专利名称：一种节能型大菱鲆养殖方法
技术领域：
本发明属于海水鱼类养殖技术领域，特别涉及一种提高大菱鲆免疫力，促进大 菱鲆快速生长、改善水质、节水节能、节省人力物力、绿色低碳的新型无公害的大菱鲆 养殖方法。
背景技术：
以“多宝鱼”命名的大菱鲆(Scophthamusrmximus)作为一种优质的冷水性海
水养殖品种，以其适应低水温生活、生长速度快、性格温顺、抗逆性强、适合高密度养 殖，兼有胶质丰富、肉质鲜美、口感独特、能提高人的免疫力等优良特性而深受广大养 殖户和市场的欢迎。目前已经作为名贵海产品进入大中城市的饭店、宾馆等。大菱鲆引入我国已有近十年时间，其中开展大规模的工厂化养殖也有5 6年时 间，实践证明该品种非常适合于我国北方沿海发展特种水产品养殖业，是当前北方沿海 为数不多的养殖良种。然而，随着养殖时间的延长和养殖规模的不断扩大，各种病害发 生的频率和规模在也不断扩大，大大增加了养殖户的生产成本，降低了收入，成为制约 养殖业可持续发展的瓶颈。“温室大棚+深井水养殖”是目前水产养殖最普遍的生产模式。这种养殖模式需 要大量的水循环，地下井水的过度开采使用，不仅浪费资源和能源，导致水资源枯竭， 还会严重影响地质概况，为地质灾害埋下隐患。大量的养殖废水排放，也造成海洋水体 的严重污染。病原体感染是引起大菱鲆死亡和生长缓慢的主要原因，有细菌、真菌、病毒、 支原体等。其中主要的致病或潜在致病菌是细菌，鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、 沙弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌等多种，死亡率可达50%以上。病菌的感染，严重的制 约着我国海产养殖业的发展。传统的抗生素和化学药物的使用，具有吸收快，疗效好的 优点，但会对大菱鲆产生刺激性，会引发新的炎症。同时长期使用抗生素会使致病或潜 在致病菌耐药菌株增加，一些常见的流行病难以彻底根治，反复发作。再有，抗生素残 留会影响鱼的品质，危害人的身体健康、危害生态环境、降低其商业价值，也同时也造 成养殖户的经济损失。用中草药防治细菌流行病具有无药物残留、致病或潜在致病菌不 会产生抗药性、经济效益高的优点，但有见效慢，生产效率较低的缺点。因此，促进大菱鲆快速生长、节水节能、节省人力物力、绿色低碳的新型无公 害养殖方式成为近年来国家的重大需求，引起水产界的广泛关注。目前，用蛭弧菌蛭质 体来提高大菱鲆的免疫力，促进大菱鲆快速生长的养殖方式在国内外尚未报道。已有的研究表明，作为一种有益微生物制剂，无论是在食品工业还是在(海洋) 水产养殖等领域，蛭弧菌的应用均是安全的。例如在国外，Lenz and Hespell(1978) 研究发现，蛭弧菌及对动物及人的细胞不具侵染性[Lenz R.W., Hespell R.B.Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives of Microbiology, 1978, 119(3) 245-248]。在国内，林茂等(2006)研究了蛭弧菌对鱼类细胞的作用，发现它对鱼类细菌没有侵染作用[林茂，杨先乐，薛晖，曹海鹏，邱军强。蛭弧菌BDH2102对鱼 类细胞及病原菌的作用。微生物学通报，2006，33(1) 7-11]。
发明内容
为克服上述现有养殖技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种节能型大 菱鲆养殖方法；该方法通过在饲料和水体中添加蛭弧菌蛭质体实现，具体包括养殖水源 选择，池水的处理，饲料的处理，换水周期的控制，其特征按照养殖生态学原理，海洋 生物的生长环境要求，生物之间的相互关系及无公害养殖标准，人工创造养殖环境，减 少投入成本，改善水质，提高大菱鲆免疫力，促进大菱鲆快速生长，提高经济效益。本发明的目的通过下述技术方案来实现一种节能型大菱鲆养殖方法，包括以 下操作步骤(1)取海域无污染的海水作为养殖用水；养殖用水经砂滤、沉淀后，注入养殖 池；在养殖池上方盖遮光布，控制光照强度为150 2001UX ；(2)在养殖池中加入蛭弧菌蛭质体菌液，并加大曝气，搅拌均勻，使池水中的蛭 弧菌蛭质体的起始浓度达10 107pfu/mL ；(3)向养殖池中投放鱼苗；(4)养殖期间正常曝气，控制水温在15 30°C，日投饵量为鱼体重的质量百分 数3 5 %，饵料在投入前用浓度为10 107pfo/mL蛭弧菌蛭质体菌液浸泡15 30min ； 每隔5 40天换掉池水(全池)一次，每次换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液，使池水中的 蛭弧菌蛭质体浓度达到10 107pfu/mL。所述的蛭弧菌蛭质体为蛭弧菌存在于宿主菌内的状态；步骤(1)所述养殖池的池底为凹型或平底，养殖池在注入养殖用水之前清洗消 毒干净；所述遮光布的遮光率为95%。步骤(2)和(4)所述加入蛭弧菌蛭质体菌液的方法为用养殖池中的池水稀释菌 液后，均勻泼洒全池。