专利名称：用于自身免疫疾病早期检测的生物标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于自身免疫疾病诊断和治疗的组合物和方法。
背景技术：
自身免疫疾病产生于身体对正常存在于体内的物质和组织的过度免疫应答，其中身体实际攻击的是其自身细胞。免疫系统误认为身体的某些部分为病原体并攻击它。这可能限于某些组织(如甲状腺炎内)或涉及不同位置的特定组织(如古德帕斯丘疾病，其可能影响肺和肾中的基底膜)。自身免疫疾病的治疗通常采用免疫抑制——降低免疫应答的药物治疗。自身免疫疾病的机理尚未充分阐明，且治疗选择有限。自身免疫疾病的例子包括乳糜泻、I型糖尿病(IDDM)、全身性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合症、Churg-Strauss综合症、桥本甲状腺炎、格雷夫症、原发性血小板减少性紫癜以及类风湿性关节炎(RA)。斯耶格伦综合症(SjS)是慢性自身免疫炎性疾病，其特征为淋巴细胞浸润以及泪腺(LG)和唾液腺(SG)机能的破坏。SjS可以独立地发生(原发性SjS)或与另ー种免疫疾病结合(续发性SjS);两种形式都可能发展为其他器官的全身性疾病。在原发性SjS和续发性SjS中，眼表干燥、角膜刺激和增加的感染易感性症状与一般干燥性角膜結膜炎(KCS)的症状重叠。尽管此潜在的独特的疾病谱可能通过原发性SjS和续发性SjS患者的泪液中得到证明，但是泪液生物标记作为任ー形式的诊断方法还未被建立。能够预测疾病严重性的泪液生物标记的确定与现有临床策略的结合在诊断方面是有价值的，这可能对针对SjS和其他自身免疫疾病的不同治疗选择和改善的疾病结果作出贡献。由于检测器的敏感性以及生物标记和检测试剂的稳定性是有限的样品尺寸和即使正常泪液的大量蛋白酶含量所赋予的重大挑战，因此开发针对泪液生物标记的替代的检测策略是有必要的。本发明满足了这ー需求也提供了相关优势。
发明内容
本发明的ー个方面提供检测哺乳动物是否可能患有自身免疫性疾病的方法，所述法包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成又或者由以下步骤组成在从哺乳动物中分离的泪液样品中测定选自 Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra> 1110、IllOra、1115、Tnfa或Lcn-2的至少ー种第一多肽和/或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶的至少ー种第二多肽的表达水平或活性水平，其中，与合适的对照相比，第一多肽的增加的表达水平或增加的活性水平，或者第二多肽的降低的表达水平或降低的活性水平，表明哺乳动物可能患有自身免疫疾病。在进ー步的方面中，所述方法排除了測定Apo-F的表达水平或活性水平。还提供ー种协助诊断哺乳动物自身免疫性疾病的方法，所述法包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成又或者由以下步骤组成从哺乳动物中分离的泪液样品中測定选自Ctss、Ctsh、Ctsr> Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra、1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F 或 Lcn-2 的至少ー种第一多肽和/或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶的至少ー种第二多肽的表达水平或活性水平，其中，与合适的对照相比，第一多肽的增加的表达水平或增加的活性水平，或者第二多肽降低的表达水平或降低的活性水平，表明对哺乳动物自身免疫疾病的可能地阳性诊断，从而协助诊断。在进ー步的方面中，所述方法排除了測定Apo-F的表达水平或活性水平。 进ー步提供一种诊断哺乳动物自身免疫疾病的相对严重性的方法，所述法包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成又或者由以下步骤组成从哺乳动物中分离的泪液样品中测定选自 Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra> 1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F或Lcn-2的至少ー种第一多肽和/或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶的至少ー种第ニ多肽的表达水平或活性水平，其中，与合适的对照相比,第一多肽的相对较高的表达水平或活性水平，或者第二多肽的相对较低的表达水平或活性水平，表明个体有相对更严重的自身免疫疾病。在进ー步的方面中，所述方法排除了測定Apo-F的表达水平或活性水平。在本发明方法的一些实施方案中，第一多肽为Ctss、Apo_F或Lcn-2中的一种或多种。在另ー个方面中，所述方法排除了測定Apo-F的达水平或活性水平。本发明的另一方面提供一种治疗患有自身免疫疾病或处于患自身免疫疾病风险中的哺乳动物的方法，所述哺乳动物被确定为需要通过以上提供的方法中的任一种来治疗，所述法包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成又或者由以下步骤组成向哺乳动物施用有效量的适宜疗法从而治疗所述哺乳动物。适宜疗法的非限制实例包括施用有效量的环孢菌素、西维美林、匹罗卡品、非留体抗炎药、皮质类固醇、免疫抑制药物或疾病缓解性抗风湿药物。在ー个方面中，所述哺乳动物为人患者。在另ー个方面中，本发明提供一种治疗患有自身免疫疾病或处于患自身免疫疾病风险中的哺乳动物的方法，所述法包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成又或者由以下步骤组成向哺乳动物施用有效量的抑制选自Ctss、Ctsh、Ctsr> Ctsw或Ctsz中的ー种或多种多肽表达或活性的药剂。