用于诊断和治疗癌症的涉及alk融合物的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于诊断和治疗癌症的涉及alk融合物的方法和组合物的制作方法
用于诊断和治疗癌症的涉及ALK融合物的方法和组合物本申请要求美国临时申请第61/178，937号的权益，其全部内容通过引用的方式并入本文。背景间变性淋巴瘤激酶(ALK)的突变被认为参与多种癌症亚群的发展，所述多种癌症包括i)非小细胞肺癌；ii)弥漫性大B细胞淋巴瘤；iii)食管鳞状细胞癌；iv)间变性大细胞淋巴瘤；ν)成神经细胞瘤(发育中的周围神经系统中出现的儿童期癌症)和vi)称为炎性成肌纤维细胞瘤(IMT)的肉瘤。患有许多这些恶性肿瘤的患者预后不良，部分归因于因为缺少有效的临床诊断方法而导致癌症的晚期检测。ALK介导的癌症的早期检测和诊断显著地增加了患者群中的存活率，作为一个实例，ALK阳性的间变性大细胞淋巴瘤的早期检测可产生高达83%的存活率而在某些情况下晚期检测则伴随着患者群仅50%的存活率。允许较早检测这些癌症的技术将大大促进对患有这些癌症的患者的医学管理，最终帮助改善他们的治疗结果。临床前和早期临床数据都表明仅有表达促进癌症发展和进展的活化ALK突变的那些癌症表现出对ALK小分子抑制剂的强烈的抗肿瘤响应。概要本文公开的方法和组合物涉及以下领域检测或诊断疾病或病况例如癌症的存在；评估对疾病或病况例如癌症的敏感性或风险；监测疾病例如癌症的疾病进展；以及确定对疾病例如癌症的治疗性处理的敏感性或抗性，其中所述疾病或病况是与ALK基因的核酸变异、截短或基因融合有关的癌症。应当理解并且本文所涵盖了本文公开的方法允许对罕见突变(即，数量低的核苷酸变异)的快速并且灵敏的检测以及对野生型基因的罕见截短和异常过表达的检测，所述罕见突变包括包含在过量正常DNA存在下的多肽融合物的突变。根据本发明的目的，如本文所具体表达和概括描述的，本发明，在一个方面，涉及通过检测目标核酸中的核苷酸变异来检测癌症的存在的方法，所述方法包括对从来自患有癌症的受治疗者的组织样本中提取的mRNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)；其中扩增产物的存在或扩增产物相对于对照的增加表明融合、核苷酸变异、截短或过量表达的存在，由此检测癌症的存在。具体而言，本发明，在一个方面，涉及通过检测如可在某些癌症中发生的一种或多种ALK相关融合物的存在和/或野生型ALK的上调表达的存在来检测癌症的存在的方法。所公开的方法和组合物的另外的优点将部分在下文的描述中阐明，并且部分将从所述描述来理解或可通过所公开的方法和组合物的实践来得知。所公开的方法和组合物的优点将通过在所附的权利要求中特别指出的元素和组合来实现和获得。应当理解的是上文一般描述和下文详细描述都仅是示例性的和说明性的而不像所要求那样限制本发明。附图简述并入并且构成本说明书的一部分的附图示例性说明所公开的方法和组合物的几个实施方案并且与描述一起用来解释所公开的方法和组合物的原理。

图1示出代表性的ALK融合蛋白，产生它们的染色体重排、它们在ALK阳性淋巴瘤和炎性成肌纤维细胞瘤(IMT)肉瘤中的存在以及它们的亚细胞定位。示出了更常见的致癌ALK 融合物的部分列表(未显示AL017-ALK、CARS-ALK, MYH9-ALK、SEC31L1-ALK、MSN-ALK和TFGxl-ALK)。C 细胞溶质；N 核；CM 细胞膜；NM 核膜；TPM3 原肌球蛋白_3 ；ATIC :5_氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶；CLTC 网格蛋白重链；IFG :TRK融合基因；TPM4 ；原肌球蛋白4 ；MSN 膜突蛋白；RanBP2 =Ran结合蛋白2 ；EML4 棘皮动物微管相关类蛋白4。图2示出用于检测ALK融合物的RT-PCR反应的正向和反向引物。图 3 示出野生型 ALK 和包括七种变体 EML4-ALK、NPM-ALK, MSN-ALK, CLTC-ALK,TPM-ALK和KIF5B-ALK的不同融合配偶体的大致的探针位置和断裂区。图4示出ALK融合靶标的RT-PCR扩增。图5示出经由RT-PCR的ALK融合物的检测以及扩增子的鉴定。图5A示出可获得来自受治疗者的样本并检测其ALK融合物(已知或之前未鉴定的)、野生型ALK、ALK激酶结构域的存在，以及用于测定间的归一化的反应对照(C0X5B)与阳性测定对照和阴性测定对照。图5B示出根据扩增子大小鉴定融合物或野生型的实例。详述在公开且描述本发明的化合物、组合物、物品、设备和/或方法之前，应当理解的是除非另外说明它们并不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法或者除非另外说明它们并不限于特定的试剂，因为这些当然可以变化。还应当理解的是本文所用的术语仅为了描述特定实施方案的目的而非意欲限制。如说明书和所附的权利要求中所用的，除非上下文另外清楚地指出，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指称对象。因此，例如，对“药物载体”的指称包括两种或更多种这样的载体的混合物等。范围可在本文中表示为从“约” 一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值和/或至所述另一个特定值。相似地，当值通过使用先行词“约”表示为近似值时，应当理解的是所述特定的值形成另一个实施方案。还应当理解的是每一个范围的终点都与其它终点显著相关并且不依赖于所述其它终点。还应当理解的是本文中有许多公开的值，并且除了所述值本身之外本文中每一个值同样公开为“约”那一特定值。例如，如果公开值“10”，那么也同样公开“约10”。如同本领域技术人员所适当理解的，还应当理解的是当公开一个值，那么也同样公开“小于或等于”所述值、“大或等于所述值”以及可能的值之间的范围。例如，如果公开值“10”，那么同样公开“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应当理解的是整个申请中数据以多种不同形式提供并且这些数据代表终点和起始点以及这些数据点的任何组合的范围。例如，如果公开特定数据点“10”和特定数据点15，那么应当理解的是大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及10和15之间都认为被公开。在本说明和随后的权利要求中，将作出对应当被定义具有下列含义的许多术语的参考。“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且描述包括其中所述事件或情况发生时的实例和其不发生时的实例。“增加”可指导致更大的量的组合物或化合物(例如扩增产物相对于对照)的任何变化。因此，例如，扩增产物的量的增加可包括但不限于10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70%、80%、90%或100%增加。本文还涵盖了检测DNA、mRNA或蛋白质相对于对照的表达或丰度上的增加必要地包括在DNA、mRNA或蛋白质在对照中不存在的情况下检测DNA、mRNA或蛋白质的存在。“获得(obtaining)组织样本”或“获得(obtain)组织样本”意指从受治疗者收集组织的样本或者在受治疗者中测量组织。应当理解的并且本文涵盖的是组织样本可通过本领域中已知的任何方法获得，包括侵入和非侵入的技术。还应当理解的是测量的方法可以是直接或间接的。获得或测量组织样本的方法的实例可包括但不限于组织活体检查、组织灌洗、抽吸、组织擦拭(tissue swab)、脊椎穿刺、磁共振成像(MRI)、计算机断层摄影(CT)扫描、正电子发射断层摄影(PET)扫描和X射线(使用或不使用造影剂)。使用现有技术很容易进行DNA中已知位点的突变的灵敏检测。可以设计等位基因特异性的引物以靶向在已知位置处的突变以便其信号可以比野生型DNA优先扩增。不幸的是，对可能在靶序列中任何位置(碱基)发生的未知突变来说这是不可能的。检测ALK相关癌症的方法在一个方面所公开的方法涉及在受治疗者中检测或诊断疾病或病况例如癌症的存在，评估对疾病或病况例如癌症的敏感性或风险，监测疾病或病况例如癌症的进展以及确定对疾病或病况例如癌症的治疗性处理的敏感性或抗性的方法，所述方法包括检测来自所述受治疗者的组织样本的mRNA的存在或测量来自所述受治疗者的组织样本的mRNA的表达水平，其中扩增产物的量相对于对照增加表明癌症的存在，并且其中所述癌症与ALK的核酸变异、截短或基因融合有关。间变性淋巴瘤激酶(ALK)ALK基因编码称为ALK的受体酪氨酸激酶(RTK) (SEQ ID N0:1)(基因库登录号TO2540(人编码序列))并且主要在中枢神经系统和周围神经系统中正常表达。1620aa的ALK多肽包含1030aa的细胞外结构域，其包含^aa的氨基端信号肽序列和位于残基391和401之间的结合位点。此外，ALK多肽包含激酶结构域(残基1116-1383)，其包含活化环中位于残基1278、1282和1283的负责自磷酸化的三个酪氨酸。已经显示ALK突变组成性地活化ALK蛋白的激酶催化功能，而失调的突变ALK转而活化促进异常细胞增殖的通路中下游细胞信号蛋白。事实上，导致失调的ALK激酶活性的突变与几种类型的癌症有关。ALK融合物代表这一酪氨酸激酶的最常见的突变。这些融合物包括但不限于核磷蛋白-ALK(NPM-ALK)、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC-ALK)、网格蛋白重链-ALK(CLTC-ALK)、驱动蛋白 _1 重链基因-ALK(KIF5B-ALK)、Ran结合蛋白 2-ALK (RANBP2-ALK)、SEC31L1-ALK、原肌球蛋白 3-ALK (TPM3-ALK)、原肌球蛋白4-ALK (TPM4-ALK)、TRK 融合基因(大)-ALK (TFGl-ALK)、TRK 融合基因(小)-ALK (TFGs-ALK)、CARS-ALK、EML4-ALK、5-氨基咪唑_4_甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶-ALK (ATIC-ALK)、AL017-ALK、膜突蛋白-ALK(MSN-ALK)、非肌肉肌球蛋白重链基因-ALK(MYH9-ALK)和TRK-融合基因(特大)-ALK (TFGXl_ALK)。已经在IMT中鉴定了六种ALK 融合物，CARS-ALK、CLTC-ALK, RANBP2-ALK、SEC31L1-ALK、TPM3-ALK 禾Π TPM4-ALK。已经在典型T细胞或裸细胞淋巴瘤和IMT肉瘤中检测到TPM3-ALK、TPM4-ALK和CLTC-ALK融合物，而 IMT 中存在 CARS-ALK、RANBP2-ALK 和 SEC31L1-ALK。CLTC-ALK 和 NPM-ALK 也存在于B细胞浆母细胞淋巴瘤/免疫母细胞淋巴瘤中。TPM4-ALK融合物存在于食管鳞状细胞癌，而在非小细胞肺癌中发现ALK融合物EML4-ALK、IFG-ALK和KIF5B-ALK。最近同样也在结肠直肠癌和乳腺癌中都鉴定了 EML4-ALK。因此，在一个方面，本文公开了检测ALK相关的融合存在的方法，所述方法包括检测与来自受治疗者的组织样本的ALK融合有关的核酸的存在或测量与来自受治疗者的组织样本的ALK融合有关的核酸的量，其中所述核酸的存在或者所述核酸相对于对照的增加表明ALK融合的存在。ALK融合与几种已知的癌症类型相关。应当理解的是一种或多种ALK融合物可与特定的癌症相关。还应当理解的是存在与ALK融合有关的几种类型的癌症，包括但不限于间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、恶性组织细胞增生症和成胶质细胞瘤。ALCL0间变性大细胞淋巴瘤构成所有NHL的约2. 5% ；特别在儿科年龄组中，所有NHL的约13% (所有儿童期大细胞淋巴瘤的30-40%)是这一类型的。ALCL患者的研究目前将这一 NHL分为ALK阳性和ALK阴性亚群；所有ALCL的约60%由ALK融合导致。因为不清楚的原因，基于CHOP的多试剂常规化学治疗之后ALK阳性ALCL患者进展明显比患有ALK阴性疾病的那些好(分别具有约75%对约35%的总的5年存活率)。然而，化学治疗之后超过三分之一的患者经历多重复发。因此，ALK阳性的ALCL的5年无疾病的存活率仅为约40%。ALK+弥漫性大B细胞淋巴瘤。在2003年，显示ALK融合以NHL的非ALCL形式存在，其中描述在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的CLTC-ALK或NPM-ALK (ALK+DLBCL)。与它们的B谱系一致，这些NHL表达细胞质IgA和浆细胞标记并且具有免疫母细胞的形态。翻译的探索研究揭示了这些淋巴瘤中的大部分中的t O ；17)和CLTC-ALK mRNA，而免疫标记证实粒状的ALK染色与在CLTC-ALK阳性ALCL中观察到的相同。就所有其它的ALK融合配偶体蛋白而言，CLTC-ALK的CLTC部分中的自缔合序介导组成型的自缔合和融合激酶的活化以推动淋巴瘤生成。ALK+DLBCL主要在成人中发生，然而儿科淋巴瘤中的W2 ；5)和NPM-ALK mRNA与CLTC-ALK阳性的成人B-NHL表型相同。所有DLBCL的约0. 5_1 %被认为是ALK阳性的。由突变的ALK导致的DLBCL的鉴定是重要的，因为在基于CHOP的治疗之后，患有这些淋巴瘤的患者的结果比ALK阴性的DLBCL患者差得多；因此，ALK+DLBCL患者应当被主要考虑为靶向ALK的激酶抑制剂治疗的候选者。ALK+全身性组织细胞增生症。2008年描述了另一种造血组织肿瘤(全身性组织细胞增生症)中的ALK融合。早期婴儿期中存在的组织细胞增生症的这种之前未表征的形式的三个病例显示ALK免疫活性并且一个病例的分子分析表达TPM3-ALK。除了前面提到的其中组成型活化的ALK融合物在许多病例中已经显示为成因机制的血液恶性肿瘤之外，在某些情况下，不同的实体肿瘤(非常常见的人类肿瘤例如非小细胞肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌)的亚群的发生最近已经被证实归因于异常活化的ALK。炎性成肌纤维细胞瘤。发现表达ALK融合物的第一种非造血组织肿瘤是被称为炎性成肌纤维细胞瘤(IMT)的肉瘤，其为儿童和年轻成人(诊断时的平均年龄约10岁)的软组织和内脏中纺锤形细胞的增殖。许多IMT是无痛的并且可通过切除治愈，然而，局部复发、侵染和转移的IMT并不是罕见的并且现有的化学和放射治疗是完全无效的。本文公开了 IMT中染色体2p23 (ALK基因的位置)的参与以及ALK基因重排。11例IMT中7例已经显示ALK免疫反应性并且在几个病例中鉴定了 TPM3-ALK和TPM4-ALK。此外，在IMT、CLTC_和RanBP2-ALK中鉴定了两种另外的ALK融合物。已经在73例IMT中通过免疫染色检查ALK融合物，发现60% (73例病例中的44例)为ALK阳性。因此，ALK失调在大多数IMT中具
