专利名称：一种大菱鲆育苗方法
技术领域：
本发明属于水产品养殖领域，涉及大菱鲆育苗方法。
背景技术：
大菱鲆(Scophthalmus maximus)英文名Turbot，原产于英国，主要分布于大西洋 东岸的北海、黑海西部及地中海沿岸。大菱鲆味鲜美，风味独特，是欧美重要的名贵养殖鱼 类。属鲽形目、鲆科、大菱鲆属。体扁平近似圆形，双眼位于身体的左侧。该鱼体中部肌肉 层较厚，内脏团较小，含肉率高。表皮、肌肉及鳞片中富含胶质。大菱鲆喜底栖，无眼的一侧 贴底生活。觅饵时跃起捕食，平时活动较少，性情温和。大菱鲆为冷水性鱼类，适于低温生 活，最佳生长水温为14-18°C。个体发育上，初期孵化的仔鱼全长为2-3mm，孵化后第2天开 口并摄食。随着养殖规模的不断扩大，各种病害发生的频率和规模也在不断增大，其中苗种 培育期间疾病造成的危害尤其严重。同时，由于设备简陋生产工艺不规范等，仔鱼的成活率 普遍较低，平均只有3% _5%，成活率过低，一方面造成单位水体出苗量少，同时增加了培 苗成本，带来了人力、财力和资源的巨大浪费。枯草芽孢杆菌抗逆性好、稳定性强及能有效抑制有害菌生长，能在水体中迅速繁 殖，并产生大量的胞外酶类，从而大量消耗池塘中的残饵和动物排泄物等大分子有机物。大 分子有机物被分解为小分子的有机酸、氨基酸等物质，能为水体中的生物提供营养，促进水 体养殖生物的生长，其在水产中的应用具有极大的潜力和优势。光合细菌营养非常丰富，不仅粗蛋白、氨基酸含量高，而且富含各种B族维生素、 辅酶Q、叶酸、生物素及其他未知的多种生物活性物质，还含有丰富的类胡萝卜素，是一种营 养价值高且营养成分较全的细菌，可明显促进养殖生物的生长、缩短养殖周期、提高鱼苗成 活率等。同时由于光合细菌有效地改善了养殖池的生态环境，如水质净化，有益微生物菌群 增多等，使得水产养殖病害减少，为养殖动物营造良好的生存环境。结合光合细菌和枯草芽孢杆菌两者的优势制成的混合菌液，既可以达到提高育苗 成活率、降低白化率、畸形率、促进鱼苗生长、提高鱼苗免疫力，还可以改善水质的功效。克 服了设备简陋及工艺简单带来的低成活率及高成本，提供了一种安全、绿色、无公害的水产 育苗新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有大菱鲆育苗技术的成活率低、成本高的不足之处，提
供一种大菱鲆育苗方法。本发明的目的通过以下技术方案实现一种大菱鲆育苗方法如下(1)亲鱼选择选择体形完整、色泽正常、健康活泼、体表光亮、体重在1. 5-2. Okg的 大菱鲆作为亲鱼；(2)亲鱼培养按雌雄(1 3) 1的比例，在亲鱼培育池中进行培育，培育池中加
3入光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液，使培育池中的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浓 度为10-107cfu/mL，投饲料前，将所用饲料要用浓度为10-107CfU/mL的光合细菌和枯草芽 孢杆菌混合菌液浸泡；(3)采卵、受精、孵化大菱鲆在达到性成熟后，分别采集卵子和精液，进行人工受 精，受精后，将受精卵移入孵化箱内进行孵化，获得初孵仔苗。(4)仔鱼培育将初孵仔鱼放入育苗池内进行培育，育苗池中加入光合细菌和枯草 芽孢杆菌混合菌液，使育苗池中光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浓度为10-107cfU/mL， 将所用饲料用浓度为IO-IO7CfuAiL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡，经过80-90 天的饲养，即可进入养成阶段。所述亲鱼培养过程中水温控制在19_20°C，光照调控在20001UX，光照时间每日 9-20小时，培育时间2 3个月。所述孵化温度为10 20°C进行孵化，经过2 3天的完成孵化。所述育苗池中初孵仔鱼的布池密度为2万粒/m3，水温为18 - 2 0°C，盐度为 26-28%。，pH 为 8. 0-8. 2，溶解氧 5. 0-7. Omg/L，充气量控制在 30 60L/h/m2。所述光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液中光合细菌和枯草芽孢杆菌细菌数之比 为 1 1。所述光合细菌为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，CGMCC 1.2193，购于中 国普通微生物菌种保藏管理中心)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris， CGMCC 1.2352，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心)或荚膜红细胞(Rhodobacter capsulatus, GIM1. 168，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心)中的至少一种，枯草芽孢 杆菌(Bacillus Subtilis Cohn，GIM1. 136，购于广东省微生物研究所)。本发明大菱鲆育苗方法利用光合细菌和枯草芽孢杆菌净化水质、抑制病原微生物 生长繁殖、提高水产动物免疫力及促进水产动物的生长，从而实现提高鱼苗的成活率、促进 大菱鲆生长等的目的。