专利名称：使用重组酵母菌株从葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖发酵生产乙醇的制作方法
技术领域：
本发明涉及混合糖发酵，尤其是包含葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的糖组合物的发酵。糖组合物可源自木质纤维素材料。
背景技术：
作为化石燃料的替代品生产的大部分乙醇目前来自于对玉米淀粉和基于甘蔗的蔗糖的发酵。为了达成生产可更新燃料的宏伟目标，已开发了新的技术，用于将非食物生物质转化成发酵产物，例如乙醇。Saccharomyces cerevisiae是乙醇工业中所选择的生物，但是其不利用生物质原料的半纤维素组分中含有的五碳糖。半纤维素可占生物质的20-30%， 其中木糖和阿拉伯糖是最丰量的C5糖。木糖异构酶(XI)的异源表达是使得酵母细胞能够代谢和发酵木糖的一种选择。类似地，细菌基因araA、araB和araD在S. cerevisiae菌株中的表达导致阿拉伯糖的利用和高效的醇发酵。半乳糖是C6糖，其也是通常存在于木质纤维素中的糖，就经济上的原因而言通常其含量(总糖的 4%)不会被忽略。J. van den Brink et al，Microbiology Q009) 155，1340-1350 公开了葡萄糖是 Saccharomyces cerevisiae偏好的碳源，并且从葡萄糖受限的发酵条件转换为缺氧条件下半乳糖过量的条件后，半乳糖不被消耗。迄今为止尚无公开在使用葡萄糖或一种或多种C5糖的相同方法中将半乳糖转化成发酵产物的方法。因此，本发明的一个目的是提供在使用葡萄糖和一种或多种C5糖的相同方法中将半乳糖转化成发酵产物的方法。
发明内容
本发明提供了从糖组合物生产一种或多种发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤a)在存在属于 Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、 Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces 或 Yarrowia 属的酵母时， 发酵糖组合物；和b)回收发酵产物，其中所述酵母包含基因araA、araB和araD，并且所述糖组合物包含葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。有利地，所述糖，葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖被转化成发酵产物。优选地，混合的糖细胞是Saccharomyces属，更优选地是Saccharomyces cerevisiae。本发明还涉及基因araA、araB和araD赋予葡萄糖发酵菌株在存在阿拉伯糖时以厌氧形式发酵半乳糖的能力的用途，所述用途通过这些基因的表达来实现。
图1展示了质粒pPWT006的物理图谱。图2展示了质粒pPWT018的物理图谱。图3展示了 Southern印迹放射自显影图。用EcoRI和HindIII 二者消化野生型菌株CEN. PK113-7D (泳道1)和BIE104A2 (泳道2)的染色体DNA。将印迹与特异性的SIT2-探针杂交。图4展示了野生型SIT2-基因座(图a)的物理图谱，和通过质粒pPWT018的整合引入ara-基因后，之后进行分子内重组，导致载体和可选择标记物序列的丢失(图b)。指示出了探针的杂交。图5展示了质粒pPWT080的物理图谱，其序列在SEQ ID no. 4.中给出。图6展示了野生型GRE3-基因座的物理图谱(图a)和GRE3-基因座中PWT080的单拷贝整合(图b，展示引物结合处，图c，展示RKIl-探针结合处)。图7展示了 GRE3-基因座的物理图谱，其中GRE3-基因的编码区被PPP-基因TALl、 TKLl、RKI1和RPEl的整合代替。图a展示了引物SEQID 5和6结合处，图b展示了 RKIl-探针结合处。图8展示了不同培养基上BIE104P1A2在需氧条件下的生长曲线。在YNB 2%半乳糖上预培养菌株BIE104A2P1。生长曲线在2 %半乳糖和1 %阿拉伯糖上开始，之后是在图中由数字(1)标注的事件转移至含2%阿拉伯糖作为唯一碳源的YNB上。达到高于1的OD 600后，将培养物转移至具有0.2的起始OD 600的新鲜培养基上。在纯阿拉伯糖培养基上转移三次后，将得到的菌株命名为BIE104P1A2C。图9展示了在2%阿拉伯糖作为唯一碳源的YNB上，BIE104PlA2c在厌氧条件下的生长曲线。达到高于1的OD 600后，将培养物转移至具有0. 2的起始OD 600的新鲜培养基上。若干次转移后，将得到的菌株命名为BIE104PlA2d( = BIE201)。图10展示了在合成的玉米纤维模型培养基上，BIE104的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过跟踪培养物的光密度来监测生长。预培养物在2%葡萄糖上培养。图11展示了在合成的玉米纤维模型培养基上，BIE104P1A2C的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过跟踪培养物的光密度来监测生长。预培养物在2%葡萄糖上培养。图12展示了在合成的玉米纤维模型培养基上，BIE201的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过跟踪培养物的光密度来监测生长。预培养物在2%葡萄糖上培养。图13展示了在合成的玉米纤维模型培养基上，BIE104A2的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过跟踪培养物的光密度来监测生长。预培养物在2%葡萄糖上培养。图14展示了在合成的玉米纤维模型培养基上，BIE105A2的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过跟踪培养物的光密度来监测生长。