有致病重要性。非小细胞肺癌。ALK融合在癌症中的作用随着75例日本非小细胞肺癌患者中的5例(6.7%)中新型EML4-ALK嵌合蛋白的描述而进一步扩大。之后不久，肺癌中ALK融合的存在被不同的小组证实，所述小组发现137例中国肺癌患者中的6例(4. 4% )表达ALK融合物(EML4-ALK，3名患者；TFG-ALK，1名患者；X-ALK)。两个共同的主题已经出现_1)ALK融合物主要在患有腺癌的患者中存在(尽管观察到偶尔的鳞状或混合的组织学结构的ALK阳性NSCLC)，主要在具有极少的或没有吸烟史的个体中，和WALK异常通常发生不包括其它常见的基因异常(例如，EGFR和KRAS突变)。由ALK融合导致的NSCLC的确切百分比还不清楚但是基于生物医学文献中的报道的估计表明由ALK融合导致的NSCLC的百分比为约5-10%的范围。食管鳞状细胞癌。在45名伊朗患者中，蛋白质组学途径鉴定了在食管鳞状细胞癌(ESCC)中不足和过度表现的蛋白质；TPM4-ALK在过度表现的那些蛋白质中。第二个基于蛋白质组的ESCC研究-在这一实例中，在中国患者中-同样在这些肿瘤中鉴定了 TPM4-ALK。结肠直肠癌、乳腺癌。测量了三种人肿瘤类型-结肠直肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌中EML4-ALK融合物的存在(在这一研究中没有评估其它的ALK突变)。除了确认NSCLC中EML4-ALK的表达(所研究的106个样本中的12个中，11. 3% )之外，乳腺癌(209例病例中的5例，2. 4% )和结肠直肠癌(83例病例中的2例，2. 4% )亚群是EML4-ALK阳性的。除了已知的EML4-ALK变体1(E13 ；A20)和2 (E20 ；A20)之外，在结肠直肠癌中发现了新型的变体(E21 ；A20)。家族和单发成神经细胞瘤中的ALK。成神经细胞瘤是最常见的儿童期颅外实体瘤并且来源于发育中的神经嵴。成神经细胞瘤的一个小亚群(约1-2% )表现出伴随常染色体显性遗传的家族素因。大多数成神经细胞瘤患者患有尽管加强的化学和放射治疗但存活几率仍< 40%的攻击性疾病，并且所述疾病占所有儿童期癌总死亡数的约15%。ALK之前已经被发现是同样由于高水平过表达而被组成型活化，该高水平过表达是少量的成神经细胞瘤细胞系中基因扩增的结果，事实上，ALK扩增在除了活化的点突变之外的约15%的成神经细胞瘤中发生。ALK中的这些错义突变已经被证实为推动成神经细胞瘤生长的活化的突变；此外，成神经细胞瘤细胞系与ALK小分子抑制剂一起孵育揭示这些细胞伴随ALK活化(但不是具有野生型ALK的正常水平表达的细胞系)表现出强烈的细胞毒素响应。最近的研究证明用小分子药物候选物抑制ALK的这些突变形式消除了这种异常的细胞增殖并且促进了成神经细胞瘤和其它ALK来源的肿瘤细胞系中的细胞凋亡。这些发现强调了对用于ALK突变的专门诊断测试-一种具有多种临床应用的测试-的需要。例如，这样的测定可被用来筛选受到遗传性成神经细胞瘤侵袭的家族的中的儿童以帮助促进在他们更易于治疗的较早的时期检测肿瘤。ALK介导的癌症的早期检测和诊断显著增加患者群中的存活率。因此，在本文一个方面公开了检测或诊断疾病或病况例如癌症诸如间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的存在的方法，所述方法包括检测与来自受治疗者的组织样本的核酸变异、截短或ALK融合有关的DNA、cDNA的存在或测量与来自受治疗者的组织样本的核酸突变、截短或ALK融合有关的DNA、cDNA的水平或mRNA的表达水平；其中扩增产物的量相对于对照增加表明ALK相关癌症的存在。同样公开了评估对疾病或病况的敏感性或风险、监测疾病进展或确定对与受治疗者中的核酸变异、截短或ALK融合有关的癌症的治疗性处理的敏感性或抗性的方法，所述方法包括检测来自受治疗者的组织样本的DNA、cDNA的存在或测量来自受治疗者的组织样本的DNA、cDNA的水平或mRNA的表达水平；其中扩增产物的量相对于对照增加表明ALK相关癌症的存在。因此，在一个方面，ALK融合序列的检测表明癌症的存在。因此，本文公开了诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的方法，所述方法包括检测来自所述受治疗者的组织样本的mRNA的存在或测量来自所述受治疗者的组织样本的mRNA的表达水平；其中mRNA对ALK融合是特异的；并且其中mRNA的量相对于对照增加表明ALK相关癌症的存在。ALK融合相关癌症可用ALK激酶抑制剂来治疗。然而，已经发现了 ALK激酶抑制剂抗性的癌症。这些癌症是家族和单发癌症(例如成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、恶性组织细胞增生症和成胶质细胞瘤)中还包含ALK的点突变的ALK融合。ALK中的突变导致ALK的组成性活化。相应地，ALK相关癌症由这些活化的点突变推动。酪氨酸激酶催化结构域机1661 、41168 、111711 117414117札、1 1192卩、F1245C、F1245V、F1245L、F1245I、I1250T和R1275Q中的突变和细胞外结构域中位于V476A的突变与成神经细胞瘤相关。在结肠直肠癌中鉴定了位于R401Q、A1168P和V757M的突变。相应地，鉴定了乳腺癌中位于L560F的突变，卵巢癌中位于A877S的突变。因此，在一个方面，检测癌症的存在是通过检测ALK序列中的点突变来完成的(即，通过检测点突变，鉴定ALK相关癌症)。因此，本文公开了检测ALK相关癌症的存在的方法，其中所述癌症还包含ALK中的一个或多个点突变或野生型ALK上调。所公开的ALK融合还可导致野生型ALK的失调。失调的野生型ALK可导致所产生的野生型ALK的增加以及激酶催化活性的失调。可选择地，癌症可具有来自另一种受体酪氨酸激酶(RTK)(例如cMET或IGFR)的初级分子病理学，但是通过经由ALK的信号转导通路的平行路径活化发展出对抑制剂的抗性。因此，检测癌症的存在的另一种方法是通过检测野生型ALK表达的增加。另外，缺失调节区的截短的野生型ALK基因可导致组成型ALK激酶催化功能。因此，本文公开了诊断癌症的存在的方法，所述方法包括检测与截短的ALK序列有关的mRNA的存在或mRNA表达的相对增加。应当理解的并且本文涵盖的是ALK相关癌症的原因可不仅归因于野生型ALK的失调或已知的ALK融合物，而且还有一种或多种未鉴定的ALK融合物。仅能够检测已知融合的方法将不能检测之前未知的ALK的融合或突变。通过不仅检测ALK的截短、核酸变异或ALK融合的存在，还检测野生型ALK和ALK激酶活性的存在，本领域技术人员可确定癌症是否归因于失调的野生型ALK、已知的ALK融合或之前未鉴定的ALK融合或ALK的突变。相应地，本文公开了诊断癌症、评估敏感性或风险或癌症或者检测ALK的失调的存在的方法，所述方法还包括检测野生型ALK的存在，并且所述方法还还包括检测ALK激酶活性的存在。因此，例如，本文公开了诊断ALK相关癌症的方法，所述方法包括检测受治疗者中来自组织样本的与ALK融合相关的核酸、野生型ALK和/或ALK激酶结构域的存在。mRNA检测和定量本文公开的方法涉及检测例如点突变和截短的形式的核酸变异，或检测ALK融合物的表达、异常的野生型ALK表达或ALK截短突变体的表达。对于这些后来的表达水平检测，所述方法包括检测mRNA的丰度或存在或者两者。因此，本文公开了用于诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的方法和组合物，包括测量来自受治疗者的组织样本的mRNA的存在或水平；其中mRNA的量相对于对照增加表明ALK相关癌症的存在。存在许多广泛使用的用于检测和测定总或者多聚腺苷酸RNA样本中特定mRNA的丰度的程序。例如，特定mRNA可使用RNA印迹分析、核酸酶保护测定(NPA)、原位杂交或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和微阵列来检测。理论上，这些技术中的每一种可用于检测特定的RNA并精确地确定它们的表达水平。通常，RNA印迹分析是仅有的提供关于转录物大小的信息的方法，而NPA是最容易的同时检测多条信息的方法。原位杂交用于在组织或细胞类型中定位特定基因的表达，而RT-PCR是用于检测并定量基因表达的最敏感的方法。RT-PCR允许检测任何基因的RNA转录物，不管起始物质或特定mRNA的相对丰度的不足。在PT-PCR中，使用逆转录病毒逆转录酶将RNA模板复制为互补DNA(cDNA)。之后使用DNA聚合酶通过PCR以指数级扩增cDNA。逆转录和PCR反应可在相同或不同的管中发生。RT-PCR某种程度上能耐受降解的RNA。只要引物跨越的区中的RNA是完整的，那么靶标就将被扩增。相对定量RT-PCR涉及同时扩增内对照与目标基因。使用内对照对样本进行归一化。一旦被归一化，可在样本间进行特定mRNA的相对丰度的直接对比。重要的是选择在所有实验的样本中具有恒定水平的表达的内对照(即不受实验处理的影响)。通常使用的内对照(例如，GAPDH、β-肌动蛋白、亲环蛋白)常常在表达上变化，并且因此不是适合的内对照。此外，最常用的内对照以比所研究的mRNA高得多的水平表达。为了使相对RT-PCR结果有意义，必须在线性范围的扩增中分析PCR反应的所有产物。这对大大不同水平的丰度的转录物来说变得困难。竞争性RT-PCR用于绝对定量。这一技术涉及设计、合成和精确定量可通过大小或序列上的小差异与内源性靶标相区别的竞争者RNA。将已知量的竞争者RNA加至试验样本并且进行RT-PCR。将来自内源性靶标的信号与来自竞争者的信号相比较以确定所述样本中存在的靶标的量。因此，在一个方面，本文公开了诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的方法，所述方法包括对来自受治疗者的组织样本的mRNA进行RT-PCR反应；其中逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)包括能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种正向引物；并且其中扩增产物的量相对于对照的增加表明ALK相关癌症的存在。因为所公开的方法可用来检测野生型ALK、ALK融合物和ALK激酶结构域活性，本文还公开了在受治疗者中诊断间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症或检测ALK激酶的失调的方法，所述方法包括对来自受治疗者的组织样本的mRNA进行第一次RT-PCR反应；其中逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)包括能够与一种或多种ALK序列特异性性杂交的反向引物和至少一种正向引物，其中所述正向引物与ALK融合配偶体特异性杂交；对来自受治疗者的组织样本的mRNA进行第二次RT-PCR反应；其中逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)包括能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的正向和反向引物；对来自受治疗者的组织样本的mRNA进行第三次RT-PCR反应；其中逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)包括能够与一种或多种ALK激酶结构域序列特异性杂交的正向和反向引物；并且其中扩增子的存在或扩增产物的量相对于对照的增加表明ALK相关癌症的存在和ALK激酶的失调的存在。特别地，ALK融合扩增子和激酶结构域扩增子的存在表明已知的ALK融合的存在，野生型扩增子和激酶结构域扩增子的存在表明野生型ALK，以及激酶结构域扩增子的单独存在表明之前未鉴定的ALK融合或突变的ALK的存在。RNA印迹分析是用于测定转录物大小以及用于鉴定可选择地剪接的转录物和多基因家族成员的最简单的方法。其还可用于在一个印迹上直接比较所有样本之间给定信息的相对丰度。RNA印迹程序是直接的并且为评估不同点处的进展(例如，RNA样本的完整无缺以及其如何有效地转移至膜)提供了机会。RNA样本首先在变性条件下经由琼脂糖凝胶中的电泳根据大小来分离。之后将RNA转移至膜，交联并用标记的探针杂交。可使用非同位素或高特异性活性的放射性标记的探针，包括随机引物的、缺口翻译的或PCR产生的DNA探针、体外转录的RNA探针和寡核苷酸。此外，具有仅部分的同源性的序列(例如，来自不同物种的cDNA或可包含外显子的基因组DNA片段)可用作探针。核酸酶保护测定(NPA)(包括核糖核酸酶保护测定和Sl核酸酶测定两者)是用于检测和定量特定mRNA的灵敏方法。NPA的基础是反义探针(标记的或非同位素的)与RNA样本的溶液杂交。杂交之后，单链的、未杂交的探针和RNA被核酸酶降解。在丙烯酰胺凝胶上分离剩余的受保护的片段。溶液杂交通常比基于膜的杂交更有效，并且与印迹杂交的20-30 μ g最大值相比，其可适应高达100 μ g的样本RNA。NPA还比RNA印迹分析对RNA样本降解较不敏感，因为断裂仅在与探针重叠的区中被检测(探针在长度上通常是100-400个碱基)。NPA是为同时检测几个RNA种类的选择方法。在溶液杂交和随后的分析过程中，单独的探针/靶标相互作用完全独立于彼此。因此，可同时测定几种RNA靶标和适合的对照(可在相同的反应中使用高达十二种)，条件是单独的探针具有不同的长度。NPA也常用于对mRNA末端和内含子/外显子结点的精确作图。原位杂交(ISH)是用于在细胞或组织中定位特定mRNA的有力并且通用的工具。与RNA印迹分析和核酸酶保护测定不同，ISH不需要分离或电泳分离RNA。探针的杂交在细胞或组织内进行。由于在整个程序中保持细胞结构，因此ISH提供关于mRNA在组织样本中的定位的信息。通过在中性缓冲福尔马林中固定样本并且将组织包埋在石蜡中开始程序。之后将样本切成薄切片并且封固在显微镜载玻片上。(可选择地，可对组织进行冷冻切片并且在低聚甲醛中后固定)。一系列洗涤以对切片进行脱蜡并且脱水之后，进行蛋白酶K消化以增加探针可达性，并且然后将标记的探针与样本切片杂交。用干燥至载玻片上的液膜将放射标记的探针可视化，同时用比色或荧光试剂方便地检测非同位素标记的探针。由于测序技术的限制，特别是敏感度，多年来开发了用于未知突变的很多扫描技术变性高效液相色谱(dHPLC) (Xiao和0efner，2001)，碱基切除序列扫描(BESS)、单链构象多态性(SSCP) (Orita等，1989)、异源双链分析(HA) (Nagamine等，1989)、构象敏感凝胶电泳(CSGE) (Ganguly 和 Prockop, 1995 ；Ganguly 等，1993)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Fodde和Losekoot, 1994)、恒定变性凝胶电泳(CDGE) (Hovig等，1991)、瞬时温度梯度凝胶电泳(TTGE) (Chen等，1999)、错配的化学断裂(Cotton等，1988 ；Tabon等，2006)、错配的酶促断裂(Winter 等，1985 ；Myers 等，1985)和错配修复酶(Oldenburg 和 Siebert, 2000 ；Babon等，1999 ；Youil等，1996 ；Brow等，1996 ；Lu和Hsu，1992)。这些技术已经看不到广泛的使用，因为它们具有下列限制中的一个或多个费力、难以自动化(低通量)、低敏感性或难以再现。最通用的点突变测定集中于检测靶基因的位点中的已知点突变。然而，对于像ALK 一样的基因，DNA整个大区域中发生自发点突变，这需要可扫描几百个碱基对的技术。已经开发了几种未知的点突变技术，但是大多数或者全部具有对于检测罕见的遗传突变来说妨碍它们的使用的限制。相比之下，模板交换和延伸反应(TEER )在其后面的步骤中使用选择性的扩增以增加罕见且未知的突变的检测的敏感性。这一优点转化为早期检测疾病的能力以及随着癌症继续进行并且突变监测癌症中另外的突变变化的累积的能力。而且，TEER 适用于多个平台，包括实时PCR、片段分析和电泳。例如，从样本获得开始至来自混合的临床样本的罕见的ALK活化点突变的终点检测的TEER ，所述混合的临床样本含有来自污染的非肿瘤细胞的丰富的正常DNA。全部过程可在约5. 5小时内完成。TEER 平台由5个基本步骤组成。1.含有测序荧光的荧光素(FAM)标签和用于固相捕获纯化的生物素标签的等位基因特异性的寡核苷酸用于包含罕见或新型突变的初始ALK 270bp模板的PCR扩增。2.将扩增子热变性并且之后允许连同变性的野生型ALK模板一起杂交，允许模板交换发生。3.之后使用单链核酸酶CEL 1酶断裂任何现有的错配核苷酸。4.将含有切离的错配碱基的DNA链用Taq聚合酶延伸。5.然后使用特异性RT-PCR引物检测所延伸的模板的仅5’区。将TEER 扩增和定量组合允许高通量并且敏感的检测。使用仅在延伸的TEER 纯化的模板上存在的唯一的反向引物位点扩增并定量存在(或不存在)的任何可能的突变。使用初始正向引物上的生物素化的寡核苷酸捕获序列以及使用Exo III以消化含有互补3’或5’端的任何双链的双链体，将来自于污染的野生型模板的背景维持为最小值(美国专利第6，150，105号，其关于模板交换和延伸反应的教义的全部内容通过引用的方式并入本文)。最初开发TEER 方法以解决肿瘤学领域对在来自恶性细胞和组织的模板中检测未发现的遗传多态性的高通量工具的需要。最初使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)证明TEER 。设计TEER 以与对照(未突变的DNA模板)相比较来检测可含有罕有的、已知的或新型的突变的DNA模板中的遗传变异。基于测序产物对于产生的模板来说是唯一的事实，用TEER 来将可能含有突变的“未知的"DNA模板与证实没有突变的模板相比较。测序产物中的任何变化反映未知DNA模板中的遗传突变并且可通过凝胶电泳可视化。近来，使TEER 方法适用于固相微量滴定检测平台以允许高通量的分析并且提高易用性。使用5’生物素化的引物扩增对照和“未知的” DNA模板以产生生物素化的PCR产物。之后，通过将来自对照和“未知的"DNA模板的PCR扩增子杂交来形成同源双链DNA和异源双链DNA。杂交之后，将同源双链DNA和异源双链DNA通过与链霉亲和素包被的微孔板的偶联而连接至固相，然后在所述微孔板中TEER 方法的所有步骤都容易进行，这大大简化样本处理和加工。TEER 过程是改进的等位基因特异性寡核苷酸杂交测定并且为了高通量和高敏感性可与实时PCR平台复合。
