一种采用邻位连接技术检测降钙素原的方法
【专利摘要】本发明提出了一种利用高灵敏度的蛋白质检测技术---邻位连接技术（proximityligationassay,PLA）检测临床系统性感染及炎症损伤指标降钙素原（procalcitonin,PCT）含量的新方法。它将复杂的蛋白检测转换成对DNA的检测，并通过实时荧光定量PCR的方法将信号放大，可以检测在体内低表达的降钙素原。实验结果表明,采用邻位连接技术检测降钙素原比传统的检测方法灵敏度高，特异性强,操作简单易行，且成本低，能够检测到较低浓度的降钙素原，对于临床检测有重要作用。
【专利说明】一种采用邻位连接技术检测降钙素原的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学与分子免疫学领域，涉及一种降钙素原的检测技术。
【背景技术】
[0002] 近年来，临床上发现一种对全身性感染及其并发症的有效监测的新指标，它能够 有效地反映感染导致的炎症损伤程度---降钙素原（PCT)，当病人受到细菌、真菌、寄生虫 严重感染、产生脓毒症或多脏器功能衰竭时，降钙素原在血浆中的含量显著高。PCT是激素 降钙素，它是由116个氨基酸组成的糖蛋白，是降钙素（calcitonin，CT)的前体。PCT是由 滤泡旁细胞甲状腺（C细胞）以及和肠的神经内分泌细胞产生的，正常健康人体内PCT水平 很低（〈0.05 ng/mL),当血清中PCT含量高于2 ng/mL时，出现败血症的风险较高。当发 生全身性炎症或细菌感染2至4小时内，PCT的水平会急骤升高，可提升高达5000倍，且在 几小时内维持高水平，对全身以及局部的细菌性感染的鉴别十分有利。降钙素原（PCT)是 一个具高灵敏度、高特异性的新指标，还能在早期鉴别细菌与非细菌感染，现有的数据也显 示，PCT水平的上调很少受病毒感染的影响，但可以作为血症的预警和诊断指标，且PCT在 血清中的含量高低与细菌感染的严重程度成正相关。监测PCT水平可以对炎症性疾病、脓 毒血症、急性胰腺炎等全身或多种局部炎症进行诊断，是目前最敏感和最特异的诊断指标。 所以PCT的低成本、高灵敏度、快速便捷的检测方法在临床上具有十分重要的意义。另外， PCT水平是有关的抗生素治疗的起始或终止的重要依据。但是目前市场常见的PCT检测方 法，有些是板式或管式固定包被抗原或抗体，有一定的局限性，不利于免疫反应的进行；多 数利用荧光物质标记抗体，发光物质稳定性差，发光效率低、时间短；有些会造成环境污染； 有些操作复杂、较难保证结果的重复性；有些检测灵敏度低，且成本上也不具有优势。
[0003] 邻位连接技术（proximity ligation assay, PLA)是一项高灵敏度的蛋白质分析 技术。此方法利用一对带有化学基团修饰的单链DNA与修饰后的蛋白识别因子偶联，与抗 原共孵育，特异性地进行抗原抗体反应，然后通过连接酶的作用以及连接探针的辅助将核 酸序列连接起来,并加入引物、Taqman探针和Taq酶的反应溶液，进行实时PCR，最后通过检 测荧光信号便可知道被测蛋白是否存在及含量多少。这种方法能够将对蛋白的复杂检测转 化为对DNA的检测。凭借其检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设备 常见等优势，在蛋白质含量检测、研究蛋白质间相互作用、DNA与蛋白质间相互作用等许多 蛋白质组学相关领域已经取得了很好的研究成果。目前，邻位连接技术主要有液相、固相及 细胞原位3种反应形式，可用于体外及体内实验或检测。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是：本发明采用科技前沿的新型蛋白检测技术检测临床 系统性感染及炎症损伤指标降I丐素原（procalcitonin, PCT)含量，可以用于临床疾病的诊 断、诊断试剂盒的研发，以及医学和生物研究等众多领域。