细粒棘球绦虫谷氧还蛋白?1的应用
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体公开了细粒棘球绦虫谷氧还蛋白?1在制备检测细粒棘球蚴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用，其作为免疫抗原能够被自然感染细粒棘球蚴病的绵羊阳性血清识别，应用于间接ELISA检测时，具备较高的特异性和灵敏度，临床检测符合率高达97.9％。以细粒棘球绦虫谷氧还蛋白?1为免疫抗原建立的检测方法具有良好的诊断效果，可以用于疫区绵羊细粒棘球蚴病的初步筛选。
【专利说明】
细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1的应 用。
【背景技术】
[0002] 细粒棘球绦虫（Echinococcus granu 1 〇sus )属带科（Taeni idae )棘球属 (Echinococcus)，其中绦期幼虫寄生于动物和人的肝、肺及其他器官内所引起细粒棘球蝴 病，又称囊性包虫病，是一种人兽共患病，主要寄生在人和家畜等多种哺乳动物体内。90% 以上的细粒棘球蝴包囊生长于宿主的肝脏、肺脏或者同时生长于肝肺。细粒棘球蝴病呈世 界性分布，引起一系列的经济和公共卫生问题。在一些流行地区，其感染率可高达5-10%， 死亡率高达2-4 %。据估计，全球人囊性棘球蝴病每年至少损失1-3.6百万伤残调整生命年 (DALYs)，而动物囊性棘球蝴病每年造成的经济损失至少为20亿美元。因此，世界卫生组织 已经把棘球蝴病列为《被忽视的热带疾病》，作为其2008-2015年重点防治计划。
[0003] 目前，细粒棘球蝴病免疫诊断的研究主要集中在粗囊液抗原上，但是其成分复杂， 具有难以大量提纯、抗原来源不稳定、成本高、诊断特异性低等缺陷。缺乏标准有效的特异 性重组抗原是细粒棘球蝴病免疫诊断中的一个尚未解决的难题。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-l(Eg-Grxl)的应用， 使其能够能被自然感染细粒棘球蝴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原性，并具有 较高的特异性和灵敏度，减少与其他带科绦虫病阳性血清的交叉反应。
[0005] 谷氧还蛋白（glutaredoxin，Grx)，又称疏基转移酶（thioltmnsferase)，是疏基-二硫键氧化还原酶家族的重要组分。谷氧还蛋白家族与硫氧还蛋白家族一同维持着有机体 内氧化还原的平衡，是参与蛋白质的巯基氧化还原态调节的两个重要系统。Grx以GSH作为 直接电子供体，NADPH作为原始电子供体，调节细胞含巯基(主要由半胱氨酸提供)蛋白的氧 化还原状态，在细胞信号转导过程中发挥重要作用。
[0006] 目前，关于谷氧还蛋白的研究主要集中在锥虫和疟原虫上，疱原虫Grxl (Pf-Grxl) 被定位于细胞质内，具有HEDS活性和减少核糖核苷酸还原酶等特性。Tripathi等研究发现 Pf-Grxl能耐高温、耐变性剂以及耐PH变化的特点。Marquez等克隆表达出布氏锥虫的Grx蛋 白，发现其在寄生虫的氧化还原新陈代谢中发挥重要作用。但是，寄生虫上关于谷氧还蛋白 的报道比较少见。因此，本发明对细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-l(Eg-Grxl)进行了生物信息学 分析，并通过反转录表达出rEg-GrX1蛋白，制备出抗rEg-GrX1的多克隆抗体，对该蛋白进行 免疫印迹分析表明其可被自然感染细粒棘球蝴病的绵羊阳性血清识别，具有良好的免疫原 性，利用rEg-Grxl蛋白建立细粒棘球蝴病间接ELISA诊断方法，为细粒棘球蝴病的防控提供 监测手段。
[0007] 因此，本发明提出了细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1在制备检测细粒棘球蝴病的免疫 抗原和/或试剂盒中的应用。
[0008]其中，作为优选，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或免疫印迹检测试剂盒。
[0009]同时，本发明还提供了一种检测细粒棘球蝴病的ELISA检测试剂盒，包括细粒棘球 绦虫谷氧还蛋白_1(作为抗原进行包被)和ELISA检测试剂盒常规组分。所述试剂盒依据间 接ELISA检测原理。