DNA检测和定量本文公开的方法涉及检测例如点突变和截短的形式的核酸变异或检测ALK融合的表达、异常野生型ALK表达或ALK截短突变的表达。对于这些晚期表达水平检测，所述方法包括检测mRNA的丰度或存在或者两者。可选择地，检测可针对DNA例如cDNA的丰度或存在。因此，本文所公开了用于诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的方法和组合物，所述方法包括测量来自受治疗者的组织样本的DNA的存在或水平，其中DNA的量相对于对照的增加表明ALK相关癌症的存在。存在用于检测或测定样本中特定DNA的丰度的许多广泛使用的程序。例如，PCR的技术允许微小量的靶核酸的扩增和随后的检测。PCR的细节良好描述于本领域中，包括例如，Mullis等的美国专利第4，683，195号、Mullis的美国专利第4，683，202号和Mullis等的美国专利第4，965，188号。通常，将寡核苷酸引物退火至靶核酸的变性链并且通过经由聚合酶的脱氧核苷三磷酸的聚合形成引物延伸产物。典型的PCR方法包括模板核酸变性、引物退火和经由热稳定聚合酶的作用的退火引物的延伸的重复循环。所述过程产生靶核酸的指数级扩增，并且因此允许样本中以非常低的浓度存在的靶标的检测。应当理解并且本文涵盖了存在同样可用于所公开的方法的本领域中已知的不同的PCR方法，例如定量PCR(QPCR)、微阵列，实时PCT、热启动PCR、巢式PCR、等位基因特异性PCR和降落PCR。微阵列阵列是样本的有序排列，提供用于基于碱基配对原则使已知和未知的DNA样本配对并且使鉴定未知物的过程自动化的媒介。阵列实验可利用常用的测定系统(例如微板或者标准的印迹膜)，并且可通过手工或利用机器人放置样本来产生。通常，将阵列描述为宏阵列(macroarray)或微阵列，区别在于样本点的大小。宏阵列包含约300微米或更大的样本点大小并且可容易地通过现有的凝胶和印迹扫描仪成像。微阵列中的样本点大小可以是直径为300微米或更小但是通常小于200微米，并且这些阵列通常包含上千个点。微阵列要求通常不能作为完整系统而商购获得的专门的机器人和/或成像设备。在文献中使用的描述这一技术的术语包括但不限于生物芯片、DNA芯片、DNA微阵列、GeneChip (Affymetrix, he，其是指基于高密度、寡核苷酸的DNA阵列)和基因阵列。DNA微阵列或DNA芯片通过高速机器人制造，通常在玻璃或尼龙基质上，用于其的具有已知同一性的探针被用于测定互补结合，因此允许大量平行基因表达和基因发现研究。使用单个DNA芯片的实验可同时提供关于上千个基因的信息。本文涵盖的所公开的微阵列可被用于监测基因表达、疾病诊断、基因发现、药物发现(药物基因组学)和毒理学研究或毒理基因组学。就所排列的具有已知同一性的DNA序列的性质而言，存在DNA微阵列技术的两种变体。I型微阵列包含使用机器人点样固定至固体表面(例如玻璃)并且分别或以混合形式暴露于一套靶标的探针cDNA(500 5，000个碱基长度)。这一方法传统上称为DNA微阵列。使用I型微阵列，将一个或多个多核苷酸序列的局部多个拷贝(优选单个多核苷酸序列的拷贝)固定在基底表面的大量限定的区上。多核苷酸是指从5至10，000个核苷酸范围内的核苷酸链。多核苷酸序列的这些固定的拷贝适于用作杂交实验中的探针。为了制备用固定的探针包被的小珠，将小珠浸在包含所期望的探针序列的溶液中并且之后通过共价或非共价方式固定在小珠上。可选择地，当将探针固定在棒上时，可将给定的探针点样在棒的限定的区中。典型的点样仪包括用机器人系统将溶液递送至基底的微量移液器以控制微量移液器相对于基底的位置。可有多个点样仪以便使试剂同时递送至反应区。在一个实施方案中，微阵列通过使用基于压电效应的油墨喷射技术形成，由此包含目标液体(例如寡核苷酸合成试剂)的狭管被连接器环绕。横过连接器发射的电荷导致连接器以与管不同的速率膨胀并且将小滴的液体压至基底上。样本可以是包含目标多核苷酸(多核苷酸靶标)的任何样本并且可从任何体液(血液、尿液、唾液、粘液、胃液等)、培养的细胞、活组织检查或其它组织制备物获得。可根据本领域中那些技术人员熟知的许多方法中的任一种将DNA或RNA从样本中分离。在一个实施方案中，使用 TRIzol 全 RNA 分离试剂(Life Technologies, Inc.，Rockville，Md.)分离总RNA，并且使用寡聚脱氧胸苷柱层析或玻璃小珠分离RNA。杂交并且处理之后，所获得杂交信号应当精确反应加至样本的对照靶核苷酸的量。基底上的大量的限定的区可以不同的形式排列。例如，所述区可与外罩的长度垂直或平行排列。而且，靶标并不必须直接与基底结合，而是可以通过连接子基团与基底结合。连接子基团的长度通常可从约6个原子变化至50个原子。连接子基团包括乙二醇寡聚物、二元胺、二酸等。基底表面上的活性基团与连接子的末端部分中的一个反应以将连接子与基底结合。之后将连接子的另一个末端部分功能化以便结合探针。样本多核苷酸可用一个或多个标记部分标记以允许检测杂交的探针/靶多核苷酸复合物。标记部分可包括可通过光谱、光化学、生物化学、生物电子学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的组合物。标记部分包括放射性同位素，例如％P、33P或mS ；化学发光的化合物；标记的结合蛋白；重金属原子；光谱标记，例如荧光标记和染料；磁性标记；连接的酶；质谱标签；自旋标记；电子转移供体和受体；生物素等。标记可在扩增反应(例如聚合酶链式反应和体外或体内转录反应)期间进行。可选择地，标记部分可在杂交(一旦探针-靶标复合物形成)之后掺入。在一个实施方案中，生物素首先在如上文所描述的扩增步骤期间掺入。杂交反应之后，冲洗掉未结合的核酸以便仅与基底保持结合的生物素与同多核苷酸探针杂交的靶多核苷酸连接。之后，加入以高亲和力与生物素结合的抗生物素蛋白偶联的荧光团，例如抗生物素蛋白-藻红蛋白。杂交使得多核苷酸探针和互补靶标通过碱基配对形成稳定的双链体。杂交方法是本领域那些技术人员熟知的。用于杂交的严格条件可由盐浓度、温度以及其它化学制品和条件来规定。变化的另外的参数例如杂交时间、去污剂(十二烷基硫酸钠，SDQ或溶剂(甲酰胺)的浓度以及包含或不包含载体DNA是本领域中那些技术人员熟知的。这些条件的另外的变化对本领域那些技术人员来说是非常显而易见的。用于检测复合物形成的方法是本领域那些技术人员熟知的。在一个实施方案中，用荧光标记来标记多核苷酸探针并且通过荧光显微镜(优选为共聚焦荧光显微镜)完成复合物形成的水平和模式的测量。氩离子激光器激发荧光标记，将发射指向光电倍增管并且检测和定量所发射的光的量。检测的信号应当与显微镜的每个位置的探针/靶标多核苷酸复合物的量成比例。荧光显微镜可与计算机驱动的扫描仪设备连接以产生杂交强度的定量二维图像。检查扫描的图像以确定每种杂交的靶多核苷酸的丰度/表达水平。在不同的杂交实验中，用具有不同的发射波长的两种或更多种不同的荧光标记来标记来自两种或更多种不同生物样本的多核苷酸靶标。用设定以检测特定波长的不同的光电倍增管分别检测荧光信号。获得两个或更多个样本中的靶多核苷酸的相对丰都/表达水平。通常，当多于一个的微阵列在相同的测试条件下使用时，微阵列荧光强度可被归一化以考虑杂交强度的变化。在一个实施方案中，使用来源于每个微列阵上都包含的内部归一化对照的强度将单独的多核苷酸探针/靶标复合物杂交强度归一化。II型微阵列包含原位(在芯片上)或通过芯片上固定之后的传统合成来合成的寡核苷酸O0-80元寡核苷酸)或肽核酸(PNA)探针的阵列。将阵列暴露于标记的样本DNA、杂交并且确定互补序列的同一性/丰度。这一方法，“历史上”称为DNA芯片，于Affymetrix，Inc开发，其以商标名GeneChip 出售其光刻法制造的产品。将II型阵列用于基因表达的背后的基本概念是简单的将来源于试验样本的mRNA的标记的cDNA或cRNA靶标与连接于固体载体的核酸探针杂交。通过监测与每种DNA定位有关的标记的量，推断出所代表的每种mRNA种类的丰度是可能的。尽管杂交已经使用了几十年以检测并定量核酸，但是技术的小型化和序列信息的巨大并且增长中的量的组合已经极大地扩展了基因表达可被研究的水平。可用5平方英寸的石英薄片开始微阵列制造。首先清洗石英以确保其整个表面的均勻的羟基化。因为石英是天然羟基化的，因此它提供用于连接化学制品(例如连接子分子)的优良基底，所述化学制品之后用于将探针定位于阵列上。将薄片置于甲硅烷浴中，其与石英的羟基起作用并且形成共价连接分子的基质。这些硅烷分子之间的距离决定探针的填充密度，允许阵列在仅1. 28平方厘米中容纳超过500，000个探针位置或者特征性序列(feature)。每个特征性序列带有数百万相同的DNA分子。硅烷薄膜提供均勻的羟基密度以起始探针装配。与硅烷基质连接的连接子分子提供可由光在空间中活化的表面。探针合成平行发生，致使A、C、T或G核苷酸同时加入多个增长的链。为了明确在每一个步骤中哪条寡核苷酸将获得核苷酸，将携带对应于单个部件的直径的18至80平方微米的窗口的光刻的掩膜放置在包被的薄片上。基于每个探针的所期望的序列将窗口分布于整个掩膜上。在合成的第一步中，当紫外光照射在掩膜上时，暴露的连接子变的脱保护并且可用于核苷酸偶联。一旦所期望的特征性序列被活化，将含有具有可移除的保护基团的单一类型的脱氧核苷酸的溶液流溢整个薄片的表面。核苷酸与活化的连接子连接，起始合成过程。尽管寡核苷酸的序列中的每个位置可由4种核苷酸中的1种占据，产生每个薄片25X4或100个不同的掩膜的明显需要，但是可设计合成过程以显著降低这一需求。帮助将掩膜使用最小化的算法通过调节单个探针的合成速度并且鉴别当某些掩膜可多次使用的情况来计算如何最好的协调探针生长。不管它们预期的应用，选择和设计的关键因素中的某些对于所有微阵列的产生来说是共同的。例如，优化探针杂交的策略一定包括在探针选择的过程中。特定PH、盐和温度条件下的杂交可通过考虑解链温度和使用与所期望的杂交行为相关联的经验法则来优化。为了获得基因活性的完整体现，从由多个剪接或多腺苷酸化变体共享的区选择一些探针。在其它实例中，优选在变体之间有区别的唯一的探针。探针间距离同样是选择过程中的考虑因素。
用不同组的策略选择用于依赖于多个探针的基因型阵列的探针以查询序列中的单个核苷酸。使用仅在靶位置变化的每个包含四种可能的碱基中的一种的四个相同的探针可推断出靶碱基的同一性。可选择地，可使用代表特异性等位基因的一个或两个探针测试共有序列的存在。对于基因型杂合的或遗传上混合的样本，可制造具有许多探针的阵列以提供冗余信息，产生明确的基因型。此外，属的探针可被用于某些应用中以将灵活性最大化。例如，一些探针阵列允许来自复合混合物的单个反应产物的分离和分析，诸如在某些方案中用于鉴定单核苷酸多态性(SNP)的那些。实时PCR与终点检测相反，实时PCR监测反应期间发射的荧光作为每个PCR循环期间(即，实时)扩增子产物的指示剂。可在一些系统中看到反应的实时过程。实时PCR不检测扩增子的大小并且因此不允许DNA和cDNA扩增之间的差异，然而，其不受非特异性扩增的影响(除非使用STOR绿)。实时PCR定量消除PCR产物的PCR后加工。这有助于增加通量并且减少移行污染的机会。实时PCR还提供高达IO7倍的大动态范围。任何测定的动态范围决定靶浓度可变化多少并且还可被定量。大动态范围意指大范围比率的靶标和标准化物(normaliser)可以相同的敏感性和特异性被检测。其遵循动态范围越宽定量越准确。当与PT-PCR结合时，实时RT-PCR反应通过提供当扩增过程进行时扩增子的可视化来减少测量扩增子的量需要的时间。实时PCR系统是以荧光报告分子的检测和定量为基础的。这一信号与反应中PCR产物的量成正比增加。通过记录每个循环中荧光发射的量，可能监测指数期的PCR反应，其中在指数期PCR产物的量的首次显著增加与靶模板的初始量相关联。核酸靶标的起始拷贝数越高，越快观察到荧光的显著增加。在3至15个循环期测量的基线值以上荧光的显著增加可指示累积的PCR产物的检测。固定的荧光阈值设置为明显在可通过控制器改变的基线之上。将参数CT(阈值循环)定义为荧光发射超过固定阈值的循环数。有用于DNA扩增的三种主要荧光监测系统⑴水解探针；(2)杂交探针；和(3)DNA结合剂。水解探针包括TaqMan探针、分子信标和scorpion。它们使用Taq聚合酶的荧光5’核酸外切酶活性以测量cDNA样本中靶序列的量。TaqMan探针是比引物(Tm值高于10°C的长度为20_30个碱基)长的通常在5，碱基上包含荧光染料并且通常在3’碱基上具有淬火染料(通常是TAMRA)的寡核苷酸。当受到照射时，激发的荧光染料将能量传递给邻近的淬灭染料分子而不是发荧光(这被称为FRET=F0rster或荧光响应能量传递)。因此，当探针是完整的时，报告分子和淬灭剂之间的紧密靠近阻止任何荧光的发射。将TaqMan探针设计为以退火至PCR产物的内部区。当聚合酶复制TaqMan探针结合于其上的模板时，其5’核酸外切酶活性将探针断裂。这终止了淬灭剂的活性(没有FRET)并且报告分子染料开始发射在每一个循环中与探针断裂的速度成比例增加的荧光。PCR产物的累积通过监测报告分子染料的荧光增加来检测(注意引物不是标记的)。TaqMan测定使用通用的热循环参数和PCR反应条件。因为断裂仅在探针与靶标杂交时发生，检测的荧光的来源是特异性扩增。杂交和断裂的过程不干扰产物的指数累积。对于荧光探针的一个特别要求是在5’端没有G。邻近报告分子染料的“G”甚至可在断裂后淬灭报告分子荧光。分子信标也在各端含有荧光染料(FAM、TAMRA、ΤΕΤ、R0X)和淬灭染料(通常是DABCYL)，但是它们被设计以在溶液中游离时采用发卡结构以使得荧光染料和淬灭剂紧密靠近以便FRET发生。它们有形成非常稳定的杂交或茎的具有互补序列的两个臂。这一发卡构型中报告分子和淬灭剂的紧密靠近抑制报告分子发荧光。当信标在退火步骤期间与靶标杂交时，报告分子染料与淬灭剂分离并且报告分子发荧光(FRET不发生)。分子信标在PCR期间保持完整并且在每个循环必须与靶重新结合以便荧光发射。这将与可获得的PCR产物的量相关。所有的实时PCR化学通过设计具有光谱上唯一的荧光/淬灭配对允许多个DNA种类的检测(多重化)，只要如果使用STOR绿时平台适合解链曲线分析。通过多重化，靶标和内源对照可在单个管中扩增。对于korpion探针，使用单个寡核苷酸实现序列特异性引物技术(sequence-specific priming)和PCR产物检测。korpion探针在未杂交状态保持茎-环构型。将荧光团连接至5’端并且由与3’端偶联的部分淬灭。茎的3’部分也含有与引物的延伸产物互补的序列。这一序列经由不可扩增的单体与特异性引物的5’端连接。korpion引物延伸之后，特异性探针序列能够与延伸的扩增子中其补体结合因此打开发卡环。这防止荧光被淬灭并且观察到信号。另一个替代方案是双链DNA结合染料化学，其通过使用非序列特异性荧光嵌入剂(SYBR-绿I或溴化乙锭)定量扩增子产物(包括非特异性扩增和引物-二聚体复合物)。它不与ssDNA结合。STOR绿是当在溶液中时表现出少量荧光而当与双链DNA结合时发射强荧光信号的荧光小沟结合染料。基于STOR绿的实时PCR的缺点包括需要充分的优化。而且，非特异性扩增需要对于扩增子鉴定的跟踪测定(熔点曲线或解离分析)。所述方法已用于HFE-(^82Y基因分型。另一个可控的问题是较长的扩增子产生较强的信号(如果与其它因素相结合，这可导致CDC照相饱和(camera saturation)，参见下文)。通常STOR绿被用于单元反应，然而当与熔点分析偶联时，它可被用于多重反应。阈值循环或Ct值是第一次检测到Δ Rn显著增加的循环(对于Δ Rn的定义，参见下文)。阈值循环是当系统开始检测与对数线性相位期间PCR产物的指数生长相关的信号的增加时。这一相提供关于反应的最有用的信息(必定比终点更重要)。对数线性相位的斜率是扩增效率的反映。反应的效率(Eff)可以通过公式来计算Eff = 10H〃W)-1。PCR的效率应该是90-100% (3. 6 >斜率> 3. 1)。许多变量可影响PCR的效率。这些因素包括扩增子的长度、二级结构和引物质量。尽管可获得落在有效范围外的有效数据，qRT-PCR还应当被进一步优化或设计替代扩增子。对于作为真实扩增(而不是信号漂移)的指示的斜率，必须有拐点。这是当对数线性相位开始时生长曲线上的点。它还代表沿着生长曲线的最大变化率。(信号漂移的特征在于没有产物扩增的荧光的逐渐增加或减少)。定量的重要参数是CT。基因组DNA的初始的量越高，越快在PCR过程中检测到累积的产物，并且Ct值越低。阈值应当设置在任何基线活性之上并且在指数增加相位中(其看起来在对数转换中是线性的)。一些软件允许通过生长曲线的数学分析确定循环阈值(Ct)。这提供较好的运行再现性。Ct值为40意指没有扩增并且这一值不能包括在计算中。除了用于定量之外，Ct值可用于合格/不合格测量的定性分析。可以使用具有不同发射波长的多种染料进行多重TaqMan测定。用于这一目的的可获得的染料是FAM、TET、VIC和JOE (最贵的)。TAMRA作为探针上的淬灭剂而ROX是被动参照。为了最好的结果，推荐FAM(靶标)和VIC(内源对照)的组合(它们具有发射最大值的最大差异)，而JOE和VIC不应该被组合。重要的是如果没有正确选择了染料层，机器将还是读取其它染料的光谱。例如，VIC和FAM都在彼此相似的范围中发射荧光，并且当在作为单个染料时，孔应该被正确标记。在多重化的实例中，应当开启用于运行后分析的光谱补偿(在ABI 7700上仪器/诊断学/高级选项/杂项)。激活的光谱补偿提高染料光谱分辨率。巢式PCR所公开的方法还可利用巢式PCR。巢式PCR通过减少归因于DNA的非特异性扩增的背景而增加DNA扩增的特异性。在两个连续的PCR中使用两组引物。