步骤(2)所述加大曝气的曝气量为90 100L/h/m3 ；步骤(4)所述正常曝气的 曝气量为70 80L/h/m3。步骤(3)所述投放鱼苗在水温15 30°C时按照以下标准鱼苗重量为25 50g 时，投放密度为300 400尾/m2 ；鱼苗重量为70 100g时，投放密度为200 300尾 /m2 ；鱼苗重量为100 200g时，投放密度为100 150尾/m2。温度升高时则减少养 殖密度。步骤(4)所述饵料为颗粒饵料；所述饵料在早上、中午和晚上各投放一次，每 次投饵间隔5 6小时，投饵方式为洒遍全池。步骤⑵和⑷所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05,所述蛭弧菌于 2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO M 209172。步骤⑵和⑷所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05,所述蛭弧菌于 2009年8月7日保藏于湖北省武汉市珞珈山武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏 编号为 CCTCCNO: M 209172。所述蛭弧菌BDFM05是由野生型蛭弧菌BDS02经紫外诱变得到；
所述紫外诱变依据申请号“2008100220488.3”，名称为“紫外诱导突变在增强 蛭弧菌裂解性能中的应用”的国家发明专利申请中的方法进行；所述蛭质体优选用DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵 母精提物O.lg，溶于lOOOrnL蒸馏水中，pH值为7.2 7.6)、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2 7.6的磷酸盐缓冲液悬浮；所述蛭弧菌蛭质体菌液按照以下方法制备得到接种嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172)于营养肉汤液体培养 基中，26 30°C培养20h，培养液经5000 8000rpm离心10 20min后，沉淀加入至 DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物O.lg，溶于lOOOrnL 蒸馏水中，pH值为7.2 7.6)中，接入蛭弧菌BDFM05，28°C培养36 48h，培养液经 6000 8000rpm离心15 20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清液，沉淀用DNB液体 培养基、水、生理盐水或0.2mOl/LpH值为7.2 7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到蛭弧菌 蛭质体菌液。所述DNB液体培养基是将营养肉汤0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物 O.lg溶于lOOOrnL蒸馏水中，调节pH值至7.2 7.6。本发明的优点及效果发展无公害养殖，提高大菱鲆的免疫力，促进大菱鲆的 快速生长，降低生产成本，提高经济效益，是我国海水养殖业发展的必有之路。蛭弧菌的生活史可分为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体状态和在 宿主细菌内生长发育的蛭质体状态。蛭弧菌游泳体侵入宿主时，在宿主细胞壁上产生一 个孔隙，当蛭弧菌侵入到宿主的周质空间后孔隙重新封闭。游泳体失去鞭毛，和宿主细 胞一起被称为“蛭质体”。与游泳体相比，蛭质体不仅具有制备、保存更为方便，环境耐受力强，作用时 间虽略慢但更久的特点，同时还具有潜在的灭活疫苗功能。当蛭弧菌游泳体入侵宿主细 胞后，宿主细胞的呼吸作用(respiration)很快被停止。蛭弧菌也进入蛭质体状态，开始分 泌多种酶，消解宿主细胞的大分子为小分子物质，进而整合为自身的营养物质，使自身 生长，变长。最终，长条状的蛭质体分成很多短的节段，长出鞭毛，重新成为游泳体。 之后，它们分泌必需的酶类，破壁而出，再次成为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳 的游泳体。在此蛭质体发育期间，蛭弧菌并不改变宿主细胞的表面结构，使原宿主仍具 有免疫原性，可刺激生物体，产生免疫应答反应。这一潜在功能使得应用蛭弧菌蛭质体 于大菱鲆的养殖中，可有效预防细菌病的产生，提高养殖成活率等。蛭弧菌能改善养殖生物肠道环境，提高免疫力，促进生长。现有的研究表明蛭 弧菌对鱼类无毒性作用，对人类无致病性。这些优点使得蛭质体同样适合作为抑止或清除生物体及其环境中潜在致病或潜 在致病菌的生物净化因子。蛭质体对水产致病或潜在致病菌，特别是海洋弧菌有强的 裂解力，对水质也有一定的净化作用，用蛭质体浸泡饲料，并在池水中泼洒一定浓度的 蛭质体菌液，最长可达40天不换水。