在ー个方面中，所述多肽为Ctss。在一个实施方案中,所述哺乳动物为人患者。可通过本发明的方法诊断或治疗的自身免疫疾病包括但不限于乳糜泻、I型糖尿病(IDDM)、红斑狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合症、Churg-Strauss综合症、桥本甲状腺炎、格雷夫症、原发性血小板減少性紫癜、类风湿性关节炎(RA)、強直性脊椎炎、克隆氏病、皮肌炎、古德帕斯丘综合症、格林巴利综合症(GBS)、混合结缔组织疾病、多发性硬化症、重症肌无力、嗜眠病、寻常性天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病。
图IA至图ID描述了微阵列数据的证实以及通过对LG中来自NOD、NOD SCID和BALB/c小鼠的原位RT-PCR所进行的对所关注基因的展开性研究。NOD和BALB/c鼠的LG中不同表达的基因，通过微阵列分析表明，通过对来自12周NOD小鼠、匹配的BALB/c对照以及各图所示的更多的动物组的LG的原位RT -PCR证实了编码Ctsh、Ctss、Ctsz的和巨噬细胞生成的细胞因子。由于其相对不灵敏性而未被微阵列检测出的某些相关细胞因子在本研究中也进行了重新评价。每个反应进行三次平行试验。重复结果2-3次并用来自不同批次动物的RNA重复制备。使用设入ABI SDS 2. I软件的Λ Λ Ct研究公式对不同样品进行比较。12周大的雄性BALB/c鼠中所有基因的表达水平设为1.0，这些基因在剰余小鼠中的表达水平与12周大的雄性BALB/c鼠中基因的表达水平对比。图2A和图2B示出了来自不同小鼠种系的LG中不同部位的CATS的检测。将来自12周大的雄性NOD、NOD SCID和BALB/c小鼠LG的冷冻切片用山羊抗小鼠CATS多克隆抗体和大鼠抗CD68单克隆抗体培养，然后用适合的发色团共轭的ニ级抗体培养。切片用共聚焦荧光显微镜成像。全部图中细胞核用DAPI染色，肌动蛋白纤维用AleXaFluor647染色以描绘阳性信号的相对细胞位置。箭头指向LG周围区域中的CATS阳性细胞；箭号指向LG内部区域的CATS阳性细胞；空箭头指向腺体周围区域中的CATS阳性细胞和CD68阳性细胞；箭号指向腺体内部区域的CATS和⑶68双阳性细胞。标尺=IOym图3描述了来自NOD和NOD SCID小鼠LG腺泡细胞中的CATS蛋白质的重新分布。将来自12周大的雄性NOD、NOD SCID和BALB/c小鼠LG的冷冻切片用山羊抗小鼠CATS多克隆抗体和大鼠抗Lamp2单克隆抗体培养，然后用适合的发色团共轭的ニ级抗体培养。切片用共聚焦荧光显微镜成像。Lamp2富集的囊泡标记晚期内体/溶酶体。用DAPI标记细胞核，用Alexa Fluor647标记肌动蛋白纤维从而描绘祀标的相对位置。箭头指向CATS阳性区域；箭号指向lamp2阳性区域。标尺=10 μ m图4A和图4B示出了 NOD和BALB/c小鼠间LG的CATS丰度和活性对比。A :对比CATS的蛋白质丰度的蛋白质印迹法。LG溶解物由12周大的雄性NOD小鼠或相匹配的BALB/c小鼠制备。向11% SDS-聚丙烯酰胺凝胶的各个孔中各负载100 μ gLG溶解物。50 μ g的Raw264. 7细胞溶解物进行平行电泳作为阳性对照。将质蛋白转移到用山羊抗CATS多克隆抗体杂交的硝基纤维素膜上。两个平行制备的膜中的ー个用兔抗Rab3D抗体杂交作为负载对照；这种蛋白质在LG中高度富集。B:CATS活性分析。右=IOyg来自两种系的成对LG溶解物培养1、2和18小吋，并且以400/505nm的激发/发射波长下测定产物的荧光性。酶活性表达为荧光単元；误差标尺见SEM。左以所描述的方式进行分析，向反应中加入CATS抑制剂改变LG溶解物中酶的特异性。 图5A和图5B示出了 NOD和BALB/c小鼠间来自刺激的LG溶解物和泪液的CATS酶活性的対比。麻酔小鼠，按照在材料和方法部分中的描述用CCH刺激之后收集泪液。在图4中使用的特异性CATS抑制剂存在或不存在的情况下分析催化活性。A :受刺激腺中的CATS活性和基于成对比较法的平均倍数变化值。B :在成对的NOD和BALB/c小鼠间受刺激的LG和泪液中的CATD活性。误差描述SEM。
图6A到图6L示出了来自不同小鼠种系的LG中不同位置的CATH阳性细胞的检测。将来自12周大的雄性NOD、NOD SCID和BALB/c小鼠LG的冷冻切片用山羊抗CATH多克隆抗体和大鼠抗CD68单克隆抗体培养，然后用发色团共轭的ニ级抗体培养。切片用共聚焦荧光显微镜成像。在指明的柱中和重叠图像中独立地显示CATH和⑶68富集巨噬细胞标记。所有的图也被标记以检测细胞核(DAPI-标记)并且图A到图I还另外地针对肌动蛋白纤维标记。LG的实质组织和周围区域在图A到I中呈现，同时浸润病灶在图J到L中放大。箭头指向LG周围区域中的CATH和CD68双阳性细胞(C、F和I);箭号指向LG内部区域中(C、F和I)或浸润病灶中(L)的双阳性细胞。图a到图i具有相同的放大倍数，这些图的放大标尺为20μπι，如I所示。图J到图L具有相同的放大倍数，这些图的放大标尺为10 μ m,如L所示。