在第一个反应中，用一对引物产生DNA产物，其在预期的靶标之外，可仍由非特异性扩增的DNA片段组成。然后产物与一组引物一起用于第二次PCR，所述一组引物的结合位点与第一次反应中使用的引物的每一个完全或部分不同并且位于第一次反应中使用的引物的每一个的3’。巢式PCR在特异性扩增长DNA片段时通常比传统PCR更成功，但是它需要对靶序列的更详细的了解。因此，在一个方面，本文公开了诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌的方法，所述方法包括对来自受治疗者的组织样本的DNA进行PCR反应；其中PCR反应包括能够与一个或多个ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一个正向引物；并且其中扩增产物的量相对于对照的增加表明ALK相关癌症的存在。引物和探针如本文所用，“引物”是能够支持某些类型的酶处理并且能够与靶核酸杂交以便使酶处理能够发生的一个亚组的探针。引物能够从本领域中可获得的不干涉酶处理的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制得。如本文所用，“探针”是能够与靶核酸通常以序列特异性方式(例如通过杂交)反应的分子。核酸的杂交是本领域中非常了解的并且在本文讨论。通常探针可从本领域中可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制得。公开了包含引物和探针的组合物，其能够与所公开的核酸例如SEQ ID N0:1或其补体反应。在某些实施方案中，引物用于支持核酸延伸反应、核酸复制反应和/或核酸扩增反应。通常引物将能够以序列特异性方式延伸。引物以序列特异性方式的延伸包括任何方法，其中与引物杂交或者以其它方式缔合的核酸分子的序列和/或组合物指导或影响通过引物的延伸所产生的产物的组合物或序列。引物以序列特异性方式的延伸因此包括但不限于PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、RNA转录或逆转录。公开了以序列特异性方式扩增引物的技术和条件。在某些实施方案中，引物被用于DNA扩增反应，例如PCR或直接测序。应当理解的是在某些实施方案中还可使用非酶技术延伸引物，其中例如用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸被修饰以便使它们化学反应以序列特异性方式延伸引物。通常，所公开的引物与所公开的核酸或核酸的区杂交或它们与核酸的补体或核酸的区的补体杂交。作为引物的用途的实例，一种或多种引物可被用来产生来自并且由第一核酸作为模板的延伸产物。用于与核酸相互作用的引物或探针的大小可以是支持引物的所期望的酶处理(例如DNA扩增或者探针或引物的简单杂交)的任何大小。典型的引物或探针的长度将是至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500 或 4000 个核苷酸。在其它的实施方案中，引物或探针的长度可小于或等于6、7、8、9、10、11、1213、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500 或 4000 个核苷酸用于目标核酸的引物通常将用于产生包含目标核酸的区的延伸产物和/或其它复制或扩增产物。产物的大小可以是使得大小能够被精确确定至3或2或1个氨基酸以内。在某些实施方案中，产物的长度可以是例如至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500 或 4000 个核苷酸。在其它的实施方案中，产物的长度可以是例如小于或等于20、21、22、23、对、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500 或4000个核苷酸。因此，应当理解并且本文涵盖了所公开的RT-PCR和PCR反应需要正向和反向引物以形成引物对。本文中所公开的，正向引物可选自由以下组成的组。例如正向引物可以是细胞内 ALK 引物，例如诸如，(引物 100)5，ACTACTGCTTTGCTGGCAAGACCT(SEQ ID NO 6)；细胞外 EML4-ALK 融合引物，例如诸如，(引物 10;3)5，TGTTCAAGATCGCCTGTCAGCTCT(SEQ ID NO:3)；细胞外 NPM-ALK 融合引物，例如诸如，(引物 102) ；5，TCTGTACAGCCAACGGTTTCCCTT (SEQID NO 4)；细胞外 CTLC-ALK 融合引物，例如诸如，(引物 105) 5，GAGAGTGCTTTGGAGCTTGTCTGT (SEQ ID NO 5)；或来自非同源的区的细胞外野生型ALK引物，例如诸如，(引物104) 5’TTCCTTCATCAGTCCACTGGGCAT(SEQ ID NO :2)。可在本文公开的方法中使用的另外的正向或反向引物可在表3中找到。反向引物可以是，例如引物101 :5，TCGTCCTGTTCAGAGCACACTTCA(SEQ ID NO :7)。可选择地，反向引物可是SEQ ID NO 32,SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 56、SEQ IDN0:57或SEQ ID NO :58。应当理解的是所述方法包含至少一个正向引物和反向引物。因此，本文公开了诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的方法，所述方法包括对来自受治疗者的组织样本的mRNA进行RT-PCR反应；其中逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)包含能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种正向引物；其中正向引物选自由 KIF5B-ALK 引物、NPM-ALK 引物、ATIC-ALK 引物、CLTC-ALK 引物、RANBP2-ALK 引物、SEC31L1-ALK 引物、TPM3-ALK 引物、TPM4-ALK 引物、TFGl-ALK 引物、TF&-ALK 引物、CARS-ALK引物、EML4-ALK引物、AL017-ALK引物、MYH9-ALK弓丨物、MSN-ALK引物和TFGa-ALK引物组成的组；并且其中扩增产物的量相对于对照的增加指示ALK相关癌症的存在。因此，还公开了这样的方法，其中正向引物选自由SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO:5,SEQ ID NO :6,SEQ ID NO 35,SEQ ID NO 36,SEQ ID NO 37,SEQ ID NO 38,SEQ ID NO:39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ IDNO :45、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQID NO 53,SEQ ID NO 54、SEQ ID NO :55 JPSEQ ID NO :59 组成的组。例如，本文公开了诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的方法，所述方法包括对来自受治疗者的组织样本的mRNA进行RT-PCR反应；其中逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)包含能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种正向引物；其中正向引物是包含SEQ IDNO 4的NPM-ALK融合引物，并且其中扩增产物的量相对于对照的增加指示ALK相关癌症的存在。作为引物对的另外的实例，本文特别公开了这样的方法，其中正向引物是野生型ALK引物并且反向引物是SEQ ID N0:7;其中正向引物是KIF5B-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；其中正向引物是NPM-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；其中正向引物是ATIC-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；其中正向引物是CLTC-ALK引物并且反向引物是SEQ ID N0:7 ；其中正向引物是RANBP2-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；其中正向引物是SEC31L1-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；其中正向引物是TPM3-ALK引物并且反向引物是SEQ ID N0:7 ；其中正向引物是TPM4-ALK引物并且反向引物是SEQID NO :7 ；其中正向引物是TFGfALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7;其中正向引物是TFGs-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；其中正向引物是CARS-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；其中正向引物是EML4-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；其中正向引物是AL017-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；其中正向引物是MYH9-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :7 ；或者其中正向引物是TFG5iL-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO:7。还公开了这样的方法，其中引物对包含SEQ ID NOS :2和7、SEQ ID NOS :3和7、SEQ IDNOS 4 禾口 7、SEQ ID NOS :5 禾口 7 或 SEQ ID NOS 6 禾口 7。引物对的另外的实例，本文公开了这样的方法，其中正向引物是野生型ALK引物并且反向引物是SEQ ID N0:46 ；其中正向引物是KIF5B-ALK引物并且反向引物是SEQ IDNO :46 ；其中正向引物是NPM-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :46 ；其中正向引物是ATIC-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :46 ；其中正向引物是CLTC-ALK引物并且反向引物是SEQ ID N0:46;其中正向引物是RANBP2-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :46 ；其中正向引物是SEC31L1-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :46 ；其中正向引物是TPM3-ALK引物并且反向引物是SEQ ID N0:46 ；其中正向引物是TPM4-ALK引物并且反向引物是SEQID N0:46 ；其中正向引物是TFGfALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :46 ；其中正向引物是TFGs-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :46 ；其中正向引物是CARS-ALK引物并且反向引物是SEQ ID N0:46;其中正向引物是EML4-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :46 ；其中正向引物是AL017-ALK引物并且反向引物是SEQ ID NO :46 ；其中正向引物是MYH9-ALK弓丨物并且反向引物是SEQ ID NO :46 ；或者其中引物是TFGa-ALK引物并且反向引物是SEQ IDNO :46ο还公开了这样的方法，其中引物对包含SEQ ID NOS 2和46 ；SEQ ID NOS 3和46 ；SEQ ID NOS 4 和 46 ；SEQ ID NOS 5 和 46 ；SEQ ID NOS 6 和 46 ；SEQ ID NOS 33 和 46 ；SEQID NOS 34 和 46 ；SEQ ID NOS 35 和 46 ；SEQ ID NOS 36 和 46 ；SEQ ID NOS 37 和 46 ；SEQID NOS 38 和 46 ；SEQ ID NOS 39 和 46 ；SEQ ID NOS 40 和 46 ；SEQ ID NOS 41 和 46 ；SEQID NOS 42 和 46 ；SEQ ID NOS 43 和 46 ；SEQ ID NOS 44 和 46 ；SEQ ID NOS 45 和 46 ；SEQID NOS 485 和 46 ；SEQ ID NOS 49 和 46 ；SEQ ID NOS 50 和 46 ；SEQ ID NOS 51 和 46 ；SEQID NOS 52 禾口 46 ；SEQ ID NOS 53 禾口 46 ；SEQ ID NOS :54 和 46 ;SEQ ID NOS :55 禾口 46 或 SEQID NO 58 和 46。应当理解并且本文涵盖了存在其中利用多于一种的引物对检测融合、截短或过表达突变的存在是有利的情况。这些RT-PCR或PCR反应可分别或在单个反应中进行。当将多个引物对放在单个反应中时，这被称为“多重PCR”。例如，反应可包括与反向引物配对的野生型ALK引物以及与相同的反向引物配对的ALK融合引物。因此，本文公开了诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的方法，所述方法包括对来自受治疗者的组织样本的mRNA进行RT-PCR反应；其中逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)包含能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少两种正向引物；并且其中扩增产物的量相对于对照的增加指示ALK相关癌症的存在。相似地，公开了包括至少三种正向引物的方法。应当理解并且本文涵盖了本文公开的两种或更多种或者三种或更多种正向引物的任何组合可用于多重反应。因此，例如，本文公开了其中正向引物是NPM-ALK弓丨物和野生型ALK弓丨物的诊断方法。还公开了例如其中正向引物是ELM4-ALK引物和野生型ALK引物的诊断方法。多重PCR正向引物组的其它实例包括但不限于KIF5B-ALK融合引物和野生型ALK引物、CLTC-ALK融合引物和野生型ALK引物、RANBP2-ALK融合引物和野生型ALK引物、ATIC-ALK融合引物和野生型ALK引物、SEC31L1-ALK融合引物和野生型ALK引物、TPM3-ALK融合引物和野生型ALK引物、TPM4-ALK融合引物和野生型ALK引物、TFG^ALK融合引物和野生型ALK引物、TFGs-ALK融合引物和野生型ALK引物、CARS-ALK融合引物和野生型ALK引物、AL017-ALK融合引物和野生型ALK引物、MYH9-ALK融合引物和野生型ALK引物、MSN-ALK融合引物和野生型ALK引物、截短的ALK引物和野生型ALK引物、ELM4-ALK融合引物和截短的ALK引物、NPM-ALK融合引物和截短的ALK引物、CLTC-ALK融合引物和截短的ALK引物、RANBP2-ALK融合引物和截短的ALK引物、ATIC-ALK融合引物和截短的ALK引物、SEC3ILl-ALK融合引物和截短的ALK引物、TPM3-ALK融合引物和截短的ALK引物、TPM4-ALK融合引物和截短的ALK引物、TFG^ALK融合引物和截短的ALK引物、IFGs-ALK融合引物和截短的ALK引物、CARS-ALK融合引物和截短的ALK引物、AL017-ALK融合引物和截短的ALK引物、MYH9-ALK融合引物和截短的ALK引物和MSN-ALK融合引物和截短的ALK引物。