既能促进大菱鲆的生长，提高免疫力，又能净化 水质，减少换水量，从而克服了抗生素滥用带来的副作用和对养殖废水进行处理的高成 本，为人类提供安全、绿色、无公害的水产品，提高养殖户的收入。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于 此。本发明的具体实施地点为山东省某养殖场，实施时间为8个月。试验地海域的水源水质符合中华人民共和国国家标准渔业水质标准 (GB11607-89)要求，海水经过砂滤、沉淀处理后进入养殖池，符合农业部《无公害食 品海水养殖用水水质》(NY5052-2001)要求。大菱鲆的养殖池建在养殖大棚内，每个 水池面积为40m2，水深1.2米，池底呈凹型，有利于排水吸污等操作，但平底的池子也 可。水池上方盖上遮光度为95%的遮光布，避免光照过强。光照强度一般控制在150 2001ux。挑选体质健康、个体大小均勻的大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼，平均体 重为28士2.5g，平均体长为11 士0.55cm，采用随机区组试验设计，按照300尾/m2的养殖 密度投入池中。平均分为A-D 4个试验组，B、C、D每个试验组有8个小组，分别为 Bl、CI、D1 ； B2、C2、D2 ； 、B3、C3、D3 ； B4、C4、D4 ； B5、C5、D5 ； B6、 C6、 D6 ； B7、 C7、 D7 ； B8、 C8、 B8 ； B1—D8 每小组再分为 4 组，艮P B1—1 B1—4... D8-1 D8-4，每组2个重复。试验的处理如下A组正常流水，投喂颗粒饲料(工厂生产的养殖方式)；B组在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭弧菌菌液浓度分别达到10、 103、105、107pfti/mL,投放颗粒饲料；C组投喂浓度为10、103、105、107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡后的颗粒 饲料；D组在水中加入蛭弧菌蛭质体菌液，使菌体浓度达到分别达到10、103、105、 107pfu/mL,同时分别投喂浓度为10、103、105、107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡后
的颗粒饲料；
B1、CUD1组每5天换(全池)水一-次，换水后重新加菌；
B2、C2、D2组每10天换(全池)水-一次，换水后]重新加菌
B3、C3、D3组每15天换(全池)水-一次，换水后]重新加菌
B4、C4、D4组每20天换(全池)水-一次，换水后]重新加菌
B5、C5、D5组每25天换(全池)水-一次，换水后]重新加菌
B6、C6、D6组每30天换(全池)水-一次，换水后]重新加菌
B7、C7、D7组每35天换(全池)水-一次，换水后]重新加菌
B8、C8、D8组每40天换(全池)水-一次，换水后]重新加菌
Bl-1、C1-1、D1-1-D8-1投放的菌液浓度为10pfo/mL ；Bl-2、C1-2、D1-2…D8-2 投放的菌液浓度为 103pfu/mL ；Bl-3、Cl-3、D1-3…D8-3 投放的菌液浓度为 105pfu/mL ；Bl-4、Cl-4、D1-4...D8-4 投放的菌液浓度为 107pfu/mL ；所用颗粒符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限 量》(NY5072-2002)的规定。试验期间，日投饵量与鱼体重的质量分数为3_5%，每日投 喂三次(7:00，12:00, 17:00),每次投喂过程持续30min。试验结束测量鱼的生长指标、免疫指标及水质情况。(1)、鱼体生长指标的测定方法如下每组随机抽取40尾鱼检测生长情况，鱼体长度测定采用精度为1mm的游标卡尺 度量，体长为鱼的吻端到脊椎骨最下端之间的距离。体重采用电子天平称量。试验生长 指标按如下公式计算成活率(％) = Nt/NoX100% ；增重率(％) = (WrW0)/WoX100% ；体长增长率(%) = (Lt-Lo)L/oX100% ；肥满度=W/L,或Wt/Le ；式中N。为试验开始时鱼体总尾数；Nt为试验结束时鱼体总尾数；W。为试验开 始时鱼体重；Wt为试验结束时鱼体重；L。为试验开始时鱼体长；Lt为试验结束时鱼体 长；试验测得的大菱鲆各项生长指标见表一 表四从表中可以看出，A组成活率、增重率、体长增长率、肥满度分别为80.28%、 1779%, 54.76%, 20.23，与A组相比，B、C、D组的成活率、增重率、体长增长率、肥 满度都有明显的提高。说明在常规的养殖方式下，不换水会影响大菱鲆的成活率、增重 率、体长增长率、肥满度。在相同的换水周期下，随着蛭弧菌浓度的升高，成活率、增 重率、体长增长率、肥满度都在逐渐升高，且都明显高于A组。B1-1 B8-1…D1-4 D8-4之间的成活率、增重率、体长增长率、肥满度无明显差异。说明在水中或者是在饲 料中添加浓度为10 107pfu/mL蛭弧菌蛭质体菌液，5-40天之间不换水，对成活率、增 重率、体长增长率、肥满度影响不大，都能达到促进摄食和生长的目的。因此，无论在水中还是饲料中添加浓度为10 107pfu/mL蛭弧菌蛭质体菌液， 长达40天不换水均可促进大菱鲆的摄食和快速生长，但两者同时添加(D组)，效果最 优。表一大菱鲆生长指标的检测