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果1、本发明中所述大菱鲆育苗方法在改善水质上有显著效果，能够有效降解氨氮等 有害物质，换水时间可延长至40天一次，大大节约了育苗成本。2、本发明能提高大菱鲆育苗的成活率、免疫力、生长速度及降低白化率、畸形率。3、本发明所述大菱鲆育苗方法在水产动物养殖的应用中安全性好。利用光合细菌和枯草芽孢杆菌对病原菌的拮抗作用、利用水产养殖环境中的有机 物质、产生一些有利于水产动物生长的活性因子而达到提高大菱鲆育苗成活率等的方法属 于生物方法，从而克服了设备简陋、低成活率所带来的高成本。4、本发明所述大菱鲆育苗方法有效、环保、不产生病原菌抗性，应用前景良好。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液(1)光合细菌菌液的制备浓度为109cfu/mL 的红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，CGMCC 1. 2193，购于中
4国普通微生物菌种保藏管理中心)按培养基体积的0. 接种到优化RCVBN液体培养基中， 于30°C、光照强度为30001x下光照厌氧培养48h后得到的菌液按培养基体积的10%接种 入优化的RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48h，然后6000rpm离心15min获得菌体，往菌 体中加入无菌的磷酸盐缓冲液可得到浓度为IO12CfuAiL的光合细菌菌液。(2)枯草芽孢杆菌菌液的制备浓度为109cfu/mL 的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis Cohn, GIM1. 136，购于广 东省微生物研究所)按培养基体积的0. 接种到营养肉汤培养基中，于37°C、250rpm摇 床活化培养18h，得到的菌液按培养基体积的10%接种入营养肉汤培养基中，置于37°C、 250rpm摇床培养24h，然后6000rpm离心15min获得菌体，往菌体中加入无菌的磷酸盐缓冲 液可得到浓度为IO12CfuAiL的光合细菌菌液。(3)将光合细菌浓缩液与枯草芽孢杆菌浓缩液按细菌数1 1混合。实施例2大菱鲆育苗实验具体实验步骤如下(1)亲鱼选择从山东省某鱼场2龄大菱鲆成鱼中选择体形完整、色泽正常、健康 活泼、体表光亮、生长速度快、体重在1. 5-2. Okg范围内的600条大菱鲆成鱼作为亲鱼。(2)亲鱼培养按雌雄(1 3) 1的比例，在亲鱼培育池中进行培育，培育池中 加入光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液，使培育池中的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液 浓度为10-107cfU/mL，投饲料前，将所用饲料要用分别用浓度为10、ΙΟ3、105、107cfu/mL的光 合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡；亲鱼按照雌雄2 1比例进行优选。亲鱼在35m2的培育池中进行强化培养，平均 4条/m2。培育池中的水先经过二级砂滤后，加入光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液，使混 合菌液浓度分别达到10、103、105、107cfU/mL。所用配合饲料中同时添加亲鱼性腺发育所必 须的卵磷脂和不饱和脂肪酸。投饵前，所用饲料用浓度为10、103、105、107CfU/mL的光合细 菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡，分批投饵，每日投喂3次。培育池中水温控制在19_20°C，光照调控在20001UX，光照时间由开始每日10小时 逐步增加到20小时，在合适的光照调控和营养强化培育条件下，加上光合细菌和枯草芽孢 杆菌混合菌液的作用，亲鱼性腺发育加快，经过2个月的温光调控，亲鱼即可达到成熟产精 产卵。光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液促进了亲鱼的营养吸收和快速生长，保证性腺 发育正常、培育出优良的受精卵。(3)采卵、受精、孵化大菱鲆在上述条件下培育至性成熟以后，将雌雄分开，分别采 集精液和卵子，人工受精。受精后，将沉浮卵分开，将孵卵(受精卵UOOOg移入孵化箱内进 行孵化。受精卵在14°c进行孵化，经过3天的时间完成孵化，获得初孵仔苗。(4)仔鱼培育将初孵仔鱼放入育苗池内进行培育，所用饲料分别用浓度为10、103、 105、IO7CfuAiL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡，育苗池中初孵仔鱼的布池密度为 2万粒/m3，苗种培育过程中的水温为18-20°C，盐度为27%。，pH为8. 0，溶解氧6. Omg/L，苗 种培育期间不断充气，前10天充气量控制在30L/h/m2，仔鱼开鳔后逐渐增加充气量至60L/ h/m2，育苗期间及时清除池底部的沉淀物及水表面的杂物，及时分苗。实验设置不同的换水 频率5天全池换水一次、10天全池换水一次、15天全池换水一次、20天全池换水一次、25 天全池换水一次、30天全池换水一次、35天全池换水一次、40天全池换水一次，每次换水后
