是FRG1基因在冠心病、冠心病合并糖尿病外周血及健康人外周血中相对表达 量图
[0032] 图2是RNA干扰后各组FRGlmRNA相对表达水平图
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0034]实施例1样品采集与提取
[0035] 病例组(共10人，2例单纯冠心病患者，6例冠心病合并糖尿病患者，临床信息详见 表1，及对照组(共10人)要求空腹至少12h，于次日清晨7:00-8:00室温下，抽取10ml静脉血 于乙二胺四乙酸（EDTA)抗凝管，提取外周血单个核细胞PBMCs，加入lml Trizol试剂 (Invitrogen公司），充分混匀，-80°C保存标本，以用于RNA提取。所有的血样和病理结果应 真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
[0036]表1病例组患者临床信息
[0037]
[0038] 提取患者和健康对照组外周血单个核细胞（PBMCs)中总RNA，要求：RNA纯度： 0D260/280 g 1 · 8，28S/18S g 1; RNA完整性：RIN值g 7 · 0。方法：RNA浓度和纯度检测方法： NanoDrop2000;RNA完整性检测方法:Agilent 2100(RNA6000Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳 (琼脂糖凝胶浓度：1 %琼脂糖胶；电压:5V/cm;时间：20min)。
[0039]实施例2高通量测序及分析
[0040] mRNA文库构建:真核生物mRNA 3'末端具有ployA尾的结构，利用带有Oligo(dT)的 磁珠富集mRNA，高温片段化后，以其为模板，合成cDNA。经过磁珠纯化、末端修复、3 '末端加 碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，构建mRNA文库。根据RNA样本检测结果，对2例单纯冠心 病患者(GX)以及6例冠心病合并糖尿病患者(GX_TN)与正常对照组进行mRNA文库构建。
[0041 ] 测序:运用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量测序技术对mRNA进行测序，通 过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。
[0042] 表达数据分析:通过对冠心病组和正常对照组测序结果的分析，筛选到488个差异 表达基因（P〈〇. 05)，其中400个基因上调，88个基因下调。通过对冠心病合并糖尿病组和正 常对照组测序结果的分析，筛选到439个差异表达基因（P〈0.05)，其中370个基因上调，69个 基因下调。通过对冠心病和冠心病组合并糖尿病组测序结果的分析，筛选到388个差异表达 基因（P〈0.05)。基于高通量转录组测序结果，我们通过比较单纯冠心病组VS正常对照组、冠 心病合并糖尿病组VS正常对照组、冠心病组VS冠心病合并糖尿病足，三组比较中同时出现 的差异表达基因50个，综合比较选取后备基于FRG1进行后期验证。
[0043] 实施例3冠心病、冠心病合并糖尿病患者、健康人外周血中FRG1基因的表达一、材 料和方法
[0044] 1、材料
[0045] 收集65例冠心病患者外周血、52例冠心病合并糖尿病患者外周血及44例健康人外 周血，对其进行分组及编号。
[0046] 2、方法
[0047] 2.1外周血总RNA的提取
[0048] 采用TRlzol? Reagent进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行。
[0049] RNA质量判定标准:RNA样本的0D260/0D280值为1.8-2.2之间；总8嫩电泳图谱有清 晰的28S、18S条带;70°C水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。 [0050] 2.2逆转录合成〇0嫩
[0051 ]米用Superscript?III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号 18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0052] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lyg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μ1 反应体系，每个样品取lyg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：
[0053] 5X逆转录缓冲液5yl，10mmol/l dNTP 1.25yl，0.1mmol/l DTT 2·5μ1，30μπιπιο1/1 OligodT 2μ1，20〇υ/μ1 MMLV 1·25μ1，模板RNA lyg，加入灭菌水至总体系25μ1。
[0054] 42 °C孵育1小时，7 2 °C 10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20 °C冰箱备用。
[0055] 2.3Real-Time PCR
[0056] 2.3.1仪器及分析方法
[0057]用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-AACT法进行数据的相对定量分析。
[0058] 2.3.2引物设计
[0059] 采用在线引物设计软件，模板序列为NM_004477,引物设计后由invitrogen公司合 成。具体引物序列如下：
[0060] 表2引物序列
[0061]
[0062] 操作过程如下：
[0063] (一）反应体系：用Power SYBR?. Green PCR Master Mix( invitrogen，货号 4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为:95° 10min，（95°C15sec，60°C 60sec) X35个循环。
[0064] 表3RealTime反应体系
[0065]