图7A和图7B描述了来自12周大的NOD和BALB/c小鼠的LG溶解物中CATH丰度和活性对比。A :对比蛋白丰度的蛋白质印迹法。将100 μ g的NOD小鼠LG中制备得到的溶解物(泳道I和4)，100 μ g的BALB/c小鼠LG中制备得到的溶解物(泳道2和5)，以及30 μ g的Raw264. 7细胞溶解物(泳道3和6)加载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。上图转移到硝基纤维素膜的蛋白质用有(1° +2°，泳道I到3)或没有(2°，泳道4到6)第一抗体的大鼠抗CATH单克隆抗体印迹，然后用IRDye 800-共轭的第二抗体(泳道1_6)印迹。下图剥离之后的同一膜用兔抗Rab3D多克隆抗体和ニ级抗体(1° +2°，泳道I到6)重新印迹，作为加载对照。主要的CATH带由箭号标出并对应27-28kD活性形式之一的单链和23-24kD另ー个活性形式的重链(与阳性对照共迁移)，以及可能在20kD出现蛋白水解的或截短的物质。这些带在NOD小鼠LG溶解物中最为富集。由于所有样品与山羊抗大鼠ニ级抗体(见泳道4-6)的非特异反应，泳道1-3中可见于特定23-24kD带之上的帯。标记的分子量暗示分子量标准的迁移。B :CATH活性分析。任一 10 μ g成对LG溶解物(η = 3)在不存在抑制剂(_抑制剂)或存在抑制剂(+抑制剂)的情况下用基质培养。标记“无溶解物”的样品为反应背景。将来自LG溶解物中的积聚的产物荧光測定2小时，活性为每10 yg溶解物的荧光单位(FU)。误差为土SEM且*，P < O. 05。图8Α示出了雄性NOD小鼠LG中CtsS免疫荧光增强，尤其在大SV中(箭号)；肌动蛋白，红色；标尺为10 μ m。图8B示出12周大的小鼠LG溶解物和泪液中的CtsS活性，表明在雄性NOD小鼠中显著增加(P <0.05)。抑制剂共同培养显示大部分活性被抑制，证实其是CtsS。图9显示，与年龄匹配的BALB/c小鼠LG相比，在12周大的雄性NOD小鼠的基底外侧膜以及附近或内腔区域中检测到升高強度的Lcn-2免疫荧光。肌动蛋白纤维和细胞核。标尺，10 μ m。图10示出了在从希尔默泪测试条洗脱到组织蛋白酶S测试缓冲液中以及处理成分析组织蛋白酶S之后用SDS-PAGE分离的人泪蛋白质。在图IOA中，人泪蛋白质在通过组织蛋白酶S分析处理后用SDS-PAGE分离。将蛋白质在I. 5mm厚的10%凝胶上电泳并用GelCode蓝色染色试剂(Pierce)染色。C =新鲜泪液，SjS =斯耶格伦症患者，N = 一般患者。LE =左眼，RE =右眼。分子量标记以kDa记。最大蛋白加载于姆个泳道上，因此质量因标记不同而不同。在图IOB中，新鲜人泪液(33mg，每个泳道)在O. 75mm厚的10%凝胶上用SDS-PAGE分离，并用GelCode蓝色染色试剂(Pierce)染色。患者2为SjS患者。患者1和3为无疾病正常患者。LE =左眼，RE =右眼。分子量标记以kDa记。图11为显示人泪中组织蛋白酶S的不同活性水平的柱状图，所述人泪液通过改进的希尔默测试方法收集到滤纸条上，然后洗脱并检测CatS活性和蛋白质。其活性值在不同性别间有差别。RE:右眼。LE:左眼。图12为显示一组临床样本中有最高组织蛋白酶S活性的中2/3被诊断患有斯耶格伦综合症或狼疮(用箭号标出)的分布曲线。图13为显示患有斯耶格伦综合症或狼疮的患者在具有最高组织蛋白酶S活性的患者中的分布柱状图。图14显示与其他患者相比，斯耶格伦综合症或狼疮患者的组织蛋白酶S活性水平更高。图15显示与患有其他疾病的患者相比，斯耶格伦综合症或狼疮患者的组织蛋白酶S活性水平更高。图16显示在女性患者中，具有最低希尔默值的患者中的CATS活性最高。图17显示在男性患者中，具有最低希尔默值的患者中的CATS活性最高。图18-图21显示在不同希尔默值范围的患者组中，女性和男性患者的CATS活性。图22-图25显示在不同希尔默值范围的患者组中，具体患者的CATS活性值。图26-图29显示不同年龄组的女性或男性患者的CATS活性。
具体实施例方式在本公开中，通过识别引用的方式引用了各种出版物、专利和公布的专利说明书。这些出版物、专利和公布的专利说明书的内容在此通过引用并入本公开以更充分地描述本发明相关的技术状态。除非另有说明，本发明的实施采用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。在例如以下出版物的文献中充分地阐述了此类技术。见如Sambrook Russell编，MOLECULAR CLONING ALAB0RAT0RY MANUAL,第三版(2001) ；the series CURRENT PROTOCOLS INM0LECULARBIOLOGY(F. M. Ausubel 等编(2007)) ；the series METHODS INENZYM0L0GY(AcademicPress,Inc.，Ν·Υ·) ；PCR I A PRACTICAL APPROACH(M. MacPherson等 IRL Press at OxfordUniversity Press (1991)) ；PCR 2 A PRACTICALAPPR0ACH(M. J. MacPherson, B. D. Hames 和G. R. Taylor 编(1995)) ；ANTIBODIES, ALAB0RAT0RY MANUAL(Harlow 和 Lane 编(1999))；CULTURE OF ANIMAL CELLS A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (R. I. Freshney 第
5版(2005)) ;0LIG0NUCLE0TIDE SYNTHESIS(M. J. Gait ed. (1984)) ;Mullis 等美国专利4, 683, 195 ；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(B. D. Hames&S. J. Higgins 编(1984)) ；NUCLEICACID HYBRIDIZATION(M. L. M. Anderson(1999)) ；TRANSCRIPTI0NAND TRANSLATION(B.D. Hames&S. J. Higgins 编(1984)) IMMOBILIZED CELLSAND ENZYMES (IRL Press(1986)) ;B. Perbal，A PRACTICAL ⑶IDE T0M0LECULAR