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：采用一种邻位连接技术来 检测降钙素原的方法，其具体步骤为： (1) 合成邻位连接技术所需要的偶联DNA--Arml和Arm2,其核苷酸序列分别为：SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3;连接反应所用连接DNA片段，其核苷酸序列为：SEQ ID N0:7;实 时荧光定量反应所需扩增引物及引物探针，其核苷酸序列分别为：SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6 ； (2) 取含有降钙素原多克隆抗体的样本与DBCO试剂进行反应，使降钙素原多克隆抗体 的肽链N端添加 NHS基团；反应完成后，加入Tris-HCl以终止上述反应； (3) 将修饰有NHS基团的降钙素原多克隆抗体分成两份，分别与5'端修饰有叠氮基 团的单链DNA片段Arml，即SEQ ID NO :2和3'端修饰有叠氮基团的单链DNA片段Arm2即 SEQ ID NO :3进行孵育，使两份降钙素原多克隆抗体分别偶联其中一种单链DNA片段，构 成Arml-多抗和Arm2_多抗； (4) 取降钙素原多克隆抗体加入磁珠中进行偶联，之后加入降钙素蛋白作为抗原进行 抗原抗体特异性结合，使抗原-抗体-磁珠偶联在一起以起到固定抗原的作用； (5) 取步骤（3)中制备好的Arml-多抗和Arm2-多抗加入上述抗原抗体反应溶液中， 旋转孵育后，使用该反应溶液为模版，加入连接试剂、连接DNA片段，S卩：SEQ ID NO:7以及 实时荧光定量PCR扩增试剂，在连接酶作用下使得Arml-多抗和Arm2-多抗上的D N A尾 部游离的5 '端和3 '端与连接DNA片段的互补序列杂交，形成一个环状的蛋白质-单链 DNA复合物，采用实时荧光定量P C R扩增复合物中的单链DNA部分进行检测，其中 实时荧光定量PCR反应所用上游引物为SEQ ID NO :4,下游引物为：SEQ ID NO 5,引物探针 为 SEQ ID NO : 6。
[0006] 优选的，上述的采用邻位连接技术检测降钙素原的方法中，步骤（4)中加入不同浓 度的降钙素蛋白抗原进行抗原抗体特异性结合过程中，所加的不同浓度的降钙素蛋白分别 为 0ng/mL、0. 005ng/mL、0. 05ng/mL、0. 5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL〇
[0007] 优选的，上述的采用邻位连接技术检测降钙素原的方法，其步骤（4)中加入不同浓 度的降|丐素抗原浓度分别0ng/mL、lng/mL、100ng/mL，且各自加入10%血清混勻，模拟不同 PCT含量的实际样本，用以验证血清对该检测方法的影响。
[0008] 本发明的有益效果是：利用高灵敏度的蛋白质检测技术一邻位连接技术 (proximity ligation assay, PLA)检测临床系统性感染及炎症损伤指标降|丐素原 (procalcitonin，PCT)含量，该方法利用一对带有化学基团修饰的单链DNA与修饰有NHS 基团的降钙素原多克隆抗体偶联，与抗原共孵育，特异性地进行抗原抗体反应，然后通过连 接酶的作用以及连接DNA片段的辅助将核酸序列连接起来，并加入相应的引物、引物探针， 进行实时荧光定量PCR，最后通过检测荧光信号便可知被测降钙素原是否存在及含量多少。 这种方法能够将对蛋白的复杂检测转化为对DNA的检测，且能够检测到较低浓度的PCT，灵 敏度较高。本发明可将科技前沿的新型蛋白检测技术与一些临床指标相结合，可以应用于 医学和生物学等众多领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1是邻位连接技术检测降钙素原流程的模式图； 图2是纯化获得的降钙素原蛋白的SDS-PAGE的电泳图； 图3A是针对PCT蛋白的多克隆抗体的SDS-PAGE的电泳图；图3B是采用PCT蛋白的多 克隆抗体检测不同浓度的PCT蛋白（3μ g，2. 25μ g，l. 5μ g，0. 75μ g)的Western Blot的 胶片图； 图4是检测Arml和Arm2是否偶联到PCT蛋白的多克隆抗体上的银染图； 图5 A是应用PLA方法检测不同浓度的降钙素原PCT (0ng/mL、0. 005ng/mL、0. 05ng/ 111]^、0.51^/1]1]^、51^/1]1]^、2〇1^/1]1]^、10〇1^/1]1]^、50〇1^/1]11^)的散点图；图513是检测10%血清中不 同浓度的降钙素原PCT的散点图。