[0010]作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分包括抗原包被液、酶标板、封闭液、HRP 标记的二抗和TMB底物。
[0011] 进一步优选地，所述封闭液为5 %脱脂奶粉;所述HRP标记的二抗为HRP标记的山羊 或绵羊抗兔二抗。
[0012] 在具体的ELISA检测过程中，抗原包被最佳条件是4°C过夜，抗原最佳浓度为1.6μ g/每孔，最佳血清稀释浓度为1:320，最佳封闭液和封闭条件是5%脱脂奶粉37°(：封闭111，血 清孵育最佳时间是37 °C 1.5h，二抗孵育最佳时间是37 °C lh，二抗最佳稀释浓度为1:3000时， 底物显色的最佳条件是37°(：151^11，在以上条件下，测得阴阳性血清的?/_直为3.04
[0013] 作为优选，所述ELISA检测试剂盒常规组分还包括显色反应终止液出3〇4、洗涤液 PBST和稀释液PBS。
[0014] 本发明先提取细粒棘球绦虫总RNA，而后进行反转录获得cDNA，根据GeneDB (http: //www · genedb · org/Homepage/Egranulosus)中公布的 Eg-Grxl (EgrG_0001248〇0)的 基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物扩增目的片段，然后进行测序验证，其与 GeneDB中Eg-Grxl(EgrG_000124800)的序列同源性达至丨」100%。最后连接至表达载体中，转 入大肠杆菌中表达，获得细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1的反转录重组蛋白rEg-Grxl。
[0015] 免疫印迹显示rEg-Grxl能被自然感染细粒棘球蝴病的绵羊阳性血清识别，具有良 好的免疫原性。间接ELISA结果显示，该方法的cut-off值为0.481，特异性和灵敏度分别为 64.3% (9/14)和1:3200，并且与绵羊脑包虫血清无交叉反应。
[0016] 由以上技术方案可知，本发明提供了细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1在制备检测细粒 棘球蝴病的免疫抗原和/或试剂盒中的应用，其作为免疫抗原能够被自然感染细粒棘球蝴 病的绵羊阳性血清识别，应用于间接ELISA检测时，具备较高的特异性和灵敏度，临床检测 符合率高达97.9%。以细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1为免疫抗原建立的检测方法具有良好的 诊断效果，可以用于疫区绵羊细粒棘球蝴病的初步筛选。
【附图说明】
[0017]图1所示为Eg-GrxlPCR扩增凝胶图；其中，Μ为DNA分子质量标准DL2000 ; 1为Eg-GrxlcDNA PCR产物;2为空白对照；
[0018]图2所示为rEg-Grxl的western blot凝胶图；其中，Μ为蛋白质标准品；1为重组菌 中rEg-Grxl的表达;2为纯化后的rEg-Grxl; 3为兔抗rEg-Grxl-IgG识别rEg-Grxl; 4为健康 兔血清识别rEg-Grxl; 5为自然感染细粒棘球蝴病的绵羊阳性血清识别rEg-Grxl;6为健康 绵羊血清识别rEg-Grxl; 7为兔抗rEg-Grxl-IgG识别原头蝴粗提蛋白；8为健康兔血清识别 原头蝴粗提蛋白；
[0019]图3所示为间接ELISA对rEg-Grxl的特异性分析图；其中，横坐标从左至右依次为 绵羊抗脑多头蝴阳性血清、山羊抗细颈囊尾蝴阳性血清、绵羊抗细粒棘球蝴阳性血清； Cut〇-〇ff value表不临界值；
[0020] 图4所示为间接ELISA的临床试验结果图；其中，横坐标从左至右依次为阳性血清 和阴性血清;Cuto-off value表示临界值。
【具体实施方式】
[0021] 本发明公开了细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1的应用，本领域技术人员可以借鉴本文 内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人 员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的应用进行 改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0022]在本发明【具体实施方式】中，各试验所涉及的材料和试剂如下：