CLONING(1984) ；GENE TRANSFERVECTORS FOR MAMMALIANCELLS(J. H. Miller 和 M. P. Calos 编(1987)Cold Spring HarborLaboratory) ；GENETRANSFER AND EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS(S. C. Makrides 编(2003))IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY(Mayer 和 walker编，Academic Press, London (1987)) ；WEIR ‘S HANDBOOK OFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY (L. A. Herzenberg 等编(1996))。定义在本文中所使用时，某些术语可以具有以下定义的意思。在说明书和权力要求书中使用时，除非上下文中清楚指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数形式。例如，术语“一个细胞”包括单个细胞和多个细胞，包括其混合物。在本文中使用时，术语“包括”指组合物和方法包括所列元素，但不排除其他元素。用于限定组合物和方法时，“基本上由.· ·组成”，指排除具有对组合物或方法的任何基本重要性的其他元素。“由...组成”指排除大于痕量的用于所要保护的组合物和基本方法步骤的其他成分。由这些过渡术语中的每个定义的实施方案在本发明范围内。相应地，方法和组合物可包括附加的步骤和组分(包括)或包括不重要的步骤和组合物(基本上由...组成)或仅指所提及的方法步骤或组合物(由...组成)。
所有的数值，如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，是变化⑴或(-)0. I增量的近似值。虽然未一直明确指出，但是应当理解，在所有数值前冠以术语“约”。术语“约”还包括除了“X”的较小增量还包括准确值“X”，如“X+0.1”或“X-0.1”。虽然未一直明确指出，但是应当理解，本文中所描述的试剂仅是示例性的并且它们的等同物是本领域已知的。如同本领域技术人员所理解的，对于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围包含任何和所有可能的子范围和其子范围的组合。任何所列范围可以容易地被认为是充分描述且能使相同的范围分解为至少同样的两等分、三等分、四等分、五等分、十等分等。作为非限定性的实例，本文讨论的各个范围能被容易地分解为下三分之一、中间三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还应当理解的是，所有诸如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等措辞包括所列数值并且是指可以随后被分解成如上讨论的子范围的范围。术语“抗原”是本领域所熟知的，并包括产生免疫性的物质。Ctss是抗原的实例。“天然”或“天然的”或“野生型”抗原为多肽、蛋白质或包含表位并已经从天然生物源分离的片段。其也可以特异地与抗原受体结合。在本文中使用时，“抗体”包括所有抗体以及任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括含有这样分子的任何蛋白质或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分。这些抗体的实例包括但不限于重链或轻链的互补性决定区(complementaritydetermining region,Q)R)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区(FR)或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分，它们中的任一种都可以并入本发明的抗体。在一个方面中，“生物活性”指通过ELISA或其他合适方法测定的抗体选择性地与其表位蛋白或其片段结合的能力。生物学等同抗体包括但不限于与参考抗体同样的表位结合的那些抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。术语“抗体”进一步包括其消化片段、特定部分、衍生物和变体，包括抗体模拟物或包括模拟抗体或特定片段或其部分的结构和/或功能的抗体的部分，包括单链抗体和其片段。包含在术语抗体的“抗原结合部分”范围内的抗体的结合片段的实例包括Fab片段，由VL,VH,CL和CH结构域组成的一价片段；F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫桥相连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、由VH域组成的dAb片段(Ward等(1989) Nature 341 544-546);以及分离的互补性决定区(CDR)。另外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但它们能够使用重组方法能够通过合成接头将它们连接，所述合成接头能够将它们形成单蛋白链，其中VL和VH区匹配形成一价分子(称为单链Fv(scFv))。Bird等(1988) Science242 :423-426 和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85 :5879_5883·单链抗体也包括在术语“抗体片段”中。任何如上所述的抗体片段均使用本领域技术人员已知的一般技术得到，并且以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性筛选所述片段。