另外的实例包括但不限于ELM4-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；NPM-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；CLTC-ALK融合引物、野生型ALK弓丨物和截短的ALK弓丨物；RANBP2-ALK融合引物、野生型ALK弓丨物和截短的ALK引物；AT IC-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；SEC31L1-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；TPM3-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；TPM4-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；TFG^ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；TFGs-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；CARS-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；AL017-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；MYH9-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物；和MSN-ALK融合引物、野生型ALK引物和截短的ALK引物。因此，在一个方面，单个反应管可包含与一种或多种ALK融合物、野生型ALK或ALK激酶结构域杂交的正向引物和与野生型ALK杂交的反向引物。应当理解的是本文公开的方法可包括多个反应管。例如，所述方法可包括检测已知的ALK融合的存在的第一个反应，其包含一种或多种正向ALK融合引物和与野生型ALK杂交的反向ALK引物(例如，正向引物SEQ ID NO 2、3、4、5、6、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、48、49、50、51、52、53 和 59 和反向引物SEQ ID N0:7、32、46、47、56、57或58)；第二反应管，其包含用于检测野生型ALK的正向和反向引物(例如，正向引物SEQ ID NO :3354或55和反向引物SEQ ID NO :7、32、46、47、56、57或58)；可检测ALK的激酶结构域的存在的正向和反向引物(例如，正向引物SEQ ID NO :45或48和反向引物SEQ ID NO :7、32、46、47、56、57或58)；检测对照的正向和反向引物；用于阳性cDNA对照的正向和反向引物；以及阴性cDNA对照的正向和反向引物。在多反应管的方法中，从获得自受治疗者的组织样本提取RNA ；将RNA逆转录产生cDNA ；将cDNA在一个或多个反应管中分配并且进行RT-PCR或微阵列测定。假设对照如设计的所表现，本领域中的技术人员可检测融合管、野生型管和激酶管中的扩增产物。产生扩增子在融合管和激酶管中存在但是在野生型管中不存在的测定表明已知ALK融合的存在。如果融合管是阴性的但是野生型管和激酶管是阳性的，那么只存在野生型ALK。如果野生型和融合反应管都是阴性的但是激酶管是阳性的，那么有之前未知的融合存在。如果激酶管是阴性的而融合或野生型管是阳性的，那么没有功能性ALK并且组织样本不包含ALK相关癌症(参见图5A)。应当理解的是，通过测量扩增子大小，可测定样本中特定的ALK融合或野生型ALK的身份(参见图5B)。在扩增子具有与特定的ALK融合或野生型ALK无关的大小的情况中，扩增子表现之前未知的ALK融合。荧光变化探针和引物荧光变化探针和荧光变化引物是指涉及荧光强度或波长变化的所有探针和引物，所述荧光强度或波长变化基于以探针或引物以及待检测、测定或复制的核酸的形式或构象的变化。荧光变化探针和引物的实例包括分子信标、Amplifluor、FRET探针、可裂解的FRET探针、TaqMan探针、scorpion引物、包括但不限于三联分子信标或三联FRET探针的荧光三联寡核苷酸、荧光水溶性偶联聚合物、PNA探针和QPNA探针。荧光变化探针和引物可根据它们的结构和/或功能分类。荧光变化探针包括发卡淬灭的探针、断裂淬灭的探针、断裂活化的探针和荧光活化的探针。荧光变化引物包括茎淬灭的引物和发卡淬灭的引物。发卡淬灭的引物是当不与靶序列结合时形成发卡结构(并且通常是环)的探针，所述发卡结构使荧光标记和淬灭部分发卡结构靠近以便淬灭来自标记的荧光。当探针与靶序列结合时，茎被破坏，淬灭部分不再与荧光标记靠近并且荧光增加。发卡淬灭探针的实例是分子信标、荧光三联寡核苷酸、三联分子信标、三联FRET探针和QPNA探针。断裂活化的探针是其中荧光通过探针的断裂而增加的探针。断裂活化的探针可包括靠近的荧光标记和淬灭部分以便淬灭来自标记的荧光。当探针被修剪或消化(通常通过扩增过程中聚合酶的5' -3'核酸外切酶活性)时，淬灭部分不再靠近荧光标记并且荧光增加。TaqMan探针是裂解活化的探针的实例。断裂淬灭的探针是其中荧光通过探针的断裂减少或改变的探针。断裂淬灭的探针可包括受体荧光标记和供体部分，以便当受体和供体靠近时，从供体至受体的荧光共振能量传递导致受体发荧光。因此探针是荧光的，例如当与靶序列杂交时。当探针被修剪或消化(通常通过扩增过程中聚合酶的5' -3'核酸外切酶活性)时，供体部分不再与受体荧光标记靠近并且来自受体的荧光减少。如果供体部分本身是荧光标记，当不与受体靠近时它可将能量释放为荧光(通常以与受体的荧光不同的波长)。然后总的影响是受体荧光的下降和供体荧光的增加。在断裂淬灭的探针的情况下的供体荧光相当于由断裂活化的探针产生的荧光，其中所述断裂活化的探针以受体作为淬灭部分和以供体作为荧光标记。可断裂的FRET(荧光共振能量传递)探针是断裂淬灭的探针的实例。荧光活化的探针是其中荧光通过探针与靶序列的杂交而增加或改变的探针或探针对。荧光活化的探针可包括受体荧光标记和供体部分以便当受体和供体靠近(当探针与靶序列杂交)时，从供体至受体的荧光共振能量传递导致受体发荧光。荧光活化的探针通常是探针对，其设计为与邻近序列杂交以便使受体和供体靠近。荧光活化的探针还可以是包含供体和受体两者的单一的探针，其中，当探针未与靶序列杂交时，供体和受体不靠近，但是当探针与靶序列杂交时供体和受体靠近。这可通过例如将供体和受体放置在探针的相反端并且当靶互补序列与靶序列中的毗邻序列互补时将靶互补序列放置在探针每一端来完成。如果荧光活化的探针的供体部分本身是荧光标记，它可将能量释放为荧光(通常以与受体的荧光不同的波长)，当不与受体靠近时(也就是说，当探针不与靶序列杂交时)。当探针与靶序列杂交时，那么总的影响将是供体荧光的减少和受体荧光的增加。FRET探针是荧光活化的探针的实例。茎淬灭引物是当不与来自茎结构(分子内茎结构或分子间茎结构)的互补序列杂交的引物，所述茎结构使荧光标记和淬灭部分靠近以便来自标记的荧光被淬灭。当所述引物与互补序列结合时，茎被破坏，淬灭部分不再与荧光标记靠近并且荧光增加。在所公开的方法中，茎淬灭的引物被用作用于核酸合成的引物并且因此被掺入合成或扩增的核酸中。茎淬灭的引物的实例是肽核酸淬灭的引物和发卡淬灭的引物。肽核酸淬灭的引物是与肽核酸淬灭剂或肽核酸荧光剂相关联以形成茎结构的引物。所述引物包含荧光标记或淬灭部分并且分别与肽核酸淬灭剂或肽核酸荧光剂相关联。当所述引物被复制时，肽核酸被代替，因此允许荧光标记产生荧光信号。发卡淬灭的引物是当不与来自发卡结构(并且通常地，环)的互补序列杂交的引物，所述发卡结构使得荧光标记和淬灭部分靠近以便来自标记的荧光被淬灭。当引物与互补序列结合时，茎被破坏，淬灭部分不再与荧光标记靠近并且荧光增加。发卡淬灭引物通常用作用于核酸合成的引物并因此被掺入合成或扩增的核酸中。发卡淬灭引物的实例是Amplifluor 弓|物禾口 scorpion 弓|物。
断裂活化的引物与断裂活化的探针相似，除了它们是被掺入所复制的链并且然后被断裂的引物之外。标记为了帮助检测和定量使用所公开的方法产生的核酸，标记可直接掺入核苷酸和核酸中或与检测分子(例如探针和引物)偶联。如本文所用的，标记是可直接或间接与核苷酸或核酸相关联并且产生直接或间接地可测量的、可检测的信号的任何分子。用于掺入核苷酸或核酸或与核酸探针偶联的许多这样的标记是本领域的那些技术人员已知的。适于在所公开的方法中使用的标记的实例是放射性同位素、荧光分子、发磷光的分子、酶、抗体和配偶体。荧光标记，尤其是在荧光变化探针和引物的情况中，用于扩增的实时检测。适合的荧光标记的实例包括异硫氰酸荧光素(FITC)、5，6_羧甲基荧光素、德克萨斯红、硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、罗丹明、氨基-甲基香豆素(AMCA)、曙红、赤藓红、BODIPY , CASCADE BLUE 、OREGON GREEN 、芘、丽丝胺、氧杂蒽、吖啶、噁嗪、藻红蛋白、镧系离子的大环螯合物例如quantum dye 、荧光能量传递染料例如噻唑橙-乙啡啶异二聚体和花青染料Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5和Cy7。其它的特异性荧光标记的实例包括3-羟基芘5，8，10-三磺酸、5-羟基色胺(5-HT)、酸性品红、茜素络合酮、茜素红、别藻蓝蛋白、氨基香豆素、蒽基硬脂酸酯、Astrazon艳红4G、Astrazon橙R、Astrazon红6B、Astrazon 黄 7GLL、Atabrine、金胺、Aurophosphine、Aurophosphine G、BAO 9 ( 二氨基苯基噁二唑)、BCECF、硫酸黄连素、二苯甲酰胺、布兰科福尔荧光增白剂(Blanc0ph0r)FHl溶液、布兰科福尔荧光增白剂 SV、BODIPY Fl、Brilliant Sulphoflavin FF、Calcien 蓝、钙绿、卡尔科弗卢尔(Calcofluor) Rw溶液、卡尔科弗卢尔白、Calcophor白ABT溶液、Calcophor白标准溶液、喹诺酮(Carbostyryl)、Cascade黄、儿茶酚胺、奎纳克林(Chinacrine)、科里磷化氢 O (Coriphosphine 0)、香豆素鬼笔环肽、CY3. 18、CY5. 18、CY7、Dans (1-二甲氨基萘5磺酸)、Dansa (萘基氨基磺酸)、丹酰基NH-CH3、二氨基苯基噁二唑(Diamino PhenylOxydiazole) (DAO)、二甲基氨基-5-磺酸、二化硼络合二吡咯甲川(DipyrrometheneboronDifluoride)、联苯亮吖啶黄素7GFF、多巴胺、赤藓红ITC、吖啶橙、FIF(甲醛诱导荧光)、Flazo 橙、Fluo3、荧光胺、Fura-2、Genacryl 艳红 B、Genacryl 艳黄 10GF、Genacryl 粉 3G、Genacryl黄5GF、Gloxalic酸、粒状蓝、血卟啉、Indo-U Intrawhite CF液体、雷可福荧光增白剂(LeucophoiOPAF、雷可福荧光增白剂SF、雷可福荧光增白剂WS、丽丝胺罗丹明B200(RD200)、荧光黄(Lucifer Yellow) CH、荧光黄 VS、萘红(Magdala Red)、Marina 蓝、Maxilon艳黄素10GFF、Maxilon艳黄素8GFF、MPS(甲基绿焦宁均二苯乙烯)、光神霉素、NBD胺、Nitrobenzoxadidole、去甲肾上腺素、核固红、核黄、Nylosan艳黄素E8G、噁二唑、Pacific (Feulgen) >Phorwite AR Phorwite BKL>Phorwite Rev>PhorwiteRPA、磷化氢3R、酞菁、藻红蛋白R、藻红蛋白B、聚氮杂茚烯Pontochrome蓝黑、吓啉、樱草灵(Primuline)、普施安黄(Procion Yellow)、焦宁(Pyronine)、焦宁 B、Pyrozal 艳黄素 7GF、氮芥喹吖因(Quinacrine Mustard)、罗丹明123、罗丹明5GLD、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明B 200、罗丹明B Extra、若丹明BB、罗丹明BG、若丹明WT、5-羟色胺、Sevron艳红2B、Sevron艳红4G、Sevron艳红B、Sevron橙、Sevron黄L、SITS (樱草灵)、SITS (均二苯乙烯异硫代磺酸)、均二苯乙烯、Snarf 1、磺基罗丹明B Can C、磺基罗丹明G Extra、四环素、噻嗪红R、硫磺素(Thioflavin) S、硫磺素 TCN、硫磺素 5、Thiolyte、Thiozol 橙、TinopolCBS、真蓝、UltraLite、荧光素钠 B、Uvitex SFC、二甲苯橙和 XRITC。这些荧光剂中的一些的吸收和发射最高值分别是FITC (490nm ；520nm)、Cy3 (554nm ；568nm)、Cy3. 5 (58Inm ；588nm)、Cy5 (652nm :672nm)、Cy5. 5 (682nm ；703nm)禾口Cy7 (755nm ；778nm)，因此允许它们同时检测。荧光素染料的其它实例包括6-羧基荧光素(6-FAM)、2，，4，，l，4-四氯荧光素(TET)、2，，4，，5，，7‘，1，4-六氯荧光素(HEX)、2，，7，-二甲氧基-4’，5’ - 二氯-6-羧基罗丹明(几幻、2’-氯-5’-氟-7’，8’融合苯基_1，4_ 二氯-6-羧基荧光素(NED)和2’ -氯7’ -苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)。荧光标记可从多种商业来源获得，包括Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ ；MolecularProbes, Eugene, OR 禾口 Research Organics, Cleveland, Ohio。所感兴趣的另外的标记包括仅当与它们相关联的探针与靶分子特异性结合时为信号提供的那些，其中这些标记包括Tyagi &Kramer,Nature Biotechnology (1996) 14 :303和EP 0070685B1中描述的“分子信标”。感兴趣的其它标记包括美国专利第5，563，037号中描述的那些，其通过引用的方式并入本文。标记的核苷酸是可在合成期间直接掺入扩增产物的标记的形式。可掺入扩增的核酸的标记的实例包括核苷酸类似物，例如BrdUrd、氨基烯丙基脱氧尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、溴尿核苷和用生物素或用适合的半抗原例如异羟基洋地黄毒甙(digoxygenin)修饰的核苷酸。适合的荧光标记的核苷酸是荧光素-异硫氰酸-dUTP、花青-3-dUTP和花青-5-dUTP。用于DNA的核苷酸类似物标记的一个实例是BrdUrd(溴脱氧尿苷，BrdUrd, BrdU, BUdR,Sigma-Aldrich Co)。用于将标记掺入DNA的核苷酸类似物的另一个实例是AA-dUTP (氨基烯丙基-脱氧尿苷三磷酸酯，Sigma-Aldrich Co.)和5_甲基-dCTP (Roche MolecularBiochemicals)。用于将标记掺入RNA的核苷酸类似物的一个实例是生物素-16-UTP (生物素-16尿苷-5，三磷酸酯，Roche Molecular Biochemicals)。荧光素、Cy3和Cy5可连接至dUTP以便直接标记。Cy3. 5和Cy7可作为用于生物素或异羟基洋地黄毒甙标记的探针的二级检测的抗生物素蛋白或抗异羟基洋地黄毒甙偶联物获得。被掺入所扩增的核酸的标记，例如生物素，可随后使用本领域中熟知的灵敏的方法检测。例如，生物素可使用链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物(Tropix，he.)来检测，所述链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物与生物素结合并且随后通过适合的底物(例如化学发光底物CSPD :3-(4-甲氧基螺-[1，2，-氧杂环丁烷-3-2，-(5，-氯)三环[3. 3. 1. I3'7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠，Tropixdnc.)的化学发光来检测。标记还可以是酶，例如可用化学信号扩增或通过使用产生光的酶的底物(例如，化学发光的1，2_氧杂环丁烷底物)或荧光信号检测的酶，例如碱性磷酸酶、大豆过氧化物酶、辣根过氧化物酶和聚合酶。结合这些标记中的两种或更多种的分子也被认为是标记。已知标记中的任一种可与所公开的探针、标签和方法一起使用，以标记并检测使用本公开的方法扩增的核酸。用于检测和测量由标记所产生的信号的方法对本领域的那些技术人员也是已知的。例如，放射性同位素可通过闪烁计数法或直接观察来检测；荧光分子可用荧光分光光度计来检测；发磷光的分子可用分光光度计检测或用照相机直接观察；酶可通过由所述酶催化的反应的产物的检测或观察来检测；抗体可通过检测与抗体偶联的二级标记来检测。如本文所用的，检测分子是与扩增的核酸相互作用并且与一种或多种标记偶联的分子。