[0023] 1、主要试剂
[0024]动物组织总RNA抽提试剂盒（TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)和反转录 试剂盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，购自GIBC0BRL公司；DNA Marker、Protein Marker、限制性内切酶（BamH I、Hind III、EcoRI、Xho I)、T4DNA连接酶， 购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、Ni-NTA Agarose，购自Qiagen公司；TaqPCR MasterMix、质粒小量抽提试剂盒、HRP-DAB底物显色试剂盒，购自北京天根生化科技有限公 司；HRP标记的羊抗兔I gG抗体，HRP标记的兔抗山羊I gG抗体，HRP标记的兔抗绵羊I gG抗体， FITC标记的羊抗兔IgG抗体购自武汉博士德生物有限公司；IPTG，弗氏完全佐剂和弗氏不完 全佐剂，购自Sigma公司；HiTrap Protein A HP，购自Bio-Rad公司，PCR引物合成和测序由 上海英俊生物工程有限公司完成;其它试剂均为国产分析纯。
[0025] 2、菌株和质粒载体
[0026] 宿主菌大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21(DE3)、pMD19_T Vector购自TaKaRa公司； pET32a( + )载体由四川农业大学动物寄生虫病实验室提供。
[0027] 3、常用缓冲溶液和培养基的配制
[0028] PBS Buffer①：分别称取下列试剂于烧杯中：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HP〇4 1.42g， KH2P〇4 0.27g。加入约500mL灭菌双蒸水混匀溶解，加入浓HC1使pH达到7.4，定容到1L。高压 灭囷后室温保存。
[0029] 电泳缓冲液（50XTAEBuffer):称取242gTris和37·2gNa2EDTA·2H20于烧杯中， 加入500mL灭菌双蒸水并混匀溶解，加58mL的CH 3C00H再次充分搅拌，定容到1L并室温保存。
[0030] EB:将O.lgEB加入100mL的灭菌双蒸水中，分装后常温保存。
[0031 ] LB培养基：液态培养基：分别称取Triptone 10g，5g Yeast Extract，10g NaCl加 入烧杯中溶于500mL灭菌H20中并用烧碱调节pH至7.0,定容到1L后高压灭菌，4°C保存。LB平 板:每1L溶液中加15g琼脂粉，高压灭菌，4 °C保存。
[0032] IPTG溶液：电子天平称取2g的异丙基硫代半乳糖苷溶于8mL超纯水中，充分搅拌溶 解后加水到10mL，用0.45μηι滤膜过滤后用EP管分装存于-20°C。
[0033] 30%聚丙稀酰胺溶液：称取0.88的13丨8-3(^713111丨(16和29.28的4(^713111丨(16，加入 50mL去离子水混匀溶解，加水到100mL，用0.22μηι滤膜过滤。
[0034] 1Μ Tris-HCl(pH 6.8):称取12.11g的Tris于烧杯中，加 80mL双蒸水充分搅拌溶 解，加浓盐酸并使用酸度计调整pH到6.8后加水到lOOmL，用0.22μηι滤膜过滤。
[0035] 1.5Μ Tris-HCl(pH 8.8):取19g的Tris于烧杯中，加50mL双蒸水充分搅拌溶解，加 浓盐酸并使用酸度计调整pH到8.8后加水到1 OOmL，4 °C保存。
[0036] 10%十二烷基硫酸钠(505)溶液:称取1(^的505于烧杯中，加入8011^双蒸水充分搅 拌溶解后定容至1〇〇11^，用0.45以111滤膜过滤后常温保存。
[0037] 10%过硫酸铵溶液:称取0. lg的APS，加水定容到lmL，常温保存。
[0038]考马斯亮蓝染色液：用电子天平称取0. lg考马斯亮蓝粉末于20mL酒精中，取lOOmL 浓磷酸到200mL，用0.45μηι滤膜过滤后常温保存。
[0039] 氨苄西林钠溶液(AMP):使用电子天平称取IgAmpicilin粉末，吸取9mL超纯水充分 搅拌溶解后定容至10mL，用0.22μπι微孔滤膜过滤除菌，分装EP管-20°C保存。
[0040] 4、试验动物
[00411 2只健康新西兰兔，1.4~2.2kg，购自四川农业大学试验动物中心。