术语“表位”指 能够与抗体特异结合的蛋白质决定子。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子化学活性表面集合构成，且其通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者而不是后者的结合丧失。术语“抗体变体”指包括在除了小鼠之外的种系中产生的抗体，其也包括含有对抗体或片段的线性多肽序列译后修饰的抗体。其进一步完全包括人抗体。术语“抗体衍生物”指包括与如上定义的表位结合的并且其是本发明的天然单克隆抗体的修饰物或衍生物的分子。衍生物包括但不限于例如双特异性抗体、多特异性抗体、异种特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体、多特异性抗体、双链抗体、嵌合体、重组体和人化的。在本文中所使用的术语“人抗体”指包括源自人生殖系免疫球蛋白序列的具有可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如由体外随机或特定位点突变引发的突变或由体内体细胞突变引发的突变)。然而，本文所用术语“人抗体”指不包括源自其它哺乳动物种系如小鼠生殖细胞系的CDR序列接枝到人框架序列上的抗体。因此，在本文中所使用的术语“人抗体”是指基本上蛋白质的每一部分(例如⑶R、框架、Cl区、Ch结构域(如^^^^‘入铰链区、(VL、VII))都是基本上不产生免疫性的而只有较少的序列变化或变异的抗体。相似地，以灵长类动物(猴子、狒狒、大猩猩等)、啮齿动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等)和其它哺乳动物定名的抗体为这些种、亚属、属、亚科、科特定抗体定名。此外，嵌合抗体包括了如上的任何组合。相对于未修饰抗体，这样的改变或变异任选并优选地保持或减少了人体或其它种系的免疫原性。因此。人抗体与嵌合或人化抗体不同。应当指出的是，人抗体能够由能功能性地表达重组人免疫球蛋白(如重链和/或轻链)基因的非人动物细胞或原核细胞或真核细胞产生。此外，当人抗体为单链抗体时，其可含有天然的人抗体所没有的连接肽。例如Fv可含有如2至大约8个甘氨酸或其它氨基酸残基的连接肽，其连接重链的可变区和轻链的可变区。这样的连接肽被认为具有人源性。在本文中所使用时，如果人抗体是得自使用人免疫球蛋白序列的系统，如通过使携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫或通过筛选人免疫球蛋白基因库，则人抗体是“源自”特定的生殖细胞系序列。“源自”人生殖细胞系免疫球蛋白序列的人抗体就其自身而言可以通过对比人抗体氨基酸序列与人生殖细胞系免疫球蛋白氨基酸序列来识别。选择的人抗体氨基酸序列通常与人生殖细胞系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%相同，并且含有当与其他物种的生殖细胞系免疫球蛋白氨基酸序列(如鼠生殖细胞系序列)对比时将人抗体识别为人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体氨基酸序列与生殖细胞系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以是至少95 %或甚至至少96 %、97 %、98 %或99%相同。典型地，源自特定人生殖细胞系的人抗体与人生殖细胞系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比显示不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体与生殖细胞系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比可以显示不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或I个氨基酸的差异。 本文中所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”涉及单分子组合物的抗体分子的制备。单克隆抗体组合物对特定的表位表现出单一的结合特异性和亲和性。杂种细胞是一类实验室中由抗体生成淋巴细胞和非抗体生成肿瘤细胞融合物制备的细胞，所述肿瘤细胞通常为骨髓瘤或淋巴瘤。杂种细胞增殖并产生特定单克隆抗体的连续供给。“人单克隆抗体”涉及具有源自人生殖细胞系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的显示单一结合特异性的抗体。本文中所使用的术语“重组人抗体”包括了由重组方法制备、表达、生成或分离的所有人抗体，诸如从针对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(如小鼠)或由其制备的杂种细胞分离的抗体；从被转化成表达抗体的宿主细胞分离的抗体，如从转染瘤分离的抗体；从重组、组合人抗体库分离的抗体；以及通过其他涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列接合的方法制备、表达、生成或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人生殖细胞系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体可经历体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞突变)，并因此重组抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列是这样的序列，所述序列虽然源自人生殖细胞系VH和VL序列并与之相关，但是其可能不天然存在于体内人抗体生殖细胞系谱库内。