预培养物在2%葡萄糖上培养。图15展示了质粒pPWT007的物理图谱。图16展示了质粒pPWT042的物理图谱。图17展示了野生型SIT4-基因座的物理图谱(图a)，和SIT4-基因座中PWT080 的单拷贝整合(图b，展示引物结合处)。图18展示了不同培养基上菌株BIE104A2P1Y9的生长曲线的图示。图a 在葡萄糖上培养的菌株BIE104A2P1Y9，之后是在图中通过数字(1)指出的事件转移至阿拉伯糖+1%木糖，和通过数字(2)指出的事件转移至2%木糖+0.2%阿拉伯糖。图b:在半乳糖上培养的菌株BIE104A2P1Y9，之后是(1)转移至1 %阿拉伯糖+1 %木糖，和(2)转移至 2%木糖+0.2%阿拉伯糖。图19展示了菌株BIE104A2P1Y9在补充有2%木糖的Verduyn培养基上的生长。 测试了两个独立的菌落。在达到2的OD 600后，将菌株转移至新鲜培养基，并立即开始在木糖上再次培养。图20展示了质粒pGBS416ARAABD的物理图谱。序列表说明SEQ ID NO 1 展示了来自 Bacteroides uniformis ATCC 8492 的野生型木糖异构酶序列。Genbank 登记号 AAYH02000036。SEQ ID NO 2展示了源自SEQ ID NO 1的经密码子优化的序列。SEQ ID NO :3 展示了来自 Bacteroides uniformis ATCC 8492 的木糖异构酶的氨
基酸序列。SEQ ID NO 4 展示了质粒 pPWT080 的序列。SEQ ID NO 5展示了正向引物的序列。SEQ ID NO :6展示了反向引物的序列。SEQ ID NO 7展示了用于诊断性PCR的正向多功能引物的序列。SEQ ID NO 8展示了用于诊断性PCR的反向多功能引物的序列。SEQ ID NO :9展示了正向引物RKIl-探针的序列。SEQ ID NO 10展示了反向引物RKIl-探针的序列。SEQ ID NO 11展示了正向引物kanMX-盒的序列。SEQ ID NO 12展示了反向引物kanMX-盒的序列。SEQ ID NO :13展示了正向引物的序列。SEQ ID NO :14展示了反向引物的序列。SEQ ID NO 15展示了用于诊断性PCR的正向多功能引物的序列。SEQ ID NO 16展示了用于诊断性PCR的反向多功能引物的序列。SEQ ID NO 17 展示了质粒 pPWT018 的序列。SEQ ID NO 18展示了正向引物整合pPWT018的序列。SEQ ID NO 19展示了反向引物整合pPWT018的序列。SEQ ID NO :20展示了正向引物SIT2-探针的序列。SEQ ID NO :21展示了反向引物SIT2-探针的序列。SEQ ID NO :22展示了扩增araABD表达盒的正向引物的序列。SEQ ID NO :23展示了扩增araABD表达盒的反向引物的序列。发明详述在本说明书和附带的权利要求书中，词语“包含”和“包括”及其变体如“包含”(〃 comprises"，‘‘ comprising")、“包括”(〃 includes" and" including")应被解释为包含在内。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未明确指出的其它元素或整数。冠词“一个”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一个或多于一个(即一个或至少一个)所述冠词的语法客体。例如，“一个元件”可表示一个元件或多于一个元件。本文所述的本发明的多个实施方案可以交叉组合。糖组合物根据本发明的糖组合物包含葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖。在本发明的方法中，糖葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖有利地被转化成发酵产物。在本发明中可以使用满足这些标准的任何糖组合物。在一个优选的实施方案中， 糖组合物是一种或多种木质纤维素材料的水解产物。此处木质纤维素包括半纤维素和生物质的半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可存在于以下列表中果园底料，树丛，磨坊废弃物，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸， 黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，燕麦壳，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆， 玉米芯，玉米壳，柳枝稷，芒草，高粱，芸苔茎，大豆茎，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海藻，树木，软木材，硬木材，白杨，松树，灌木丛，草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米棒，玉米粒，来自玉米粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料， 农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米壳，能源作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，燕麦壳，硬木材或软木材， 由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多的组合。表1中给出了源自木质纤维素的一些合适的糖组合物及其水解产物的糖组合物的概况。所列出的木质纤维素包括玉米芯、玉米纤维、稻壳、瓜皮(melon shells)、甜菜浆、 小麦秸、甘蔗渣、木材、草和橄榄压制物(olive pressings) 0表1 来自木质纤维素材料的糖组合物的概况。Gal =半乳糖，Xyl =木糖，Ara = 阿拉伯糖，Man =甘露糖，Glu =谷氨酸盐/酯，Iiham =鼠李糖。给出了半乳糖百分比(％ Gal)和文献来源。