[0042]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0043] 实施例1:细粒棘球蝴总RNA的提取
[0044] 细粒棘球绦虫的中绦期幼虫(细粒棘球蝴)包囊来自于自然感染的绵羊肝脏，样本 采自青海西宁或四川甘孜，液氮保存。
[0045] 取出液氮保存的细粒棘球蝴，用研钵将其磨碎，随后参照天根的动物组织RNA提取 试剂盒说明书提取总RNA。
[0046] (1)每10_20mg原头蝴加300yL裂解液，使用研磨棒研磨；
[0047] (2)向匀浆液中加入Proteinase K(10yL)和RNase-Free ddH20(590yL)，混匀后反 应 15min(56°C)。
[0048] (3)离心5min(12,000rpm)，将上清转移到干净的管子中；在管子中加入0.5倍上清 体积的无水乙醇，混勾后转入吸附柱中，离心lmin(12，OOOrpm)后弃废液。
[0049] (4)在吸附柱中加去蛋白质液RWl(350yL)，离心lmin(12,000rpm)后，弃废液。
[0050] (5)将DNase I工作液(80yL)加入吸附柱，室温放置反应15min;随后加去蛋白质液 RW1 (350yL)，离心lmin( 12，OOOrpm)后弃废液。
[0051 ] (6)500yL漂洗液RW加入吸附柱中，放置2min(室温），离心lmin(12,000rpm)后弃废 液。
[0052] (7)重复（6)。
[0053] (8)空离，弃废液，晾干残余漂洗液。
[0054] (9)把吸附柱放入一个新的离心管中，用RNase-Free ddH20(30-100yL)洗脱，静置 2min(室温），离心2min(12,000rpm)后得到细粒棘球蝴总RNA提取液。
[0055] 实施例2:第一链cDNA的合成
[0056]以抽提的细粒棘球蝴总RNA为模板，以Oligo dT(18)为反转录引物，参照Thermo公 司反转录试剂盒说明书进行操作：
[0057] (1)冰上制备反应混合物
[0058] Oligo dTis lyL
[0059] 模板 RNA lyL
[0060] DEPC ddH20 lyL
[0061 ] (2)在70°C(5min)孵育后转到冰上冷却
[0062] (3)在冰上按照顺序加入以下反应物：
[0063] 5reaction buffer 4yL
[0064] 核糖核酸酶抑制剂 1此
[0065] lOdNTP 混合物 2yL
[0066] (4)37°C(5min)孵育后加 RevertAid? 反转录酶 lyL。
[0067] (5)PCR 程序：42Γ，11ι;70-(：，10π?η。
[0068] (6)得到的。0嫩于_80。(：保存。
[0069] 实施例3:Eg_Grxl基因的扩增
[0070] 根据 GeneDB(http: //www · genedb · org/Homepage/Egranulosus)中公布的 Eg-Grxl (EgrG_000124800)的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物：
[0071] 上游：5 ' -CCGGAATTCATGTGGCGCTTTTTATC-3 ' 下划线为EcoR I
[0072] 下游：5 ' -CCGCTCGAGCTCTAAAAGTTCAGCAAGTG-3 ' 下划线Xho I
[0073] 扩增体系（25yL) :DNA模板各lyL，上下游引物各lyL，PCR Mixture 12.5yL，灭菌双 蒸水9.5yL。
[0074] 扩增条件:预变性:95°C5min; 38个循环(变性:95°C，40s;退火:54°C，45s;延伸：72 °(：，458);最后延伸：72°(：，1〇1^11。
[0075]以细粒棘球绦虫原头蝴的cDNA为模板扩增出一条351bp左右的条带（图1)。
[0076] 实施例4: PCR产物的回收
[0077]将含有目的条带的凝胶切下，放入EP管中，称重。采用凝胶DNA回收试剂盒回收目 的片段。每l〇〇mg凝胶加入400yLPC Buffer后，55°C水浴溶胶。待凝胶完全溶解后，移入吸附 柱中，离心60sec( 12000rpm)，随后加入Washing Buff er洗涤离心2次后，空离心2min (12000rpm)。瞭干吸附柱内乙醇气味，向吸附柱中加入30yL Elution Buff er，离心2min (12000rpm)，得到目的DNA片段。
