专利名称：光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及菌类的应用，特别涉及光合细菌和枯草芽孢杆菌 在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用。
背景技术：
大菱鲆是原产于欧洲沿海的一种名贵比目鱼，其身体扁平近似圆形，双眼位于身 体左侧，有眼侧呈青褐色，有点状黑色素和少量皮刺，无眼侧光滑呈白色，背鳍与臀鳍无硬 刺，很长，头部及尾鳍均较小，身体中部肉厚，内脏团小。大菱鲆自然分布于大西洋东侧欧洲 沿岸，常见于北海和波罗地海。它具有适应低水温生活、生长速度快、肉质好、养殖和市场潜 力大等优点，相继成为欧洲各国开发的优良海水养殖鱼类之一。1992年被引进我国，现已 成为我国北方沿海重要的养殖品种。但是伴随着养殖范围的扩大和养殖密度的增加，致使 多宝鱼的病害问题日趋严重，给养殖业造成了巨大损失。其中“红嘴病”，主要危害50-150g 鱼种，主要症状表现为病鱼吻端及腹面上颂出血，部分鱼鳃盖有出血的溃烂小凹洞，口腔 内出血，部分病鱼眼睛肿大突出、挑破外膜内有大量脓液，肠道充血无食物，肠道末端有少 量粘稠液体，肝脏充血、色暗淡呈糜散状，脾脏肿大发红。在治疗过程中，养殖户为追求经济 效益，胡乱用药等现象时有发生，致使农药残留问题日趋严重。如何进行健康养殖，便成为 的水产界亟待解决的问题。光合细菌是一类光能自养或异养微生物，能以养殖水体中的有机物为碳源进行光 合作用，起到净化水质、抑制病原微生物生长繁殖和提高水产动物免疫力的作用。枯草芽抱杆菌是一种短杆状、无荚膜能运动的革兰氏阳性细菌，能产生中生芽抱， 为严格好氧。枯草芽抱杆菌的分布非常广泛，土壤、湖泊、海洋、动植物体表及其栖息地皆能 发现。是常用的益生菌之一，可分泌抗菌素抑制病原微生物的生长，无毒性，在水产中的应 用具有极大的潜力和优势。结合光合细菌和枯草芽孢杆菌两者的优势制成的混合菌液，可以达到有效防治红 嘴病，治愈率高达100%。克服了抗生素滥用带来的副作用及高频换水带来的高成本，提供 了一种安全、绿色、无公害的水产养殖模式。
发明内容
本发明的目的在于克服现有滥用抗生素治疗鱼病导致各种食品安全问题的不足 之处，提供一种光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用。本发明的目的通过以下技术方案实现光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用。所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液中光合细菌和枯草芽孢杆菌细菌数之比 为 1 1。
所述光合细菌为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，CGMCC 1.2193)、沼泽红 假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris, CGMCC 1.2352)或荚膜红细胞(Rhodobacter capsulatus, GIM1. 168)中的至少一种。所述枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis Cohn，GIM1. 136)。所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在大菱鲆养成中的应用是将光合细菌和 枯草芽孢杆菌混合菌液泼洒于水体中，使水体中光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液终浓度 为 10-107cfu/mL。所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在在大菱鲆养成中的应用是将饲料用浓 度为10-107CfU/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡15 45min。本发明利用光合 细菌和枯草芽孢杆菌抑制病原微生物生长繁殖，从而实现有效防治大菱鲆红嘴病的目的。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果1、本发明能有效防治大菱鲆的红嘴病。2、本发明所述菌剂在水产动物病害防治的应用中安全性好。利用光合细菌和枯草芽孢杆菌对病原菌的拮抗作用、利用水产养殖环境中的有机 物质、产生一些有利于水产动物生长的活性因子而达到防治病害的方法属于生物方法，从 而克服了药物滥用带来的副作用3、本发明所述的菌剂有效、环保、不产生病原菌抗性，应用前景良好。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1杀菌剂的制备(1)光合细菌菌液的制备浓度为109cfu/mL 的红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，CGMCC 1. 2193，购于中 国普通微生物菌种保藏管理中心)按培养基体积的0. 接种到优化RCVBN液体培养基中， 于30°C、光照强度为30001x下光照厌氧培养48h后得到的菌液按培养基体积的10%接种 入优化的RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48h，然后6000rpm离心15min获得菌体，往菌 体中加入无菌的磷酸盐缓冲液可得到浓度为IO12CfuAiL的光合细菌菌液。(2)枯草芽孢杆菌菌液的制备浓度为109cfu/mL 的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Cohn, GIM1. 136，购于广 东省微生物研究所)按培养基体积的0. 接种到营养肉汤培养基中，于37°C、250rpm摇 床活化培养18h，得到的菌液按培养基提及的10%接种入营养肉汤培养基中，置于37°C、 250rpm摇床培养24h，然后6000rpm离心15min获得菌体，往菌体中加入无菌的磷酸盐缓冲 液可得到浓度为IO12CfuAiL的光合细菌菌液。(3)将光合细菌浓缩液与枯草芽孢杆菌浓缩液按细菌数1 1混合。实施例2杀菌剂的应用1每个大菱鲆养殖水池大菱鲆5000尾(大菱鲆来源于山东省某鱼场)，大菱鲆均重 25 士 0. 5g，水温为 25 0C ο平均分A、B、C、D四个实验组，B、C、D每个实验组有4个小组，分别为Bi、Cl、Dl ； B2、C2、D2 ；B3、C3、D3 ；B4、C4、D4 ；每组2个重复。五组试验组的处理如下