权利要求
1.一种节能型大菱鲆养殖方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)取海域无污染的海水作为养殖用水；养殖用水经砂滤和沉淀后，注入养殖池； 在养殖池上方盖遮光布，控制光照强度为150 2001UX ；(2)在养殖池中加入蛭弧菌蛭质体菌液，并加大曝气，搅拌均勻，使池水中的蛭弧菌 蛭质体的起始浓度达10 107pfu/mL ；(3)向养殖池中投放鱼苗；(4)养殖期间正常曝气，控制水温在15 30°C，日投饵量为鱼体重的质量百分数 3 5%，饵料在投入前用浓度为10 107pfo/mL蛭弧菌蛭质体菌液浸泡15 30min ； 每隔5 40天换掉池水一次，每次换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液，使池水中的蛭弧菌蛭 质体浓度达到10 107pfu/mL。
2.根据权利要求1所述的一种节能型大菱鲆养殖方法，其特征在于步骤(1)所述养殖池的池底为凹型或平底，养殖池在注入养殖用水之前清洗消毒干净； 所述遮光布的遮光率为95%。
3.根据权利要求1所述的一种节能型大菱鲆养殖方法，其特征在于步骤( 和(4) 所述加入蛭弧菌蛭质体菌液的方法为用养殖池中的池水稀释菌液后，均勻泼洒全池。
4.根据权利要求1所述的一种节能型大菱鲆养殖方法，其特征在于步骤( 所述加 大曝气的曝气量为90 100L/h/m3 ；步骤(4)所述正常曝气的曝气量为70 80L/h/m3。
5.根据权利要求1所述的一种节能型大菱鲆养殖方法，其特征在于步骤C3)所述投 放鱼苗在水温15 30°C时按照以下标准鱼苗重量为25 50g时，投放密度为300 400尾/m2;鱼苗重量为70 IOOg时，投放密度为200 300尾/m2 ；鱼苗重量为100 200g时，投放密度为100 150尾/m2。
6.根据权利要求1所述的一种节能型大菱鲆养殖方法，其特征在于步骤(4)所述饵 料为颗粒饵料；所述饵料在早上、中午和晚上各投放一次，每次投饵间隔为5 6小时， 投饵方式为洒遍全池。
7.根据权利要求1所述的一种节能型大菱鲆养殖方法，其特征在于步骤( 和(4) 所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05,所述蛭弧菌于2009年8月7日保藏于湖 北省武汉市珞珈山武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO : M 209172。
8.根据权利要求1所述的一种节能型大菱鲆养殖方法，其特征在于所述蛭弧菌蛭 质体菌液按照以下方法制备得到接种嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)于营养肉汤 液体培养基中，^ 30°C培养20h，培养液经5000 8000rpm离心10 20min后，沉淀 加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDFM05，培养36 48h，培养液经6000 8000rpm离心15 20η ι后，去除含蛭弧菌游泳体的上清液，沉淀用DNB液体培养基、 水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2 7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到蛭弧菌蛭质体菌 液。
9.根据权利要求8所述的一种节能型九孔鲍养殖方法，其特征在于所述DNB液体 培养基是将营养肉汤0.相、酪蛋白酸水解物0. 和酵母精提物O.lg溶于IOOOmL蒸馏水 中，调节pH值至7.2 7.6。
全文摘要
本发明公开了一种节能型大菱鲆养殖方法。该方法包括养殖水源选择，池水的处理，饲料的处理，换水周期的控制，按照养殖水体生态学原理，海洋生物的生长环境要求，生物之间的相互关系及无公害养殖标准，采用生物生态学的方法控制养殖环境。关键技术是在水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，同时饲料也用蛭弧菌蛭质体菌液浸泡，养殖期间可达到40天换掉池水一次。本发明为生物养殖方法，绿色、安全、无污染，效果显著，能够改善水质，促进大菱鲆摄食，提高免疫力，促进生长，并提高成活率，有极好的发展前景。对提高经济效益和食用安全性，保障人类健康具有十分重要的意义。
文档编号A01K61/00GK102017909SQ20101027101
公开日2011年4月20日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者何伟杰, 蔡俊鹏 申请人:华南理工大学