应当理解并且本文涵盖了通过与对照样本比较评估特定mRNA或mRNA的表达的增加是否已经发生或者特定mRNA是否存在的一种方法。因此，本文涵盖了诊断受治疗者中癌症的方法，所述方法包括用来自受治疗者的组织样本的mRNA进行RT-PCR或PCR反应；其中逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)包括能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种正向引物；其中扩增产物的量相对于对照的增加表明ALK相关癌症的存在；并且其中所获得的对照组织是非癌组织。还应当理解的是就ALK相关癌症而言，可利用非癌组织对照的使用但是这不是必须的，因为也可使用来自非ALK相关癌症的癌组织。因此，本文公开了诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症，包括对来自受治疗者的组织样本的mRNA进行RT-PCR反应；其中逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)包括能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种正向引物；并且其中扩增产物的量相对于对照的增加表明ALK相关癌症的存在；并且其中对照组织获自非ALK相关癌的组织。所公开的方法可用于诊断本文称为“癌症”的其中发生不受控的细胞增殖的任何疾病。不同类型的ALK相关癌症的非限制性列表如下淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、白血病、癌、实体组织的癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、高分级神经胶质瘤(highgrade glioma)、胚细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑素瘤、腺瘤、缺氧肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关淋巴瘤或肉瘤、转移癌症或一般的癌症。本文公开的方法可用来诊断的癌症的代表性但是非限制性的列表如下淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、霍奇金氏病、骨髓性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌症、头部和颈部癌、头部和颈部的鳞状细胞癌、肾癌、肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、成神经细胞瘤/成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔、咽喉、喉头癌和肺的鳞状细胞癌、结肠癌、子宫颈癌、宫颈癌、乳腺癌、上皮癌、肾癌，泌尿生殖癌、肺癌、食管癌、头颈癌、大肠癌、造血癌、睾丸癌、结肠和直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。因此，本文公开了诊断癌症的方法，其中所述癌症选自由下列组成的组非小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、全身性组织细胞增生症、乳腺癌、结肠直肠癌、食管鳞状细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤和炎性成肌纤维细胞瘤(IMT)。例如，本文公开了诊断受治疗者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的方法，所述方法包括用来自受治疗者的组织样本的mRNA进行RT-PCR或PCR反应；其中逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)包括能与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种正向引物；其中扩增产物的量相对于对照的增加表明ALK相关癌症的存在，并且其中癌选自由下列组成的组非小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、全身性组织细胞增生症、乳腺癌、结肠直肠癌、食管鳞状细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤和炎性成肌纤维细胞瘤(IMT)。 评估ALK定向治疗的适应性的方法尽管不希望受到现有理论的束缚，但是据信用小分子药物候选物抑制这些形式的ALK基因消除了相关异常的细胞增殖并且促进了成神经细胞瘤和其它ALK相关肿瘤细胞系中的细胞凋亡；而且使用这些抑制剂的临床前的动物模型和早期临床试验都表明ALK小分子抑制剂不仅具有显著的抗ALK相关癌症的抗肿瘤活性，而且还对于非限制性靶标相关的毒性耐受非常好。这些发现强调了对用于ALK突变的专门的诊断测试的需要。例如，这样的测定可被用来筛选受到遗传性成神经细胞瘤侵袭的家族的中的儿童以帮助促进在肿瘤更易于治疗的较早的时期检测肿瘤。相应地，本文公开了在受治疗者中评估用于癌症的ALK抑制剂治疗的适应性的方法，所述方法包括测量来自受治疗者的组织样本的mRNA ；其中ALK序列mRNA的量相对于对照的增加表明可用ALK抑制剂治疗的癌症。应当理解并且本文涵盖了本文公开的mRNA测量技术中的任一种可用于这些方法。因此，例如，本文公开了在受治疗者中评估用于癌症的ALK抑制剂治疗的适应性的方法，所述方法包括用来自受治疗者的组织样本的mRNA进行RT-PCR反应或用来自受治疗者的组织样本的DNA进行PCR反应；其中所述RT-PCR反应包括能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种正向引物；并且其中扩增产物的量相对于对照的增加表明可用ALK抑制剂治疗的癌症。还应当理解的是所公开的方法可还包括本文所公开的引物中的任一个并且利用所公开的多重PCR技术。诊断从ALK的点突变发展的ALK相关癌症的方法和评估对ALK抑制剂的抗性的方法。ALK相关癌症的治疗之后影响检测微小残留疾病(MRD)的随后的治疗决策的预后重要性和关联性可通过高敏感性并容易进行的诊断测定(例如本文建议的那些)来增强。临床前研究已经鉴定了赋予对小分子抑制剂(例如NVP-TAE684和PF-2341066)的抗性的ALK激酶结构域点突变的谱。以它们用于预测赋予对抑制剂(例如现在已经被临床使用许多年的Gleevec)的抗性的突变的用途为基础，这些测定已知对临床相关抑制剂抗性突变是高预测性的。本公开内容包括用于灵敏且特异的ALK诊断测定的方法和组合物，所述方法和组合物可用于选择性指导并靶向对患者的药物治疗。用于未知突变的许多扫描技术可被用于本文公开的方法中，例如变性高效液相层析(dHPLC)、碱基切除序列扫描(BESS)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、构象敏感凝胶电泳(CSGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度凝胶电泳(TTGE)、由断裂酶消化产生的片段长度多态性(CFLP)、错配的化学断裂、错配的酶裂解和错配修复酶。在一个方面，本文公开了使用板交换延伸反应(TEER )技术鉴定与ALK基因相关的单核苷酸或其它突变变化以检测ALK中的致癌突变或赋予ALK相关癌症以药物抗性的突变的方法。TEER 技术可鉴定存在于早期和药物抗性ALK癌症两者中的这些ALK突变，包括甚至罕见和新型的突变。TEER技术描述于美国专利第6，610，486号、美国专利第6，150，105号和美国申请第12/152，512号，将它们对核苷酸变异的检测的教导的全部内容通过引用的方式并入本文。本文公开的检测ALK相关核酸变异的方法具有许多用途，包括但不限于疾病或病症例如癌症的存在的检测或诊断、评估对与核酸变异相关的疾病或病况的敏感性或风险，监测疾病进展以及确定对治疗性处理的敏感性或抗性。应当理解并且本文涵盖了存在相同类型的突变之间(即两个点突变之间或两个EML4-ALK融合之间)存在差异的情况。因此，应当理解的是所公开的诊断癌症或评估治疗的敏感性的方法中的任一种可还包括对得自所述方法的任何扩增子进行测序。筛选的方法本文公开的ALK融合和点突变是癌症治疗的靶标。因此，本文公开了筛选在受治疗者中抑制ALK相关癌症的药剂的方法，所述方法包括
a)从患有ALK相关癌症的受治疗者获得组织样本；b)使所述组织样本与所述药剂接触c)从所述组织样本提取mRNA ；d)对来自所述组织样本的mRNA进行RT-PCR反应；其中RT-PCR反应包括能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种正向引物；并且其中扩增产物的量相对于未处理对照的降低表明可治疗ALK相关癌症的药剂。核酸所公开的方法和组合物利用不同的核酸。通常任何核酸可用于所公开的方法中。例如，可在所期望的分析和有待被获得或评估的信息的基础上选择所公开的目标核酸和所公开的参照核酸。所公开的方法还产生新的和变化的核酸。这些核酸的性质和结构将通过在所述方法中生产和处理它们的方式来确定。因此，例如，在所公开的方法中产生延伸产物和杂交核酸。如本文所使用的，杂交核酸是延伸产物和第二种核酸的杂交物。应当理解并且本文涵盖了目标核酸可以是期望确定核苷酸变异存在或不存在的任何核酸。因此，例如，目标核酸可包括与参照核酸的野生型序列相对应的序列。本文还公开了所公开的方法可在第一核酸是参照核酸而第二核酸是目标核酸或者第一核酸是目标核酸而第二核酸是参照核酸时进行。应当理解并且本文涵盖了参照核酸可以是目标核酸有待与其比较的任何核酸。通常，参照核酸具有已知序列(和/或已知具有作为参照的目标序列)。尽管不需要，但是如果参照序列与目标核酸具有已知的或猜测的近亲关系是有用的。例如，如果期望检测单一的核苷酸变异，那么可有用地选择参照序列为与目标核酸同源或接近匹配的序列，例如来源于来自相同或相关器官或个体的相同基因或遗传成分的核酸。因此，例如，本文涵盖了参照核酸可包含野生型序列或可选择地可包含已知突变，包括例如存在或不存在与疾病或对治疗性处理的抗性相关的突变。因此，例如，涵盖了所公开的方法可用于通过将目标核酸与包含野生型序列(即已知不具有突变)的参照核酸比较并且检查目标核酸中变异的存在或不存在来检测或诊断目标核酸中已知突变的存在，其中变异不存在表明突变不存在。可选择地，参照核酸可具有已知突变。因此，例如，涵盖了所公开的方法可用于通过将目标核酸与包含表明对疾病的敏感性的已知突变的参考核酸比较并检查突变存在或不存在来检测对疾病或病况的敏感性，其中突变的存在表明疾病。本文中，术语“核苷酸变异”是指目标核酸的核苷酸序列中相对于参照核酸的核苷酸序列的任何变化或差异。因此，当参照核酸和目标核酸(或其补体，如上下文中适用的)之间的序列不同时称发生核苷酸变异。因此，例如，将核酸中特定位置的腺嘌呤(A)取代为鸟嘌呤(G)将是核苷酸变异，条件是参照核酸在相应的位置包含A。应当理解并且本文涵盖了变异的确定是以参照核酸为基础的并且不表明序列是否为野生型的。因此，例如，当具有已知突变的核酸被用作参照核酸时，不具有突变的核酸(包括野生型核酸)将被认为具有核苷酸变异(相对于参照核酸)。核苷酸所公开的方法和组合物利用不同的核苷酸。在整个这一应用和本文公开的方法中，提及核苷酸的碱基的类型。应当理解并且本文涵盖了当提及碱基的类型时，是指在核酸链中的核苷酸中的能够与一组确定的规范碱基中的一个或多个杂交(结合)的碱基。因此，例如，当提及在三种类型的核酸酶抗性核苷酸存在的情况下但不在包含与修饰的核苷酸的相同类型的碱基的核苷酸存在的情况下延伸的延伸产物时，是指如果例如修饰的核苷酸的碱基是腺嘌呤(A)，那么核酸酶抗性的核苷酸可以是例如鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。这些碱基(其代表四种规范碱基)中的每一种能够与四种规范碱基中的不同的一种杂交并且因此每种限定为如本文定义的不同类型的碱基。作为另一个实例，肌苷碱基主要与腺嘌呤和胞嘧啶(在DNA中)配对并且因此可被认为是与腺嘌呤和胞嘧啶(分别与胸腺嘧啶和鸟嘌呤碱基配对)不同类型的碱基但与鸟嘌呤或胸腺嘧啶(分别与胞嘧啶和腺嘌呤配对)不是不同类型的碱基，因为鸟嘌呤和胸腺嘧啶的碱基配对与肌苷的杂交样式重叠(也就是说，不是不同的)。任何类型的修饰的或可选择的碱基可用于所公开的方法和组合物中，通常仅受到用来使用这些碱基的酶的能力的限制。许多修饰的和可选择的核苷酸和碱基是已知的，其中的某些描述于下文和本文的其它地方。这些修饰的和可选择的碱基代表的碱基的类型可通过如本文描述的这一碱基的碱基配对的模式来确定。因此，例如，如果修饰的核苷酸是腺嘌呤，主要与胸腺嘧啶碱基配对的任何类似物、衍生物、修饰物或变体碱基将被认为是与腺嘌呤相同类型的碱基。换句话说，只要类似物、衍生物、修饰物或变体具有与另一种碱基相同模式的碱基配对，那么其可被认为是相同类型的碱基。可对核苷酸的糖或磷酸基团进行修饰。通常这些修饰将不改变碱基的碱基配对模式。然而，核酸链中的核苷酸的碱基配对模式确定核苷酸中碱基的碱基类型。在所公开的方法中有待掺入延伸产物并且通过所公开的药剂选择性除去的修饰的核苷酸可以是如本文其它地方所描述的如在所公开的方法中所需要发挥作用的任何修饰的核苷酸。修饰的核苷酸还可在现有的核酸链例如延伸产物中产生，通过例如化学修饰、酶修饰或组合。许多类型的核酸酶抗性的核苷酸是已知的并且可用于所公开的方法中。例如，核苷酸具有修饰的磷酸基团和/或修饰的糖基可抗一种或多种核酸酶。核酸酶抗性在本文中定义为对通过任何一种或多种核酸酶从核酸中除去的抗性。通常，特定的核苷酸的核酸酶抗性根据相关核酸酶定义。因此，例如，如果特定的核酸酶用于所公开的方法中，核酸酶抗性核苷酸仅需要对那种特定核酸酶有抗性。有用的核酸酶抗性核苷酸的实例包括硫代修饰的核苷酸和硼烷修饰的(borano-modified)核苷酸。有本文公开的基于核酸的多种分子。在本文中讨论了这些和其它分子的非限制性实例。应当理解的是例如，核苷酸是包含碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可通过它们的磷酸部分和糖部分产生核苷间键合而连接在一起。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(腺嘌呤，A)、胞嘧啶-1-基(胞嘧啶，C)、鸟嘌呤-9-基(鸟嘌呤，G)、尿嘧啶-1-基(尿嘧啶，U)和胸腺嘧啶-1-基(胸腺嘧啶，T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五价磷酸。核苷酸的非限制性实例是3’-AMP(3’ -单磷酸腺苷)或5’ _GMP(5’ -单磷酸鸟核苷)。核苷酸类似物是包含对碱基、糖或磷酸部分的某些类型的修饰的核苷酸。对碱基部分的修饰将包括A、C、G和T/U以及不同的嘌呤或嘧啶碱基(例如尿嘧啶-5-基(Ψ)、次黄嘌呤-9-基(肌苷，I)和2-氨基腺嘌呤-9-基)的天然和合成修饰。修饰的碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C) ；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其它的8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代特别是5-溴代、5-三氟代甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。另外的碱基修饰可在例如美国专利第3，687，808号中找到，该专利对于碱基修饰的教导的全部内容以引入的方式并入本文。某些核苷酸类似物例如5-取代嘧啶；6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶可增加双链形成的稳定性。碱基修饰常常可与例如糖修饰(诸如2’ -0-甲氧基乙基)组合以获得独特的特性，例如增加的双链稳定性。有许多美国专利例如 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273,5, 367，066,5, 432，272、5，457，187,5，459，255,5，484，908,5，502，177,5，525，711,5，552，540,5，587，469,5，594，121,5, 596，091、5，614，617和5，681，941详述并且描述了一定范围内的碱基修饰。这些专利中的每一个都通过弓I用的方式并入本文。核苷酸类似物还可包括糖部分的修饰。对糖部分的修饰将包括核糖和脱氧核糖的天然修饰以及合成修饰。糖修饰包括但不限于2’位置的下列修饰0H ；F ；0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或0-烷基-0-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的Cl至ClO烷基或C2至ClO烯基和炔基。2，糖修饰还包括但不限于-0 [ (CH2)n0]mCH3、-0(CH2)n0CH3、-0(CH2)nNH2、-0(CH2)nCH3、-0 (CH2)n_0NH2 和-0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中η和m是从1至约10。