5加光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，使水体中的菌体浓度达到10-107cfu/mL。加菌方 法为用相应的池水稀释菌液后，均勻泼洒全池，使菌液混合均勻。鱼苗经过80-90天的饲 养，即可进入养成阶段。投喂的饲料包括轮虫、卤虫无节幼虫、卤虫和颗粒饲料。19日龄投喂轮虫，投喂密 度为10个/mL，25日龄投喂卤虫无节幼虫，投喂密度为由开始的0.2个/mL逐渐增加到1 个/mL，35日龄投喂卤虫。要少投勤投，吃饱即可。投饵前，饵料分别用浓度为10、103、105、 IO7CfuAiL的光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液浸泡。按照上述育苗方法，平均分为A-D共4个试验组，B、C、D每个试验组有8个小组， 分别为 Bi、Cl、Dl ；B2、C2、D2 ；B3、C3、D3 ；B4、C4、D4 ；B5、C5、D5 ；B6、C6、D6 ；B7、C7、D7 ；B8、 C8、D8 ；B1-D8每小组再分为4组，即B11-B14…D81-D84，每组2个重复。对4组试验鱼初 始体重进行方差整齐性检验，组间差异不显著(P > 0. 05)。五组试验组的处理如下A组工厂生产的养殖方式(对照组)。B组在水中泼洒光合细菌和枯草芽孢杆菌混合体菌液，使水体中光合细菌和枯 草芽孢杆菌的混合菌液浓度分别达到10、103、105、107cfU/mL，喂食普通饲料。C组在水中投放经浓度为10、103、105、107Cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混 合菌液浸泡后的饲料。D组在水中加入光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌液，使菌体浓度达到分别达 到10、103、105、107cfu/mL，同时分别投放经浓度为10、ΙΟ3、105、107cfu/mL的光合细菌和枯草 芽孢杆菌混合菌液浸泡后的饲料。Bi、Cl、Dl组每5天全池换水一次，换水后重新加菌B2、C2、D2组每10天全池换水一次，换水后重新加菌B3、C3、D3组每15天全池换水一次，换水后重新加菌B4、C4、D4组每20天全池换水一次，换水后重新加菌B5、C5、D5组每25天全池换水一次，换水后重新加菌B6、C6、D6组每30天全池换水一次，换水后重新加菌B7、C7、D7组每35天全池换水一次，换水后重新加菌B8、C8、D8组每40天全池换水一次，换水后重新加菌B11、C11、D11...D81 投放的菌液浓度为 10cfu/mLB12、C12、D12…D82 投放的菌液浓度为 103cfu/mLB13、C13、D13…D83 投放的菌液浓度为 105cfu/mLB14、C14、D14... D84 投放的菌液浓度为 107cfu/mL所用饲料符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限 量》(NY5072-2002)的规定。试验结束测定养殖池的水质情况、鱼的生长指标及免疫指标。I水质检测水质检测包括氨态氮，亚硝酸盐氮，COD的检测。氨态氮用次溴酸纳氧化法法测定(GB12763. 4-91)；亚硝酸盐氮用重氮-偶氮光度 法测定(GB12763. 4-91) ；COD用碱性高锰酸钾法测定(HY003. 4-91)。表一水质的检测
表二水质的检测
表三水质的检测 表四生长水质的检测 表一至表四中的水质数据符合中华人民共和国海水水质标准(GB3097-1997)第 二类适用于水产养殖，与A组相比，B、C、D组的氨态氮、亚硝酸盐氮、COD都有不同程度的 降低。其中B、C、D组的氨态氮至少降低了 29. 23ug/L ；亚硝酸盐氮至少降低了 15. 19ug/L ； COD至少降低了 3.450mg/L。在水中或者是在饲料中添加浓度为10_107Cfu/mL光合细菌和 枯草芽孢杆菌的混合体菌液，全池换水时间5、10、15、20、25、30、35、40天一次，对氨态氮、 亚硝酸盐氮、COD影响不大，都能达到改善水质的目的。由此可见，无论在水中还是在饲料中添加浓度为10-107Cfu/mL的光合细菌和枯草 芽孢杆菌的混合液，能够达到提高鱼的免疫力、促进摄食和快速生长的目的，并且能够降解 氨氮、抑制水中的致病菌，从而达到改善水质，减少换水频率，全池换水时间可以延长至40
天一次，节省成本，提高经济效益，促进养殖业的快速发展。
II育苗的生长指标
育苗的生长指标包括大菱鲆仔鱼的成活率、白化率、田奇形率。
表五生长指标的检测