本文中所使用的术语“同种型”涉及由重链恒定区基因编码的抗体种类(如IgM或IgGl)。当涉及基因产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可以在本文中互换地使用。“自身免疫疾病”指这样一种疾病，其产生于身体对通常存在于体内的物质和组织的过度免疫应答，其中身体实际上攻击的是其自身细胞。自身免疫疾病的例子包括但不限于乳糜泻、I型糖尿病(IDDM)、红斑狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合症、Churg-Strauss综合症、桥本甲状腺炎、格雷夫症、原发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊椎炎、克隆氏病、皮肌炎、古德帕斯丘综合症、格林巴利综合症(GBS)、混合结缔组织疾病、多发性硬化症、重症肌无力、嗜眠病、寻常性天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病。“Ctss”或“组织蛋白酶S”为肽酶Cl家族的成员，可以参与将抗原蛋白质降解为以MHC II级分子为代表的肽的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。编码的蛋白质可在肺泡巨噬细胞中宽泛的pH值范围内用作弹性蛋白酶。代表序列包括UniProtKB :P25774和EntrezGene 1520。“Ctsh”或”组织蛋白酶H”为在溶酶体蛋白质全面降解中发挥重要作用的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。其由二硫键连接的均来自单一蛋白前体的重链和轻链的二聚物组成。属于肽酶Cl蛋白质家族的编码的蛋白质可以用作氨肽酶和肽链内切酶。这一基因的增加表达与前列腺癌的恶性进展相关。代表序列包括UniProtKB P09668和EntrezGene :1512。“Ctsr”或“组织蛋白酶R”为溶酶体半胱氨酸蛋白酶并且是肽酶Cl家族成员。Ctsr被识别为候选肺肿瘤敏感性基因，所述基因通过自交小鼠中全部基因组相关分析识别。代表序列包括 UniProKB :Q9JLA9 和 GeneBank Protein ID NP 064680。“Ctsw”或“组织蛋白酶W”为肽酶Cl家 族成员，是在T细胞细胞溶解活性的机理或规则中可能有特定功能的半胱氨酸蛋白酶。编码的蛋白被发现与天然杀伤细胞和细胞毒性T细胞的内质网内的膜有关。这一基因的表达被白介素-2上调。代表序列包括UniPiOtKB P56202 和 Entrez Gene :1521。“Ctsz”或“组织蛋白酶Z”为溶酶体半胱氨酸蛋白酶并且是肽酶Cl家族的成员。其表现了羧基单肽酶和羧基二肽酶的活性。编码的蛋白也被称为组织蛋白酶X和组织蛋白酶P。这一基因在肿瘤细胞系和原发性肿瘤中普遍表达，且如本家族的其他成员一样，可能与肿瘤生成有关。代表序列包括UniProtKB :Q9UBR2和Entrez Gene :1522。“Ifng”或“干扰素Y ”是对于针对病毒和细胞内细菌感染的先天性及适应性免疫以及对于肿瘤控制而言的关键性细胞因子。异常的IFNG表达与大量自发炎症和自身免疫疾病相关。IFNG在免疫系统中的重要性部分地来自于其能够直接抑制病毒的复制，但是最主要是来自于其免疫刺激和免疫调节作用。IFNG主要由天然杀伤(NK)细胞、作为先天免疫应答的一部分的天然杀伤T(NKT)细胞以及当抗原特异的免疫发展时由CD4和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应器T细胞产生。代表序列包括UniProtKB P01579和EntrezGene :3458。“I16ra”或“白介素6受体α亚族”为调节细胞生长和分化并且在免疫应答中起重要作用的有力的多效细胞因子。这一基因编码的蛋白质为IL6受体复合物的亚族。IL6受体为由这种蛋白质和白介素6信号转导因子(IL6ST/GP13O/IL6-0)组成的蛋白质复合物，受体亚族还被许多其它的细胞因子共同具有。IL6和这种受体的异常调节生成被认为与许多疾病如多发性骨髓瘤、自身免疫性疾病和前列腺癌的发病机理有关。已经报道了编码独特同型体的可选地结合转录变体。代表序列包括UniProtKB P08887和EntrezGene 3570。“1110”或“白介素10”为主要由单核细胞生成以及在更小的程度下由淋巴细胞生成的细胞因子。这种细胞因子在免疫调节和炎症方面具有多种作用。其下调Thl细胞因子、MHC II级Ags和共刺激分子在巨噬细胞上的表达。其还提高B细胞存活、增殖和抗体生成。这种细胞因子能阻断NF-κ B活性，并且和JAK-STAT信号通路的调节有关。小鼠敲除研究表明了这种细胞因子发挥小肠道中必要的免疫调节子的功能。代表序列包括UniPiOtKB P22301 和 Entrez Gene :3586。“IllOra”或“白介素10受体α ”为白介素10受体。这种蛋白与干扰素受体结构上相关。其显示出对白介素10免疫抑制信号的介导，且因此抑制促炎因子的合成。这种受体被报道通过胰岛素受体基质-2/ΡΙ3-激酶/AKT通道促进骨髓原始细胞的存活。这种受体的激活导致JAKl和ΤΥΚ2激酶的酪氨酸磷酸化。代表序列包括UniProtKB Q13651和Entrez Gene :3587。“1115”或“白介素15”为调节T细胞和天然杀伤细胞激活和增殖的细胞因子。这种细胞因子和白介素2具有很多相同的生物活性。它们被发现与普通促红细胞生成素受体亚族结合，并可能为相同受体竞争，并因此消极地调节彼此的活性。CD8+记忆细胞的数量被证明通过这种细胞因子与IL2的平衡来控制。这种细胞因子诱导JAK激酶的激活以及转录活化因子STAT3、STAT5和STAT6的磷酸化和活化。小鼠匹配物研究表明这种细胞因子可能通过STAT6的转录激活活性可以增加细胞凋亡抑制剂BCL2Ll/BCL-x(L)的表达，从而阻止细胞凋亡。