[0078] 实施例5:Eg_Grxl基因克隆测序和比对
[0079] (1)将下列试剂混合：4yL的Solution 1，3 · 5yL的模板DNA，0 · 5yL的pMD19-T vector，放入离心机瞬离后放于16°C恒温水连接过夜。
[0080] (2)从-70°c出感受态细胞，室温融化后取30yL放入空EP管中，将连接过夜的8yL产 物加入EP管并用微量加样枪轻轻吹打混匀，立刻放入冰水混合物冰浴30min。42 °C水浴90s 立即冰浴5min。每个EP管中加入600yL的LB溶液，37 °C中180r/min培养1.5h。将混匀的溶液 倒在到LB平板上，37°C冷却lh使表面干燥，反倒平板过夜。
[0081 ] (3)挑取菌落到空EP管中，加入lmL LB溶液和lyLAMP溶液，160r/min震荡培养6h至 其浑浊。吸取lyL菌液扩增并将产物跑电泳后观察。选取电泳观察阳性的菌液送至英潍捷基 公司进行测序。
[0082]把测序得到的目的片段序列放入GeneDB数据库中比对，经测序得到的序列与 GeneDB 中 Eg-Grx 1 (EgrG_000124800)的序列同源性达到 100 %。
[0083] 实施例6:Eg_Grxl基因克隆、鉴定及转化 [0084] 1、质粒提取
[0085]测序结果比对正确后，将菌株扩大培养，参照天根生化有限公司的质粒小提试剂 盒操作说明进行：
[0086] (1)取3-5mL菌液，离心收集沉淀；
[0087] (2)加入悬浮液P1悬浮菌体，并加入裂解液P2对菌液进行裂解；
[0088] (3)加入P3产生沉淀，翻转混合，静置lOmin后离心15min(12,000rpm);
[0089] (4)取上清至收集管中，加600yL漂洗溶液PW，静置2min，离心lmin(12,000rpm)，弃 废液；
[0090] (5)重复(4);
[0091] (6)晾干漂洗液后用90yL洗脱液回收质粒。
[0092] 2、质粒酶切回收
[0093] 将提取的pMD19-T-Eg-Grxl用Takara EcoR I和Xho I快切酶双酶切，37°C酶切 12min，体系总体积为10yL:T克隆质粒8yL，10X QuickCut Green Buffer lyL，QuickBamH I 和Xho I 0.5yL。用微量加样枪混匀后瞬离，37°C恒温水浴15min后迅速取出点样进行1 %的 琼脂糖凝胶电泳并胶回收。
[0094] 3、目的片段连接表达载体
[0095] 将双酶切的Eg-Grxl目的片段和pET28a( + )载体22°C连接1.5h，随后连接产物转化 E.coli DH5a感受态细胞，并涂于氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上，37°C培养12h。挑取单 个菌落，进行PCR鉴定。
[0096] 4、pET28a-Eg-Grxl重组质粒双酶切鉴定
[0097]对重组质粒进行双酶切鉴定，方法参照"2、质粒酶切回收"。
[0098] 实施例7:重组Eg-Grxl在大肠杆菌中的表达 [0099] 1、重组蛋白的表达
[0100] (1)将测序正确的重组质粒pET28a( + )-Grxl转入BL21(DE3)表达菌。
[0101] (2)将表达菌接种于两瓶含100mL的新鲜的LB(含AMP 100yg/mL)培养液中，37°C摇 床培养3h(160r/min)，至菌液0D590为0.6后加入诱导剂IPTG(lmmol/L)，37°C诱导5h(160r/ min)，另一瓶不加 IPTG做对照培养。
[0102] (3)分别取有到过后的菌液1.5mL于两个新EP管中，4°C离心lmin(12,000r/min)收 集菌体，分别加入10yL 5XSDS上样Buffer和40yL PBS溶液，充分混匀。
[0103] (4)沸水煮1〇111；[11，以使菌体充分破裂，4<€离心10111；[11(12,0001'/111；[11)，取上清进行 SDS-PAGE0
[0104] (5)用考马斯亮蓝染色lh，脱色后观察表达情况。
[0105] 2、重组蛋白的可溶性分析
[0106]将含有重组质粒Pet28a-Eg-Grxl的表达菌接种于500mL含氨苄的液体培养基中， 37°C培养（170rpm)至0D600 = 0.6左右，加入最佳IPTG浓度，诱导6h。把菌液离心10min (8000rpm)，弃上清，沉淀用裂解液(20mM Tri s-Cl，pH8.0)悬浮，超声破碎菌体。将破碎后的 菌体裂解液在4°C条件下离心101^11(12,000印 111)，分离沉淀与上清;沉淀加入适量的81尿素 溶解。上清和沉淀各取40yL，分别加10yL 5XSDS凝胶上样缓冲液，煮沸lOmin，离心10min (12，OOOrpm)，进行SDS-PAGE电泳，分析rEg-Grx 1是否为可溶性表达。