A组工厂生产的养殖方式(对照组)。B组在水中泼洒光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，使水体中光合细菌和枯 草芽孢杆菌混合菌液浓度分别达到10、103、105、107cfU/mL，喂食普通饲料，每40天换全池 水一次后加菌。C组在水中投放经浓度为10、103、105、107Cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌的 混合菌液浸泡后的饲料，每40天换全池水一次。D组在水中加入光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，使水体中光合细菌和枯 草芽孢杆菌混合菌液浓度分别达到10、103、105、107cfU/mL，同时分别投放经浓度为10、103、 105、107CfU/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡后的饲料，每40天换全池水一次 后加菌。Bi、Cl、Dl投放的菌液浓度为10cfu/mLB2、C2、D2投放的菌液浓度为103cfu/mLB3、C3、D3投放的菌液浓度为105cfu/mLB4、C4、D4投放的菌液浓度为107cfu/mL所用饲料符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限 量》(NY5072-2002)的规定。试验结束测定大菱鲆患有红嘴病的数目。表一红嘴病患病率 由上表可看出，通过加入光合细菌和枯草芽孢杆菌菌液，可以预防大菱鲆换红嘴 病，最低浓度只要达到lOcfu/mL即可达到效果。从而为大菱鲆的养殖提供了一种绿色、安 全的养殖新方法。实施例3杀菌剂的应用2每个大菱鲆养殖水池患有红嘴病大菱鲆(病鱼吻端及腹面上颂出血)30尾，水温 为25°C，治疗时间8天。
平均分A、B、C、D、E五个实验组，C、D、E每个实验组有4个小组，分别为C1、D1、E1 ； C2、D2、E2 ；C3、D3、E3 ；C4、D4、E4 ；Cl、El ；C2、E2 ；C3、E3 ；C4、E4 每小组再分为 2 组，即 ClU C12......E41、E42，每组2个重复。五组试验组的处理如下A组工厂生产的养殖方式(对照组)。B组在水中泼洒抗生素(聚维酮碘，lmg/L-2mg/L)，喂食普通饲料。C组在水中泼洒光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，使水体中光合细菌和枯 草芽孢杆菌混合菌液浓度分别达到10、103、105、107cfU/mL，喂食普通饲料。D组在水中投放经浓度为10、103、105、107Cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌的 混合菌液浸泡后的饲料。E组在水中加入光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，使菌体浓度分别达到10、 103U05U07cfu/mL,同时分别投放经浓度为10、ΙΟ3、105、107cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢 杆菌混合菌液浸泡后的饲料。Cl、Dl、El投放的菌液浓度为10cfu/mLC2、D2、E2投放的菌液浓度为103cfu/mLC3、D3、E3投放的菌液浓度为105cfu/mLC4、D4、E4投放的菌液浓度为107cfu/mL所用饲料符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限 量》(NY5072-2002)的规定。所用鱼药符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用 药物使用准则》(NY 5071-2002)的规定。表二红嘴病鱼痊愈率(％ ) 由上表可看出，C、D、E组明显的要比A和B组效果要好，且无论是往水池里泼洒菌 液还是在饲料里面添加菌液，都可以达到痊愈率100%的治疗效果，且同时泼洒混合菌液和 喂食混合菌液浸泡过的饲料效果更好。光合细菌和枯草芽孢杆菌是通过拮抗作用，抑制病 原菌的生长。光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液在大菱鲆红嘴病的治疗上具有很大的利用价值和应用潜力。 本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实 质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明 的保护范围之内。
权利要求
光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用。
2.根据权利要求1所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴病 菌剂中的应用，其特征在于所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液中光合细菌和枯草芽 孢杆菌细菌数之比为1 1。
3.根据权利要求1所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴病 菌剂中的应用，其特征在于所述光合细菌为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，CGMCC 1. 2193)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris, CGMCC 1.2352)或荚膜红细胞 (Rhodobacter capsulatus, GIM1. 168)中的至少一种。
4.根据权利要求1所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴病 菌剂中的应用，其特征在于所述枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Cohn，GIM1. 136)。
5.根据权利要求1所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴病 菌剂中的应用，其特征在于所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在大菱鲆养成中的应 用是将光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液泼洒于水体中，使水体中光合细菌和枯草芽孢杆 菌混合菌液终浓度为10-107cfU/mL。
6.根据权利要求1所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴 病菌剂中的应用，其特征在于所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在在大菱鲆养成中 的应用是将饲料用浓度为IO-IO7CfuAiL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡15 45min。
全文摘要
本发明公开了一种光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用，其特征在于光合细菌培养液和枯草芽孢杆菌培养液按细菌数1∶1混合，光合细菌为红假单胞菌、沼泽红假单胞菌或荚膜红细胞中的至少一种，菌剂应用方法为向水体中泼洒杀菌剂，使水体中光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液终浓度为10-107cfu/mL，或者将饲料用光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡，混合菌液中光合细菌和枯草芽孢杆菌浓度为10-107cfu/mL。本发明所述的杀菌剂有效、环保、无公害，应用前景良好，对防止滥用抗生素也具有重要指导意义。
文档编号A01P1/00GK101919408SQ20101026843
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者肖小丽, 蔡俊鹏 申请人:华南理工大学