已经报道了编码相同蛋白质的这种基因的两个可选择地结合转录变体。代表序列包括 UniProtKB P40933 和 Entrez Gene :3600。 "TNFa或Tnfa”或“肿瘤坏死因子α ”为属于肿瘤坏死因子(TNF)总科的多功能促炎因子。这种因子主要由巨噬细胞分泌。其能与其受体TNFRSF1A/TNFR1和TNFRSF1B/TNFBR结合并从而通过其受体TNFRSF1A/TNFR1和TNFRSFIB/TNFBR发挥作用。这种细胞因子与包括细胞增殖、分化、凋亡、脂代谢和凝结的广泛生物过程的调节有关。这种细胞因子被认为与许多疾病有关，包括自身免疫性疾病、胰岛素耐受和癌症。小鼠敲除研究也表明了这种细胞因子的神经保护功能。代表序列包括UniProtKB :P01375和Entrez Gene :7124。“Apo-F”或“载脂蛋白F”为血浆中发现的一种较小的载脂蛋白。这种蛋白质与脂蛋白形成复合物并可能与胆固醇的转运和/或酯化有关。代表序列包括UniPiOtKB :Q13790和 Entrez Gene :319。“Lcn-2”，“脂钙蛋白2”或“嗜中性粒细胞白明胶酶相关蛋白”在小鼠和人中均表达，并在胰岛、骨髓和SG中显示高表达。到目前为止还没有研究其在LG中的表达，但是微阵列数据显示了中等至高水平的表达。其与多种生物进程有关，包括作为先天免疫系统组分的细菌感染时的铁-含铁细胞结合、炎症调节，并且是与肥胖症和胰岛素抗性紧密相关的标记(Flo等(2004)Nature 432(7019) :917_21，13)。Lcn_2输送小分子亲脂性物质。代表序列包括 UniProtKB P80188 和 Entrez Gene :3934。“乳过氧化物酶”、“唾液过氧化物酶”或“LP0”具有代表序列，包括UniPiOtKB P22079 和 Entrez Gene :4025。“乳铁蛋白”或“LTF”为基因的转铁蛋白家族的成员，其蛋白质产物存在于嗜中性次级粒细胞中。所述蛋白质为乳分泌物和体分泌物中的主要铁结合蛋白质，具有抗菌活性，这使其成为非特异性免疫系统的重要组分。所述蛋白质显示了广泛的特性，包括铁稳态的调节、对广泛微生物感染的宿主防御、抗炎活性、调节细胞生长和分化以及防止癌症的发展和转移。代表序列包括 UniProtKB :P02788 和 Entrez Gene :4057。“溶菌酶”或“LYZ”具有细菌细胞壁肽聚糖的天然底物(使N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡糖胺之间的β-[1_4]葡糖苷连接断裂)。溶菌酶是存在于人乳液中的抗菌剂中的一种，其也存在于脾、肺、肾、白血细胞、血浆、唾液和泪液中。已经在可遗传肾淀粉样变性中识别了 LYZ的错义突变。代表序列包括UniProtKB Ρ61626和Entrez Gene :4069。术语“重组蛋白质”涉及通过重组DNA技术得到的多肽，其中通常地，DNA编码的多肽插入到适合的表达载体，所述载体反过来用于将宿主细胞转化为产生异种蛋白质。如本文中使用时，术语“载体”是指能够输送与其已经连接的另一核酸的核酸分子。一种优选的载体为附加体，即能够染色体外复制的核酸。优选的载体为能够自动复制和/或表达其所连接的核酸的载体。能够指导其可操作性地连接的基因的表达的载体在本文中成为“表达载体”。一般地，应用于重组DNA技术中的表达载体通常为“质粒”的形式，所述质粒通常是指环状双链DNA环，其载体形式不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”被互换使用，因为质粒是载体的最普遍使用形式。然而，本发明包括此类表达载体的其他形式，其发挥等同的功能且其在本文之后成为本领域已知的。“哺乳动物”为脊椎动物的一类，其雌性的特征在于具有乳腺，雄性和雌性的特征都在于汗腺、毛发、用于听力的三根中耳骨以及脑部的新皮质区。哺乳动物的非限制例子包括猿、鼠科动物、牛科动物、马、猪或绵羊。在一个方面中，哺乳动物是小鼠。在另一个方面中，哺乳动物是大鼠。在又一个方面中，哺乳动物是兔。在又一个方面中，哺乳动物是人。当应用于基因或蛋白质时，“表达”是指转录自基因或基因编码的蛋白质产物的mRNA产生。在一个方面中，“表达”水平通过以下方式确定针对给定患者群检测所关注的基因的表达水平、针对所述患者群确定该基因的中间表达水平、并将针对单一患者的相同基因的表达水平与给定患者群体基因的中间表达水平进行比较。例如，如果针对单一患者的所关注的基因的表达水平被确定闻于患者群体的中间表达水平，则该患者被确定为具有所述关注的基因的高表达。或者，如果针对单一患者的所关注基因的表达水平被确定低于患者群体的中间表达水平，则该患者被确定为具有所关注基因的低表达。 “过表达”或“欠表达”是指，与对照样品中基因表达水平相比，该基因在测试样品中增加的或减少的表达，或者差别表达。在一个方面中，测试样品为患病细胞，对照样品为正常细胞。在另一个方面中，测试样品为实验操纵的或生物改变的细胞，对照样品为实验操纵或生物改变之前的细胞。在又一个方面中，测试样品为来自患者的样品，对照样品为来自健康个体的类似样品。在又一个方面中，测试样品为来自患者的样品，而对照样品为来自没有期望的临床结果的患者的类似样品。在一个方面中，差别表达比对照样品中检测到的表达水平高或低大约I. 5倍、或大约2. O倍、或大约2. O倍、或大约3. O倍、或大约5倍、或大约10倍、或大约50倍、或进一步大于大约100倍。或者，所述基因被称作“过表达的”或“欠表达的”。或者，所述基因也可被称作“被上调的”或“被下调的”。“内部对照”或“管家”基因是指任何组成上或全部表达的基因，该基因的存在使能够评估所关注的基因的表达水平。这种评估包括基因转录的整体组成水平的确定以及取样误差中变异的控制。这种基因的例子包括但不限于β_肌动蛋白、转铁蛋白受体基因、GAPDH基因或其等同物。在本发明的一些方面中，内部对照或管家基因为适合对照。