【具体实施方式】
[0010] 下面将结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
[0011] 本发明首先请生物公司构建PCT蛋白的原核表达载体质粒--pET32PCT，转化大肠 杆菌构建表达菌株，利用该菌株诱导表达PCT蛋白，多点注射免疫绵羊，制备抗PCT蛋白的 羊多抗。合成邻位连接技术（PLA)所需要的偶联DNA、连接DNA、扩增引物及检测引物探针， 首先将上述制备的抗体偶联在磁珠（Dynabeads?M_270 Epoxy)上，并孵育抗原，以捕获抗 体、固定抗原。通过化学键将抗体与单链DNA偶联，用于识别抗原、检测抗原。再加入PCR 扩增所需的反应体系和引物，以及带荧光标记的检测引物，将蛋白的信号转换成DNA的信 号后级联放大。
[0012] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0013] 实施例1 :构建PCT蛋白原核表达载体及其表达、纯化： (1)通过生物公司合成得到PCT基因片段，并将其连接于载体PET32中，得到原核表达 质粒pET32PGT，其中 PCT基因片段的DNA序列为 SEQ ID N01: 5'-GCA CCA TTC CGT TCT GCC CTG GAG AGC TCT CCA GCA GAT CCG GCA ACA CTG AGT GAA GAC GAA GCG CTT CTG CTG GCT GCA CTG GTG CAG GAC TAT GTG CAG ATG AAG GCC AGT GAG CTG GAG CAG GAG CAA GAG CGT GAG GGT TCC AGC CTG GAT AGC CCA CGT TCT AAG CGT TGC GGT MT CTG AGT ACC TGC ATG CTG GGC ACC TAC ACG CAG GAC TTC AAC AAG TTC CAC ACG TTC CCA CAA ACT GCA ATC GGT GTT GGT GCA CCT GGT AAG AAG CGT ATG TCC AGC GAC CTG GAG CGT GAC CAT CGC CCT CAT GTT AGC ATG CCA CAG AAT GCC AAC-3' ；（2)将重组质粒通过化学转化法转化到BL21菌 株中，置37°C细菌培养箱培养12小时左右。挑取单克隆接种于5mL的LA培养基中37°C 220rpm振荡过夜培养；（3)接种lmL过夜菌种至300mL LA培养基中进行扩大培养，待0D_ 值达到0. 6-0. 8 (对数期）时加入IPTG诱导剂，终浓度为0. lmM，30°C，诱导4小时；（5)4°C 8000rpm离心15分钟，收集菌液，；（6)弃上清，用IDA0完全重悬；（7)用高压均质机将细 胞破碎，释放蛋白；（8)将蛋白液转移到50mL离心管中，4°C 8000rpm离心15min ;(9)将蛋 白液转移到新的50mL离心管中，用镍柱亲和层析纯化蛋白，加 lmL Ni2+-IDA珠子，4°C使蛋 白与珠子结合1小时；（10)为获得高纯度的蛋白，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液 (20mM，50mM)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液（100mM，250mM，500mM)将蛋白洗脱下来，最 终得到纯度为90%的降钙素原蛋白。图2是纯化获得的降钙素原蛋白的SDS-PAGE的电泳 图。