D5249.4713.859.41D6249.4713.869.41D7249.4613.869.43D8249.4513.949.53表七生长指标的检测组别仔鱼的成活率/%白化率/%畸形率/%B1343.6414.799.61B2343.6414.89.61B3343.6314.89.62B4343.6314.819.62B5343.6214.819.63B6343.6214.829.63B7343.6114.829.64B8343.6114.889.64C1346.6114.699.69C2346.614.79.7C3346.5914.719.71C4346.5814.719.71C5346.5714.719.72C6346.5614.739.73C7346.5514.749.74C8346.5414.749.76D1350.8313.329.43D2350.8313.339.44D3350.8213.349.45D4350.8113.359.46D5350.813.369.47D6350.7913.369.48D7350.7913.369.48D8350.7213.379.49表八生长指标的检测组别仔鱼的成活率/%白化率/%畸形率/%B1445.7714.299.4B2445.7714.39.4B3445.7614.39.41B4445.7614.319.41B5445.7514.319.42B6445.7514.329.42B7445.7414.329.43B8445.7414.389.43
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从表五至表八中可以看出，与A组相比，B、C、D组的仔鱼成活率有明显的提高， 白化率、畸形率都有明显的降低。其中B、C、D组的仔鱼成活率至少分别增加了 18.65%、 19. 9%,26. 08% ；白化率至少分别降低了 4. 93%,5. 19%,6. 71% ；畸形率至少分别降低了 6. 1%、6. 3%、6.9%。在水中或者是在饲料中添加浓度为10-107Cfu/mL光合细菌和枯草芽 孢杆菌的混合菌液，全池换水时间5、10、15、20、25、30、35、40天一次，对仔鱼成活率、白化 率、畸形率影响不大。因此，无论是在水中还是饲料中添加浓度为10-107Cfu/mL光合细菌和枯草芽孢杆 菌的混合菌液，全池换水时间长达40天一次都能提高育苗期间的仔鱼成活率、降低白化率 及畸形率。且D组效果最好。II免疫指标的检测免疫指标包括溶菌酶活力、酚氧化酶(PO)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力。1、溶菌酶活力测定 按Parry等所述方法进行。(Ellis A Ε. Lysozymeassays. [Μ]//Stolen J S, Fletcher T C, Anderson D P, et al. Techniques in FishImmunology I. USA :S0S Publications, 1990 :101_103.)将 5 μ 1 血清加入 3mL 浓度为 0. 2mg/mL 溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus) 菌液中，置722型分光光度计中(波长540nm)，分别在0. 5min和4. 5min后记录吸光值。 以Imin内吸光值下降0.001为一个活性单位(U)，计算公式为溶菌酶活力(U/mL)= 1000X (0D1-0D2)/4X5X0. 001。2、酚氧化酶(PO)活力的测定酚氧化酶活性测定采用Hern0ndez-L0pez 等(Hern0ndez-L0pez J, Gollas-Galvan Τ.Vargas-Albores F.Activation of the prophenoloxidase system of thebrown Penaeus californiensis Holmes [J ]. Comp Biochem Physiol, 1996. 113C 61-66.)的方 法。以实验条件下，每mL血清每min吸光增加0. 001，定义为1个酶活性单位(U)。
CN 101919360 A
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4 4 4 12 3
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444444444444 4 456781234567 8
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3、超氧化物歧化酶(SOD)活力超氧化物歧化酶(SOD)活力按邓碧玉等改进的连苯三酚自氧化法进行。(邓碧玉， 袁勤生，李文杰.改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法[J].生物化学与 生物物理进展，1991，18 (2) 163 163)活性单位定义为每mL血清中超氧化物歧化酶活力抑制率达到50%所对应的超氧 化物歧化酶量为1个酶活性单位。表九免疫指标 表十免疫指标 表十-一免疫指标
表十-二免疫指标