[0107] 3、SDS-PAGE 电泳检测
[0108]按蛋白质电泳仪(Bio-Rad)说明书，组装电泳槽。配制12%的分离胶和5%的浓缩 胶;把凝胶垂直置于电泳缓冲液中，将样本和蛋白质Marker加入样品孔中；调节恒压为80V， 20min;随后调整电压为200V。电泳完毕后取出凝胶，用考马斯亮蓝染色lh，沸水浴脱色 15min，最后在凝胶成像系统中照相观察。
[0109] 4、重组蛋白的纯化
[0110] 根据上述步骤对重组菌诱导表达，获得大量重组蛋白菌液。
[0111] (1)取1，000mL菌液，离心10min(8,000rpm)，弃上清，收集菌体。
[0112] (2)在菌体中加入裂解液。
[0113] (3)超声波破碎，直到菌液澄清。
[0114] (4)离心 10min(12,000rpm)，留上清。
[0115] (5)取镍离子亲和层析柱，用Banding Buffer平衡5-10个床体积；
[0116] (6)将样品于0.22μπι滤膜过滤后上样；
[0117] (7)用Banding Buffer洗5-10个床体积；
[0118] (8)用含不同梯度的咪唑洗脱液进行洗脱，并收集各洗脱峰；
[0119] (9)用400mM咪唑洗脱液清洗后，用20%的乙醇洗涤至离子浓度为0,将柱子于4°C 保存。
[0120] (10)将蛋白用超滤管进行超滤和浓缩，多次加入PBS进行溶液的置换，以除去原有 的咪唑；
[0121] (11)蛋白浓缩后，进行SDS-PAGE检查，并以BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓 度。
[0122] 5、结果
[0123] Eg-Grxl片段成功连接在pET-28a载体上，转化进入BL21大肠杆菌中诱导表达。在 37°C条件下，用ImM IPTG诱导6h时表达量最大。表达的重组蛋白大小为19kDa左右，符合预 期大小。可溶性分析结果显示，rEg-Grxl表达为可溶性蛋白。纯化后的重组蛋白为单一条带 (图 2)。
[0124] 实施例8:免疫原性分析
[0125] 1、兔抗 rEg-Grxl-IgG 的制备
[0126] 将纯化后的rEg-Grxl蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按照1:1比例混 合制备乳剂苗。对两只新西兰兔进行皮下四次注射免疫，每次间隔两个周免疫一次，第一次 用弗氏完全佐剂和200yg重组蛋白皮下注射免疫，后三次均用弗氏不完全佐剂和200yg重组 蛋白皮下注射免疫。
[0127] 免疫结束后，使用HiTrap ProteinA lmL预装柱和HPLC纯化系统(Bio-Rad)纯化血 清，将流速调为1 .OmL/min，使用A2Buffer洗柱子lOmin。将0.45μηι NC膜过滤过的血清放入 柱子中，〇.5mL/min。用10-20ml的B Buffer洗脱，收集洗脱下来的IgG，并用50mM的Tris调节 洗脱下来的IgG溶液的PH。平衡后用20%的酒精洗涤柱子，直到离子浓度降为0。通过SDS-PAGE鉴定抗体纯化情况。
[0128] 2、免疫印迹
[0129] (1)按照上述方法制备蛋白质电泳凝胶，对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。
[0130] (2)蛋白质电泳结束后，取蛋白质所在的相应凝胶部位，放入转膜缓冲液中进行平 衡，共3次，每次4min。
[0131] (3)将硝酸纤维素滤膜(NC膜)和24层滤纸置于转移缓冲液中浸泡5min。
[0132] (4)按顺序将阴极电极板、24层滤纸、凝胶、NC膜、24层滤纸置于Bio-Rad半干式转 印槽内，盖上阳极电极板。
[0133] (5)将电转移装置接到电转仪上，并加入转移缓冲液35mA转移30min。
[0134] (6)转移结束后，取出NC膜，浸泡在3 % BSA的TBST中，4 °C封闭过夜。
[0135] (7)封闭结束后，剪开NC膜，阴性和阳性分开放置，加入1:1000稀释的一抗，室温孵 育2h后，倒掉一抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。