权利要求
1.用于从糖组合物生产一种或多种发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤a)在存在属于 Saccharomyces、 Kluyveromyces、 Candida、 Pichia、 Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces 或 Yarrowia 属的酵母时发酵糖组合物；和b)回收发酵产物，其中所述酵母包含基因araA、araB和araD，并且所述糖组合物包含葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖，葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖被转化成发酵产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种发酵产物是乙醇。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述糖组合物通过如下方式从木质纤维素材料生产a)预处理一种或多种木质纤维素材料，以生产经预处理的木质纤维素材料；b)对所述经预处理的木质纤维素材料进行酶处理，以生产所述糖组合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中混合的糖细胞属于Mccharomyces属。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述混合的糖细胞是Saccharomyces Cerevisiae0
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述混合的糖细胞包含醛糖还原酶基因的缺失。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中发酵在厌氧或氧受限的条件下进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述混合的糖细胞包含被过表达的 PPP-基因 TALI、TKLl、RPEl 和 RKI1。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述混合的糖细胞包含xylA-基因和 /或XKSl-基因。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中以下述方式将所述基因引入所述混合的糖细胞中向宿主细胞中引入a)处于强启动子控制下的由PPP-基因TALI、TKLl、RPEl和RKIl构成的簇，b)由二者均处于组成型启动子控制下的xylA-基因和XKSl-基因构成的簇，c)由基因araA、araB和araD构成的簇，和/或，XKSl-基因和xylA-基因的簇； 禾口d)醛糖还原酶基因的缺失，并对所述混合糖构建体进行适应性进化，以生产所述混合糖细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述宿主细胞是抑制剂抗性细胞。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述宿主细胞是工业菌株。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述发酵产物选自由以下组成的组乙醇，正丁醇，异丁醇，乳酸，3-羟基-丙酸，丙烯酸，乙酸，琥拍酸，富马酸，苹果酸，衣康酸，马来酸，柠檬酸，己二酸，氨基酸例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，·1，3-丙二醇，乙烯，甘油，β-内酰胺抗生素和头孢菌素，维生素，药物，动物饲料补充剂，特种化学品，化学原料，塑料，溶剂，燃料包括生物燃料和沼气或有机聚合物，和工业酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂合酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。
15.基因araA、araB和araD向下述葡萄糖发酵酵母赋予下述能力的用途，所述能力是在耗尽葡萄糖后、在存在阿拉伯糖时以厌氧方式发酵半乳糖的能力，所述用途通过这些基因的表达来实现，所述葡萄糖发酵酵母属于Saccharomyces、Kluyveromyces, Candida、 Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces 或 Yarrowia 属。
全文摘要
本发明涉及用于从糖组合物生产一种或多种发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤a)在存在属于Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces或Yarrowia属的酵母时，发酵糖组合物；和b)回收发酵产物，其中所述酵母包含基因araA、araB和araD，并且所述糖组合物包含葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。
文档编号C12P7/10GK102482688SQ201080031239
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月6日 优先权日2009年7月10日
发明者保罗·克莱斯森, 吉斯博蒂娜·皮特奈拉·苏勒库姆·范, 威廉默斯·西奥多瑞斯·安东尼厄斯·玛丽亚·拉特·德, 尼古勒特·贾斯明·布罗尔斯, 比安卡·伊丽莎白·玛丽亚·吉勒森, 贝蒂·韦德曼恩 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司