D84 61.47425.5527.94从表九至表十二中可以看出，与A组相比，B、C、D组的溶菌酶活力、超氧化物歧 化酶活力、酚氧化酶活力都有明显的提高。其中B、C、D组的溶菌酶活力至少分别增加 了 23. 38U/mL、34. 23U/mL、42. 84U/mL ；超氧化物歧化酶活力至少分别增加了 102. 51U/mL、 188. 53U/mL、213. 52U/mL ；酚氧化酶活力至少分别增加了 14. 13U/mL、18. 15U/mL、22. 73U/ mL。在水中或者是在饲料中添加浓度为IO-IO7CfuAiL光合细菌和枯草芽孢杆菌的混合菌 液，全池换水时间5、10、15、20、25、30、35、40天一次，对溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、 酚氧化酶活力影响不大，都能达到提高免疫力的目的。试验结果表明，B、C、D组的养殖方式能够达到提高育苗的成活率、免疫力、促进摄 食和快速生长等的目的，且D组效果最佳，育苗成活率高达52. 96%。即无论在水中还是 在饲料中添加浓度为IO-IO7CfuAiL光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液，全池换水时间长达 40天一次，都能够显著提高大菱鲆的育苗成活率、降低白化率、畸形率等生长指标，同时能 明显改善养殖池中的水质，在水中和饲料中同时添加，效果更佳。全池换水时间5、10、15、 20、25、30、35、40天一次，对育苗成活率、降低白化率、畸形率均无明显影响。上述实施例中的D组为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述 实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组 合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1权利要求
一种大菱鲆育苗方法，其特征在于包括以下步骤(1)亲鱼选择选择体重在1.5 2.0kg的大菱鲆作为亲鱼；(2)亲鱼培养按雌雄(1～3)∶1的比例，在亲鱼培育池中进行培育，培育池中加入光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液，使培育池中的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浓度为10 107cfu/mL，投饲料前，将所用饲料要用浓度为10 107cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡15～45min；(3)采卵、受精、孵化大菱鲆在达到性成熟后，分别采集卵子和精液，进行人工受精，受精后，将受精卵移入孵化箱内进行孵化，获得初孵仔苗；(4)仔鱼培育将初孵仔鱼放入育苗池内进行培育，育苗池中加入光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液，使育苗池中光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浓度为10 107cfu/mL，将所用饲料用浓度为10 107cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡15～45min，经过80 90天的饲养，即可进入养成阶段。
2.根据权利要求1所述一种大菱鲆育苗方法，其特征在于所述亲鱼培养过程中水温 控制在19-20°C，光照调控在20001UX，光照时间每日9_20小时，培育时间2 3个月。
3.根据权利要求1所述一种大菱鲆育苗方法，其特征在于所述孵化温度为10 20°C 进行孵化，经过2 3天的完成孵化。
4.根据权利要求1所述一种大菱鲆育苗方法，其特征在于所述育苗池中初孵仔鱼的 布池密度为2万粒/m3，水温为18-20°C，盐度为26-28%。，pH为8. 0-8. 2，溶解氧5. 0-7. Omg/ L,充气量控制在30 60L/h/m2。
5.根据权利要求1所述一种大菱鲆育苗方法，其特征在于光合细菌和枯草芽孢杆菌 混合菌液中光合细菌与枯草芽孢杆菌按细菌数11混合。
6.根据权利要求1所述一种大菱鲆育苗方法，其特征在于所述光合细菌为红假 单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，CGMCC 1· 2193)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris,CGMCC 1.2352)或荚膜红细胞(Rhodobacter capsulatus,GIM1. 168)中的至少 一种。
7.根据权利要求1所述一种大菱鲆育苗方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌 (Bacillus Subtilis Cohn，GIM1.136)。
全文摘要
本发明公开了一种大菱鲆育苗方法，包括亲鱼选择、亲鱼培养、采卵、受精、孵化、仔鱼培育，在亲鱼培养池及育苗池中加入光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液，使光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浓度为10-107cfu/mL，将所用饲料用浓度为10-107cfu/mL的光合细菌和枯草芽孢杆菌混合菌液浸泡。本方法所述大菱鲆育苗方法在改善水质上有显著效果，能够有效降解氨氮等有害物质，换水时间可延长至40天一次，大大节约了育苗成本，能提高大菱鲆育苗的成活率、免疫力、生长速度及降低白化率、畸形率，在水产动物养殖的应用中安全性好，环保、不产生病原菌抗性，应用前景良好。
文档编号A01K61/00GK101919360SQ201010268518
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者肖小丽, 蔡俊鹏 申请人:华南理工大学