[0136] (8)将HRP标记的Goat-anti-sheep IgG按1:1000稀释后，加入NC膜，室温孵育2h 后，倒掉二抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。
[0137] (9)将NC膜置于平皿中，以新鲜底物显色液冲洗直至显色。
[0138] (10)显色后，用双蒸水冲洗NC膜终止显色，并对结果进行拍照记录。
[0139] 3、结果
[0140]免疫印迹显示，rEg-Grxl能被细粒棘球蝴病阳性绵羊血清识别，且为单一条带（图 2)，说明rEg-Grxl具有较好的免疫原性。以兔抗rEg-Grxl-IgG识别原头蝴粗蛋白提取液，显 示只有单一条带，大小与天然Eg-Grxl-致（13.2kDa)，说明表达的重组蛋白确实为rEg-Grxl 〇
[0141] 实施例9:间接ELISA方法的建立
[0142] 1、间接ELISA操作步骤
[0143] (1)以抗原包被液按比列稀释rEg-Grxl蛋白，每孔100yL加入96酶标板中进行包 被；
[0144] (2)倒掉包被液，拍干孔内液体，用PBST洗涤，重复四次；
[0145] (3)加入封闭液(5%的脱脂奶粉)封闭后，洗涤四次；
[0146] (4)用PBS按比例稀释血清后，加入酶标孔孵育，倒掉液体，洗涤四次；
[0147] (5)加入稀释好的HRP标记的山羊或绵羊抗兔二抗，孵育，洗涤四次；
[0148] (6)在避光条件下向孔中加入可溶性单组分底物TMB进行显色反应；
[0149] (7)在孔中加入100yL 2M H2S〇4终止反应，在紫外吸光度为450nm时测定其0D值。
[0150] (8)倒掉液体，拍干后，按(2)所示洗涤四次，每次3min;
[0151] (9)倒掉液体，拍干后，在避光条件下进行颜色反应，向孔中加入可溶性单组分底 物TMB，每孔100yL，室温孵育10~20min;
[0152] (10)再向孔中加入100yL 2M H2S〇4终止反应，立即将96孔板置于酶标仪上，在紫外 吸光度为450nm时测定其0D值。
[0153] 2、确定最佳条件
[0154] (1)用棋盘滴定法确定最佳抗原和血清稀释浓度，rEg-Grxl的蛋白浓度设为:0.2μ g/每孔，0.4yg/每孔，0.8yg/每孔，1.6yg/每孔，3.2yg/每孔，6.4yg/每孔，血清稀释比例：1: 20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，以阳性血清0D450接近1，P/N最大的条件作为最佳。
[0155] (2)二抗作用的最佳浓度和时间，分别设1:1000，1:2000，1: 3000，1:4000，1:5000 五个稀释浓度进行摸索。二抗作用时间设置为37°C0.5小时、1小时、1.5小时、2小时四个组， 以阳性血清〇D45Q接近1，P/N最大的条件作为最佳。
[0156] (3)抗原包被时间确定，用包被液稀释重组抗原，用最佳稀释浓度进行包被，包被 时间分别为37 °C lh、37 °C 2h及4 °C过夜3个组，以阳性血清0D45Q接近1，P/N最大的条件作为最 佳。
[0157] (4)封闭液以及封闭时间的确定，分别用1%BSA，3%BSA，5%BSA，1%脱脂牛奶， 3%脱脂牛奶，5%脱脂牛奶封闭。用最佳的封闭液分别封闭37°C1小时、2小时、3小时及4°C 过夜4个，以阳性血清OD45Q接近1，P/N最大的条件作为最佳。
[0158] (5)阴、阳性血清反应时间的确定，按照确定的条件来筛选阴、阳性血清的最佳孵 育时间，设为37 °C0.5小时、1小时、1.5小时、2小时4个组，以阳性血清0D45Q接近1，P/N最大的 浓度作为最佳。
[0159] (6)底物显色时间的确定，37 °C条件下设5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和 30分钟显色时间，测定0D45Q值，以阳性血清0D45Q接近1，P/N最大时间作为最佳。
[0160]间接ELI SA结果显示，P/N值达到最高的抗原包被的最佳条件是4 °C过夜，抗原最佳 浓度为1.6yg/每孔，血清最佳稀释浓度为1:320,最佳封闭液和封闭条件是5%脱脂奶粉37 °C封闭lh，血清孵育最佳时间是37 °C 1.5h，二抗孵育最佳时间是37 °C lh，二抗最佳稀释浓度 为1:3000时，底物显色的最佳条件是37°C 15min，在以上条件下，测得阴阳性血清的P/N值为 3.04〇