[0014] 实施例2 : PCT蛋白多克隆抗体制备及其效价测定： (1)选择健康没有免疫过的2. 5kg左右的绵羊，将上述方法制备的lmg PCT抗原与相 同体积的弗氏完全佐剂混匀并研磨后，通过皮下多点注射的方法对绵羊进行免疫；（2)初 次免疫3周后，再次取lmg PCT抗原与相同体积的弗氏不完全佐剂混匀，皮下多点注射；（3) 以后每两周加强免疫一次，共免疫6次。（4)免疫蛋白总量共9mg ; (4)最后一次免疫后五 天进行动脉取血交由生物公司提取纯化获得PCT蛋白的多克隆抗体，图3A是针对PCT蛋 白的多克隆抗体的SDS-PAGE的电泳图。用琼脂糖双扩法检测PCT的多克隆抗体的效价为 1:16-1:32。（ 5)得到公司提供的PCT蛋白的多克隆抗体后，进行SDS-PAGE电泳检测(如 图3A)。（6)验证制备的PCT蛋白的多克隆抗体是否能够特异性的检测到PCT蛋白，进行 Western Blot实验，实验结果如图3B所示。
[0015] 实施例3:合成PCT寡核苷酸链偶联抗体： (1)合成邻位连接技术（PLA)所需要的偶联DNA (Arml、Arm2)、连接DNA、扩增 引物及引物探针，取10 μ L 2 μ g/ μ L的PCT多克隆抗体，加入1 μ L 4mM的DBC0 (Dibenzylcyclooctyne)室温反应30分钟，使其N端添加 NHS基团；（2)加入1 μ L 1M Tris-HCl室温孵育5分钟以终止上述反应；（3)将修饰有NHS基团的PCT多克隆抗体分成两 份，分别与5'端修饰有叠氮基团的单链DNA片段Arml，即SEQ ID N0 :2: 5' -CGC ATC GCC CTT GGA CTA CGA CTG ACG AAC CGC TTT GCC TGA CTG ATC GCT AAA TCG TG-3,和 3,端 修饰有叠氮基团的单链 DNA 片段 Arm2 即 SEQ ID N03: 5'-TCG TGT CTA AAG TCC GTT ACC TTG ATT CCC CTA ACC CTC TTG AAA AAT TCG GCA TCG GTG A-3'，4°C孵育过夜，使 PCT 多 克隆抗体分别偶联其中一种单链DNA，并将其用PBS各自稀释至25 nM。（4)进行银染实验， 检测PCT蛋白的多克隆抗体是否偶联有DNA片段，如果偶联成功那么表现为在大小上有一 个迁移。
[0016] 实施例4 :应用邻位连接技术检测PCT蛋白含量 (1)取lyL 2mg/mL PCT多克隆抗体加入磁珠中，37°C旋转过夜，使其与磁珠偶联；（3) 次日，加入不同浓度的 PCT 蛋白（0ng/mL、0. 005ng/mL、0. 05ng/mL、0. 5ng/mL、5ng/mL、20ng/ mL、100ng/mL、500ng/mL)，进行抗原抗体特异性结合，使抗原-抗体-磁珠偶联在一起以起 到固定抗原的作用；（4)取实施例3中制备的Arml-多抗和Arm2-多抗2 μ L加入上述抗 原抗体反应溶液中，室温旋转孵育90min后，取5yL加入45yL PCR mix溶液中（ΙΟμΜ上 游引物 SEQ ID Ν04: 5' -CAT CGC CCT TGG ACT ACG Α-3' ；10μΜ 下游引物 SEQ ID NO 5 : 5' -GGG AAT CAA GGT AAC GGA CTT TAG-3' ； 10 μ M 引物探针 SEQ ID NO 6 :5, -FAM-TGA CGA ACC GCT TTG CCT GA-3,；连接 DNA 片段，即 SEQ ID NO 7 : 5' -TAC TTA GAC ACG ACA CGA TTT AGT TT-3,,0. 08mM ATP, 0. 002U/μ L UNG,0. 01U/yL T4 ligase, 0. 03U/μ L Taq polymerase);在连接酶作用下使得Arml-多抗和Arm2-多抗上的D N A尾部的游离5'端 和3'端与连接DNA片段的互补序列杂交，形成一个环状的蛋白质-单链D N A复合物，（6) 采用ABI PRISM 7700 PCR仪对复合物中的单链DNA部分进行实时荧光定量PC R扩增 检测。（6)分析结果显示，检测灵敏度低于0. 5 ng/mL，检测底线约为0. Ing/mL。