2’位置的其它修饰包括但不限于C1至Cltl低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的硅烷基、RNA断裂基团、报告基团、嵌入剂、用于提高寡核苷酸的药代动力学的基团或用于提高寡核苷酸的药效学特性的基团以及具有相似特性的其它基团。相似的修饰还可位于糖上的其它位置，特别是3’端核苷酸上或2’ 5’连接的寡核苷酸中的糖的3’位置和5’端核苷酸的5’位置。修饰的糖还包括在桥连的环氧处含有修饰(例如012和幻的那些。核苷酸糖类似物还可具有糖拟物，例如取代戊呋喃糖基糖的环丁基部分。有许多教导这些修饰的糖结构的制备的美国专利，例如 4，981, 957,5, 118，800、5，319，080、5，359, 044,5, 393, 878,5, 446, 137、5，466，786,5，514，785,5，519，134,5，567，811,5，576，427,5，591，722,5，597，909,5，610，300,5, 627，053,5, 639，873,5, 646，265,5, 658，873,5, 670，633 和 5，700，920，每个专利的全部内容都通过引用的方式并入本文。核苷酸类似物还可在磷酸部分被修饰。修饰的磷酸部分包括但不限于可被修饰以便两个核苷酸之间的键合包含硫代磷酸、手性硫代磷酸、二硫代磷酸、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3’亚烃基磷酸和手性磷酸的甲基和其它烷基磷酸、亚磷酸、包括3’氨基磷酰胺和氨基烷基磷酰胺的磷酰胺、硫羰磷酰胺、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸的那些。应当理解的是两个核苷酸之间的这些磷酸或修饰的磷酸键合可是通过3’-5’键合或2’ -5’键合的并且所述键合可包含倒转的极性，例如3’ -5’至5’ -3’或2’ -5’至5’ -2’。同样包括各种盐、混合盐和游离酸形式。许多美国专利教导如何制备并使用包含修饰的磷酸的核苷酸并且包括但不限于3，687，808,4, 469，863,4, 476，301,5, 023，243、5，177，196,5, 188，897,5, 264，423,5, 276，019,5, 278，302,5, 286，717,5, 321，131、5，399，676,5，405，939,5，453，496,5，455，233,5，466，677,5，476，925,5，519，126,5，536，821,5, 541，306,5, 550，111,5, 563，253,5, 571，799,5, 587，361 和 5，625，050，其每一个通过引用的方式并入本文。应当理解的是核苷酸类似物仅需要包含单一的修饰，但是也可以在所述部分中的一个中或不同部分之间包含多个修饰。核苷酸取代是与核苷酸具有相似功能特性，但是其不包含磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸取代是将以沃森-克里克或Hoogsteen形式识别核酸，但是通过除了磷酸部分之外的部分连接在一起的分子。核苷酸取代当与适合的靶核酸反应时能够与双螺旋类型的结构相一致。核苷酸取代是已经具有代替的磷酸部分和/或糖部分的核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸取代不包含标准的磷原子。对磷酸的取代可以是例如短链烷基或环烷基核苷酸间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键合或者一种或多种短链杂原子或杂环的核苷酸间键合。这些包括具有吗啉代键合(部分从核苷酸的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架、甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基(thioformacetyl)骨架、；亚甲基甲酰乙酰基(mehthylene fomacetyl)和硫代甲酰乙酰基骨架；包含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基胼基骨架；磺酸酯和苯磺酰胺骨架；酰胺骨架和具有混合的N、0、S和CH2组成部分的其它的那些。许多美国专利公开了如何制备并使用这些类型的磷酸替代并且包括但不限于5，034，506,5, 166，315,5, 185，444,5, 214，134、
5，216，141、5，235，033、5，264，562、5，264，564、5，405，938、5，434，257、5，466，677、5，470，967、5，489，677、5，541，307、5，561，225、5，596，086、5，602，240、5，610，289、5，602，240、5，608，046、5，610，289、5，618，704、5，623，070、5，663，312、5，633，360、
5，677，437和5，677，439，其每一个通过引用的方式并入本文。核苷酸取代中还应当理解的是核苷酸中的糖和磷酸部分两者都可由例如酰胺类型的键合(氨基乙基甘氨酸)(PNA)代替。美国专禾Ij 5，539，082,5, 714，331和5，719，262教导如何制备并使用PNA分子，其每一个通过引用的方式并入本文。将其它类型的分子(偶联物)与核苷酸或核苷酸类似连接也是可能的。可将偶联物化学连接至核苷酸或核苷酸类似物。这些偶联物包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分；胆酸；硫醚，例如己烷基-S-三苯甲基硫醇；硫代胆固醇；脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基；磷脂，例如双十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1，2-二-0-十六烷基-rac-甘油-3-H-磷酸酯；聚胺或聚乙二醇链；或金刚烷乙酸；棕榈基部分或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。许多美国专利教导这些偶联物的制备并且包括但不限于美国专利第 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、
5，578，717,5,580，731,5，580，731,5，591，584,5，109，124,5,118，802,5，138，045、5，414，077,5，486，603,5，512，439,5，578，718,5,608，046,4，587，044,4，605，735、4，667，025,4，762，779,4,789，737,4，824，941,4，835，263,4，876，335,4，904，582、4，958，013、5，082，830、5，112，963、5，214，136,5,082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022、5，254，469、5，258，506、5，262，536,5,272，250、5，292，873、5，317，098、5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463,5，510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552、5，567，810、5，574，142、5，585，481,5，587，371、5，595，726、5，597，696、
5，599，923,5, 599，928和5，688，941号，其每一个通过引用的方式并入本文。沃森-克里克相互作用是与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代的沃森-克里克面(Watson-Crick face)的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代的沃森-克里克面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代的C2、m和C6位置和基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代的C2、N3、C4位置。Hoogsteen相互作用是在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面(Hoogsteenface)处发生的相互作用，其在双链DNA的大沟中暴露。Hoogsteen面包括嘌呤核苷酸的N7位置以及C6位置处的反应基团(NH2或0)。杂交/选择性杂交术语杂交通常意指在至少两个核酸分子(例如引物或者探针和基因)之间的序列驱使的相互作用。序列驱使的相互作用意指在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间以核苷酸特异性方式发生的相互作用。例如，G与C相互作用或A与T相互作用是序列驱使的相互作用。通常序列驱使的相互作用在核苷酸的沃森-克里克面或Hoogsteen面上发生。两个核酸的杂交受到本领域技术人员已知的许多条件和参数的影响。例如，反应的盐浓度、PH和温度都影响两个核酸分子将是否杂交。两个核酸分子之间的选择性杂交的参数是本领域那些技术人员熟知的。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件可被定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格性受到杂交和洗涤步骤中的任一个或两者的温度和盐浓度两者的控制。例如，实现选择性杂交的杂交条件可包括在高离子强度溶液(6X SSC或6X SSPE)中以低于Tm(—半的分子从它们的杂交配偶体解离的解链温度)约12-25°C的温度的杂交以及之后在选择以便洗涤温度是低于Tm约5°C至20°C的温度和盐浓度的组合清洗。在其中固定在过滤器上的参照DNA的样本与目标标记的核酸杂交并且之后在不同严格性的条件下洗涤的预实验中很容易凭经验确定温度和盐条件。对DNA-RNA和RNA-RNA杂交来说杂交温度通常较高。可如上文所描述使用所述条件以达到严格性或如本领域已知的使用所述条件。DNA:DNA杂交的优选的严格杂交条件可以是以约68°C (在水溶液中)在6X SSC或6X SSPE中，之后在68°C下洗涤。如果需要，杂交和洗涤的严格性可相应降低，因为所期望的互补程度降低，并且还取决于寻找可变性的任何区域中的G-C或A-T的丰度。同样，如果需要，杂交和洗涤的严格性可相应增加，因为所期望的同源性增加，并且取决于期望高同源性的任何区域中的G-C或A-T的丰度，全部如本领域中已知的。定义选择性杂交的另一种方法是通过查看核酸中的一种与其它核酸结合的量(百分比)。例如，在一些实施方案中，选择性杂交条件将是当至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100百分比的限定的核酸与非限定的核酸结合时。通常，非限定的引物是例如10或100或1000倍过量的。这一类型的测定可在如下的条件下进行，其中限定和非限定的引物低于它们的kd例如10倍或100倍或1000倍，或其中仅核酸分子中的一种是10倍或100倍或1000倍或其中一种或两种核酸分子都在它们的kd之上。定义选择性杂交的另一种方法是通过查看在需要杂交以促进所期望的酶处理的条件下得到酶处理的引物的百分比。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件将是当至少约 60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100百分比的引物在促进酶处理条件下被酶处理时，例如如果酶处理是DNA延伸，那么选择性杂交的条件将是当至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 百分比的引物分子被延伸时。条件还包括由制造商提出的或在本领域中当对进行处理的酶适合时指出的那些。正如就同源性而言，应当理解的是有用于确定两种核酸分子之间杂交水平的本文公开的不同的方法。应当理解的是这些方法和条件可提供两种核酸分子之间不同百分比的杂交，但是除非以另外的方式指出满足所述方法中的任一个的参数将是足够的。例如，如果需要80%的杂交并且只要杂交在这些方法中的任何一种中需要的参数内发生，那么它被认为公开于本文。应当理解的是本领域中的那些技术人员理解，如果组合物或方法满足共同或单一地确定杂交的这些标准中的任何一种，那么它是本文公开的组合物或方法。试剂盒本文公开了被引至可用于实践本文公开的方法的试剂的试剂盒。具体而言，所述试剂盒可包括本文讨论的或将被理解为是在所公开的方法的实践中需要或有益的任何试剂或试剂的组合。例如，试剂盒可包括本文公开的一种或多种引物以进行在所述方法的某些实施方案中讨论的延伸、复制和扩增反应，以及如所期望的使用所述引物所需要的缓冲液和酶。应当理解的是为了检测ALK相关的融合，可使用与野生型ALK杂交的反向引物。因此，本文公开了包括至少一种反向引物的试剂盒，其中所述反向引物与野生型ALK的一部分(例如野生型ALK的激酶结构域)杂交。可在所公开的试剂盒中使用的反向引物的实例包括但不限于 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ IDNO 56和SEQ ID NO :57。此外，应当理解的是本文公开的试剂盒可包括与ALK的融合配偶体或野生型ALK特异性杂交的一种或多种正向引物。因此，例如所述正向引物可与野生型ALK、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、网格蛋白重链(CLTC)、Ran 结合蛋白 2 (RANBP2)、SEC31L1、原肌球蛋白-3 (TPM3)、原肌球蛋白 _4(TPM4)、TRK融合基因(大)(TFGl)、TRK融合基因(小)(TFGs)、CARS、AL017、膜突蛋白(MSN)、非肌肉肌球蛋白重链基因(MYH9)或TRK融合基因(特大MTFG5J杂交。可用于本文公开的试剂盒的正向引物的非限制性列表包括但不限于SEQ ID NO 2,SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5,SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO 39,SEQ ID NO40,SEQ ID NO41,SEQ ID NO 42,SEQ ID NO43,SEQ ID NO:44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ IDNO 52,SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 54、SEQ ID N0:55 禾口 SEQ ID NO :59。本领域的技术人员可以理解具有包含多于一种的单数引物对并且可包括例如单一反向引物(例如SEQ ID NO7)和多个反向引物的试剂盒是适合的。因此，本文特别涵盖了包括与野生型ALK、5-氨基咪唑_4_甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、网格蛋白重链(CLTC)、Ran结合蛋白2(RANBP2)、SEC31L1、原肌球蛋白_3 (TPM3)、原肌球蛋白_4 (TPM4)、TRK融合基因(大)(TFGl)、TRK融合基因(小)(TFGs)、CARS、AL017、膜突蛋白(MSN)、非肌肉肌球蛋白重链基因(MYH9)或TRK融合基因(特大MTFG5J杂交的一种或多种正向引物和至少一种反向引物的试剂盒，其中反向引物是野生型ALK反向引物例如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO 57 和 SEQ ID NO :58。应当理解的是所公开的试剂盒还可包括对照以确保本文所公开的方法可适当地起作用并且将测定之间的结果归一化。因此，例如本文公开了阳性cDNA对照，阴性cDNA对照和对照引物对。例如，所公开的试剂盒可包括对照引物对，其用于检测人类ATP合酶、H+的运输、线粒体Fl复合物、0亚单位(ATP50)、编码线粒体蛋白mRNA的核基因；人类NADH脱氢酶(泛醌)1 α亚复合物2，8kDa(NDUFA》，mRNA ；人类甘油醛_3_磷酸脱氢酶(GAPDH)，mRNA;人类H3组蛋白，家族3A (H3F3A)，mRNA ；人类蛋白酶体(前体，巨蛋白因子(macropain))亚单位，β型，4(PSMB4)，mRNA;人类核糖体蛋白S27a (RPS27A)，转录变体1，mRNA ；人类真核细胞翻译起始因子4A，同种型2(EIF4A》，mRNA ；人类核糖体蛋白L18(RPL18)，mRAN ；人类腺苷脱氨酶，RNA特异的(ADAR)，转录变体1，mRNA ；或人类细胞色素c氧化酶亚单位Vb (C0X5B)，mRNA。引物对的实例包括但不限于表1中的引物对。表 权利要求