[0161] 3、临界值的确定
[0162] 在最佳条件下，测定24份绵羊细粒棘球蝴病阴性血清的0D45Q。设置三个重复。按照 临界值=平均值+3倍标准差计算。
[0163] 用24份绵羊阴性血清样品的0D45Q值确定临界值，通过统计学分析，计算出24份绵 羊阴性血清样品〇D 45Q值的平均值为0.296,标准差为0.0615。根据计算公式:临界值=阴性 样本0D45Q平均值+3倍标准差，得出临界值为0.481，即0〇45〇>0.481时，理论上可判定为阳性， OD45〇〈0.481可判定为阴性。
[0164] 4、批内重复性试验
[0165] 取同一批次包被的板子，检测5份已知为细粒棘球蝴病阳性的绵羊血清，每份设置 3个重复孔，按照已经建立的ELISA方法，进行批内重复试验，计算变异系数，检测该方法的 批内重复性。
[0166] 批内重复性试验结果显示，板内的变异系数在0.583%-2.014%之间，平均值为 1.191%〇
[0167] 5、批间重复性试验
[0168] 取3个批次包被的板子，在最佳条件下，检测3份细粒棘球蝴病阳性的绵羊血清，每 份设置3个重复孔，按照已经建立的ELISA方法，进行批间重复试验，计算变异系数，检测该 方法的批间重复性。
[0169] 批间重复性试验结果显示，板间变异系数在0.914%_1.558%之间，平均值为 1.153%〇
[0170] 6、特异性试验
[0171 ]用建立的间接ELI SA分别对山羊抗细颈囊尾蝴阳性血清、绵羊抗脑多头蝴血清进 行检测，检测其特异性。
[0172 ]用建立的间接ELI SA分别对绵羊抗脑多头蝴血清和山羊抗细颈囊尾蝴阳性血清进 行检测，结果显示只与一个绵羊脑包虫血清存在交叉反应，与四个山羊细颈囊尾蝴病血清 存在交叉反应(图3)，因此，其特异性为64.3% (9/14)。
[0173] 7、灵敏度试验
[0174]将3份阳性血清作倍比稀释，从1:100到1:201800，根据判定标准，确定其灵敏度。
[0175] 将3份阳性血清作倍比稀释，结果显示在稀释3200倍时，0D45Q平均值为0.567,仍属 于阳性，而在在稀释6400倍时，0D4 5Q平均值为0.392，小于临界值，因此，确定其灵敏度为1: 3200〇
[0176] 8、临床试验
[0177] 用建立的间接ELI SA方法分别对24份细粒棘球蝴病阴性绵羊血清和24分细粒棘球 蝴病阳性绵羊血清进行检测，根据临界值判断该方法的可靠性。
[0178] 用24份绵羊细粒棘球蝴病阳性血清和24份阴性血清对建立的间接ELI SA方法进行 临床检测（见表1和图4)，结果显示23份绵羊细粒棘球蝴病阳性血清的0D45Q均大于临界值， 24份阴性血清0D4 5Q均小于临界值，检测的符合率高达97.9%。
[0179] 表1临床血清样本OD450
[0180]
[0181]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 细粒棘球绦虫谷氧还蛋白-1在制备检测细粒棘球蝴病的免疫抗原和/或试剂盒中的 应用。2. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或免疫印迹 检测试剂盒。3. -种检测细粒棘球蝴病的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括细粒棘球绦虫谷氧还 蛋白-1和ELI SA检测试剂盒常规组分。4. 根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒常规组分包括抗原 包被液、酶标板、封闭液、HRP标记的二抗和TMB底物。5. 根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5 %脱脂奶粉。6. 根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述HRP标记的二抗为HRP标记的山羊或绵 羊抗兔二抗。7. 根据权利要求4-6任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒常规组 分还包括显色反应终止液h2s〇4、洗涤液tost和稀释液ros。
【文档编号】G01N33/68GK106093435SQ201610554270
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】杨光友, 宋星桔
【申请人】四川农业大学