[0017] 实施例5 :添加10%的人血清模拟体内检测环境验证10%人血清是否会干扰PCT 蛋白的PLA检测 (1)于不同浓度的PCT抗原（0ng/mL、lng/mL、100ng/mL)中加入10%血清混勻，模拟不 同PCT含量的实际样本；（2)具体检测过程与实施例4 一致；（3)人为加入10%血清，模拟 体内检测环境，结果发现，这并不影响PLA方法对于降钙素原的检测，能够检测到不同浓度 的PCT，灵敏度和特异性与实验一致。
[0018] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
【权利要求】
1. 一种采用邻位连接技术检测降钙素原的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤： (1) 合成邻位连接技术所需要的偶联DNA--Arml和Arm2,其核苷酸序列分别为：SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3;连接反应所用连接DNA片段，其核苷酸序列为：SEQ ID N0:7;实 时荧光定量反应所需扩增引物及引物探针，其核苷酸序列分别为：SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 ; (2) 取含有降钙素原多克隆抗体的样本与DBCO试剂进行反应，使降钙素原多克隆抗体 的肽链N端添加 NHS基团；反应完成后，加入Tris-HCl以终止上述反应； (3) 将修饰有NHS基团的降钙素原多克隆抗体分成两份，分别与5'端修饰有叠氮基 团的单链DNA片段Arml，即SEQ ID NO :2和3'端修饰有叠氮基团的单链DNA片段Arm2即 SEQ ID NO :3进行孵育，使两份降钙素原多克隆抗体分别偶联其中一种单链DNA片段，构 成Arml-多抗和Arm2_多抗； (4) 取降钙素原多克隆抗体加入磁珠中进行偶联，之后加入降钙素原作为抗原进行抗 原抗体特异性结合，使抗原-抗体-磁珠偶联在一起以起到固定抗原的作用； (5) 取步骤（3)中制备好的Arml-多抗和Arm2-多抗加入上述抗原抗体反应溶液中， 旋转孵育后，以此反应溶液为模版，加入连接试剂、连接DNA片段，S卩：SEQ ID N0:7以及实 时荧光定量PCR扩增试剂，在连接酶作用下使得Arml-多抗和Arm2-多抗上的D N A尾部 游离的5'端和3'端与连接DNA片段的互补序列杂交，形成一个环状的蛋白质-单链D N A 复合物，采用实时荧光定量P C R扩增复合物中的单链DNA部分进行检测，其中实时荧 光定量PCR反应所用上游引物为SEQ ID N0:4,下游引物为：SEQ ID NO 5,引物探针为SEQ ID NO : 6。
2. 根据权利要求1所述的一种采用邻位连接技术检测降钙素原的方法，其特征在 于：步骤（4)中取降钙素原多克隆抗体加入磁珠中进行偶联，之后加入不同浓度的降钙素 蛋白抗原进行抗原抗体特异性结合，其中所加的不同浓度的降钙素蛋白分别为Ong/mL、 0· 005ng/mL、0. 05ng/mL、0. 5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL〇
3. 根据权利要求1所述的一种采用邻位连接技术检测降钙素原的方法，其特征在于： 步骤（4)中加入不同浓度的降|丐素抗原浓度分别0ng/mL、lng/mL、100ng/mL，且各自加入 10%血清混匀，模拟不同PCT含量的实际样本，用以验证血清对该检测方法的影响。
【文档编号】G01N33/68GK104267196SQ201410550348
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】万亚坤, 母亚雯, 谢浩 申请人:东南大学