1.一种诊断间变性淋巴瘤激酶(ALK)相关癌症的方法，所述方法包括检测来自所述受治疗者的组织样本的与核酸变异、截短或ALK融合相关的核酸的存在或测量来自所述受治疗者的组织样本的与核酸变异、截短或ALK融合相关的核酸的量；其中扩增产物或标记的探针的量相对于对照的增加表明ALK相关癌症的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸通过经由对所述样本进行第一逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测量mRNA水平来测量。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸通过微阵列来测量。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述RT-PCR反应或微阵列包括使用能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种或多种正向引物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述反向引物结合ALK。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述反向引物是SEQID NO :7、SEQ ID NO :32、SEQID NO 46, SEQ IDNO 47, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 57 或 SEQ ID NO :58。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述至少一种或多种正向引物与野生型々!^、驱动蛋白-1重链基因(KIF5B)、5_氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、网格蛋白重链(CLTC)、Ran结合蛋白2 (RANBP2)、SEC31L1、原肌球蛋白-3 (TPM3)、原肌球蛋白-4 (TPM4)、TRK 融合基因(大)(TFGl)、TRK 融合基因(小)(TFGs)、CARS、AL017、膜突蛋白(MSN)、非肌肉肌球蛋白重链基因(MYH9)或TRK融合基因(特大)(TFGa)杂交。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述至少一种或多种正向引物包括选自由下列组成的组的至少一种正向引物:SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQID NO 6,SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID N0:51、SEQ ID NO 52, SEQ ID NO:53、SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55 禾口 SEQ ID NO :59。
9.如权利要求8所述的方法，所述方法包括两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或更多种、十二种或更多种、十三种或更多种、十四种或更多种或者十五种或更多种正向引物。
10.如权利要求4所述的方法，其中所述微阵列还包括使用选自由下列组成的组的一种或多种探针SEQ ID NO :8,SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12,SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ IDNO :24, SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQID NO 30 或 SEQ ID NO :31。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由下列组成的组成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、恶性组织细胞增生症和成胶质细胞瘤。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症是成神经细胞瘤，其具有选自由下列组成的组的一个或多个 ALK 相关点突变V476A、M1166R、A1168P、I1171N、F1174I、F1174L、R1192P、F1245C、F1245V、F1245L、F1245I、I1250T 和 R1275Q。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌，其具有选自由R401Q、A1168P和V757M组成的组的一个或多个ALK相关点突变。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症是具有ALK相关点突变的乳腺癌，并且其中所述点突变是L560F。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症是具有ALK相关点突变的卵巢癌，并且其中所述点突变是A877S。
16.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括使用模板交换和延伸反应(TEER)检测来自所述组织样本的所述核酸变异、截短或ALK融合的存在。
17.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括第二RT-PCR反应，其中所述第二RT-PCR反应包括使用能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和能够与野生型ALK特异性杂交的至少一种或多种正向引物。
18.如权利要求17所述的方法，所述方法还包括第三RT-PCR，其中所述第三RT-PCR反应包括与ALK的激酶结构域的ALK序列5’和3’特异性杂交的正向和反向引物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述正向引物中的至少一种与棘皮动物微管相关类蛋白4(EML4)或核磷蛋白(NPM)特异性杂交。
20.一种检测ALK激酶的失调的存在的方法，所述方法包括从受治疗者获得组织样本，检测一种或多种ALK融合物的存在或不存在、检测野生型ALK的存在或不存在和检测ALK的所述激酶结构域的存在或不存在。
21.如权利要求20所述的方法，其中所癌症选自由下列组成的组成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、恶性组织细胞增生症和成胶质细胞瘤。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症是成神经细胞瘤，其具有选自由下列组成的组的一个或多个 ALK 相关点突变V476A、M1166R、A1168P、I1171N、F1174I、F1174L、R1192P、F1245C、F1245V、F1245L、F1245I、I1250T 和 R1275Q。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌，其具有选自由R401Q、A1168P和V757M组成的组的一个或多个ALK相关点突变。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症是具有ALK相关点突变的乳腺癌，并且其中所述点突变是L560F。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症是具有ALK相关点突变的卵巢癌，并且其中所述点突变是A877S。
26.如权利要求20所述的方法，其中通过RT-PCR或微阵列检测所述ALK多核苷酸或由所述多核苷酸编码的多肽。
27.如权利要求沈所述的方法，其中所述RT-PCR反应或微阵列包括使用能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和能够与已知的ALK融合配偶体特异性杂交的至少一种或多种正向引物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述反向引物是SEQID NO. 7、SEQ ID NO :32、SEQID NO :46, SEQ IDNO 47, SEQ ID NO 56、SEQ ID NO 57 或 SEQ ID NO :58。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述ALK融合配偶体选自由下列组成的组5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、驱动蛋白-1重链基因(KIF5B)、网格蛋白重链(CLTC)、Ran结合蛋白2 (RANBP2)、SEC31L1、原肌球蛋白-3 (TPM3)、原肌球蛋白-4(TPM4)、TRK融合基因(大)(TFGl)、TRK融合基因(小)(TFGs)、CARS、AL017、膜突蛋白(MSN)、非肌肉肌球蛋白重链基因(MYH9)或TRK融合基因(特大)(TFGa)。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述至少一种或多种正向引物包括选自由下列组成的组的至少一种正向引物SEQ ID NO :2,SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQID NO :6,SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQID NO :40, SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :48, SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :50, SEQ ID N0:51、SEQ ID NO :52, SEQ ID NO:53 和 SEQ ID NO :59。
31.如权利要求沈所述的方法，其中所述RT-PCR反应或微阵列包括使用能够与野生型ALK特异性杂交的正向和反向引物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述正向引物选自由SEQID NO 33, SEQ ID NO:54和SEQ ID NO :55组成的组。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述反向引物选自由SEQID N0. 7、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO :46、SEQ IDNO :47、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57 或 SEQ ID NO :58 组成的组。
34.如权利要求沈所述的方法，其中所述RT-PCR反应或微阵列包括使用能够与ALK激酶结构域特异性杂交的正向和反向引物。
35.如权利要求31所述的方法，其中所述正向引物选自由SEQID N0:45和SEQ ID N0:48组成的组。
36.如权利要求31所述的方法，其中所述反向引物选自由SEQID N0. 7、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO :46、SEQ IDNO :47、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57 或 SEQ ID NO :58 组成的组。
37.一种筛选抑制受治疗者中ALK相关癌症的药剂的方法，所述方法包括a)从患有ALK相关癌症的受治疗者获得组织样本；b)使所述组织样本与所述药剂接触；c)从所述组织样本提取mRNA；d)对来自所述组织样本的mRNA进行RT-PCR反应；其中所述RT-PCR反应包括能够与一种或多种ALK序列特异性杂交的反向引物和至少一种正向引物；并且其中扩增产物的量相对于未处理的对照的降低表明可抑制ALK相关癌症的药剂。
38.一种用于诊断ALK相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包括(a)用第一检测试剂标记的第一引物，其中所述第一引物是反向引物，其中所述反向引物是与编码SEQ ID N0:1的氨基酸序列的第一核苷酸或其补体杂交的一种或多种多核苷酸；和(b)至少一种第二引物，其中所述第二引物是正向引物，其中所述正向引物是与第二多核苷酸杂交的一种或多种多核苷酸，所述第二多核苷酸编码5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、驱动蛋白-1重链基因(KIF5B)、网格蛋白重链(CLTC)、Ran结合蛋白2 (RANBP2)、SEC31L1、原肌球蛋白-3 (TPM3)、原肌球蛋白_4 (TPM4)、TRK融合基因(大)(TFGj、TRK融合基因(小)(TFGs)、CARS、AL017、膜突蛋白(MSN)、非肌肉肌球蛋白重链基因(MYH9)、TRK融合基因(特大)(TFGa)、棘皮动物微管相关类蛋白4(EML4)或核磷蛋白(NPM)。
39.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述反向引物是SEQID NO :7、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 56、SEQ ID NO 57 或 SEQ ID NO :58。
40.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述至少一种或多种正向引物包括选自由下列组成的组的至少一种正向引物:SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ IDNO :45、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQID NO :53、SEQ ID NO 55 和 SEQ ID NO :59。
41.如权利要求38所述的试剂盒，所述试剂盒包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种或更多种正向引物，所述正向引物与5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶(ATIC)、驱动蛋白-1重链基因(KIF5B)、网格蛋白重链(CLTC)、Ran结合蛋白2 (RANBP2)、SEC31L1、原肌球蛋白-3 (TPM3)、原肌球蛋白-4 (TPM4)、TRK融合基因(大)(TFGl)、TRK融合基因(小)(TFGs)、CARS、AL017、膜突蛋白(MSN)、非肌肉肌球蛋白重链基因(MYH9)、TRK融合基因(特大)(Tre5J、棘皮动物微管相关类蛋白4(EML4)或核磷蛋白(NPM)中的一个或多个特异性杂交。
42.如权利要求38所述的试剂盒，所述试剂盒还包括与野生型ALK特异性杂交的正向引物。
43.如权利要求42所述的试剂盒，其中所述正向引物选自由SEQID NO 33、SEQ ID NO54和SEQ ID NO 55组成的组。
44.如权利要求38所述的试剂盒，所述试剂盒还包括与所述ALK激酶结构域特异性杂交的正向引物。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述正向引物选自由SEQID NO 45和SEQ IDNO 48组成的组。
46.如权利要求38所述的试剂盒，所述试剂盒还包括对照引物对。
47.如权利要求46所述的试剂盒，其中所述对照引物对与C0X5B特异性杂交。
48.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述第一和第二引物分别用第一和第二检测试齐Ll标记ο
全文摘要
公开了用于检测受治疗者中癌症的存在和评估对于其的治疗功效的方法和组合物。所公开的方法使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和多重聚合酶链式反应技术以及模板交换延伸反应(TEER)以检测间变性淋巴瘤激酶的点突变、截短或融合的存在。
文档编号C12Q1/68GK102575287SQ201080031440
公开日2012年7月11日 申请日期2010年5月17日 优先权日2009年5月15日
发明者E·达尔豪泽, 乔希·尼克尔斯, 吉姆·诺曼, 大卫·豪特 申请人:因赛特遗传学公司