“细胞”，“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中为可互换使用的术语。应当理解，这些术语不但表示特定的主体细胞还表示这种细胞的子细胞或潜在子细胞。由于突变或者环境的影响，某些改变可能会在后代中发生，这样的子代事实上可能不会与其母细胞相同，但仍然被包括在本文所使用的术语的范围内。短语“多核苷酸扩增”包括以下方法诸如PCR法、连接扩增(或连接酶链反应，LCR)法和扩增法。这些方法是本领域已知的和广泛应用的。参见如美国专利4，683，195和4, 683, 202 以及 Innis 等 1990 (对于 PCR) jPWu，D.Y.等(1989) Genomics 4:560_569(对于LCR)。通常地，PCR步骤描述了基因扩增的方法，其由以下步骤组成(i)在DNA样品(或库)中使引分子与特定基因进行序列特异性杂交；(ii)后续扩增，包括多次循环的退火、延伸和使用DNA聚合酶的变性；以及(iii)针对正确尺寸的批次筛选PCR产物。所使用的引分子为具有足够长度和合适序列以提供聚合反应引发的寡核苷酸，即每个引分子被特定地设计为与要被扩增的基因组位点的每个链互补。
当应用于多核苷酸时，术语“编码”是指，如果处于多核苷酸天然状态或通过本领域技术人员所熟知的方法操纵时，其能被转录和/或被转变为针对多肽和/或其片段生成mRNA，则所述多核苷酸被称为“编码”所述多肽。反义链为这种核酸的互补链，并能由此推测编码序列。如本文中所使用时，术语“基因”或“重组基因”是指包含开放读码框架且包括至少一个外显子和(任选地)内含子序列的核酸分子。术语“内含子”是指存在于mRNA成熟时期被拼接出的给定基因中的DNA序列。“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或者两 个核酸分子之间的序列相似性。同源能够通过对比可以为对比目的被排列的每个序列中的位置来确定。当对比序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置上是同源性的。序列之间的同源度是序列之间共同具有的匹配或同源位置数量的函数。“不相关”或“非同源的”序列与本发明序列中的一个共同具有小于40%的同一性，然而优选小于25%的同一性。如本文所使用的术语“相互作用”指包括分子之间可检测的相互作用，如能够使用例如如杂交分析法检测。术语相互作用还指包括分子之间的“结合”相互作用。相互作用可以是例如天然存在的蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-小分子或小分子-核酸。如本文关于核酸如DNA或RNA所使用的术语“分离的”，分别是指从存在于天然来源的大分子中的其它的DNA或RNA中分离的分子。本文所使用的术语分离的还涉及在通过重组DNA技术制备的情况下基本上没有细胞物质、病毒物质或培养基或者在化学合成的情况下基本上没有化学前体或其它化合物的核酸或肽。此外，“分离的核酸”指包括不以片段的形式天然出现和不以天然状态存在的核酸片段。本文所使用的术语“分离的”还涉及分离自其它细胞蛋白的多肽，并且是指包含纯化的和重组的多肽。如本文所使用时，术语“核酸”涉及多核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)和适合的核糖核酸(RNA)。该术语还应被理解为包括由核苷酸类似物得到的DNA或RNA的等同物、衍生物、变体及类似物，以及可应用于文中所描述实施方案的单链(正义或反义)和双链多核苷酸。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。为清晰起见，当文中提及可以是DNA或RNA的核酸的核苷时，使用术语“腺苷”、“胞苷”、“鸟苷”和“胸苷”。应当理解，如果核酸为RNA，则具有尿嘧啶碱基的核苷为尿苷。 术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或其“部分”或“片段”是指一段多核苷酸残基，其长度足以用于PCR或多种杂交方法识别或放大mRNA或DNA分子的相同或相关部分。本发明的多核苷酸组合物包括能为本领域技术人员所容易理解的RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合的聚合物、正义和反义链，并且可以被化学或生物化学修饰或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基。这种修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰如非带电连接(如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)、带电连键(如磷硫酰、二硫代磷酸酯等)、悬垂部分(如多肽)、嵌入剂(如吖啶、补骨脂内脂等)、螯合剂、烷化剂以及修饰的连接(如α-异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸通过氢键和其他化学相互作用与指定的序列结合能力的合成分子。此类分子为本领域已知的，并且包括例如分子主链中肽连接取代磷酸酯连接的那些分子。当使用基因或蛋白质表达水平作为选择本文所描述的治疗的患者的“基础”时，在治疗之前和/或在治疗期间测定的基因或蛋白质的表达水平，并且临床医生将所获得的值用于评估以下情况中的任一种(a)个体开始接受治疗的可能的适宜性；(b)对治疗的响应；(C)个体继续接受治疗的可能的适宜性；(d)调整剂量；(e)预测临床疗效的可能性。本领域技术人员应当理解，在临床设计中基因表达水平的测定明确指出这一参数被用作开始、继续、调整和/或中止文中所述治疗的施用的基础。本文所使用的术语“治疗”指包括治愈以及改善病症或疾病的至少一种症状。“有效量”指最可能产生所希望的治疗效果的对患者施用或递送的化合物或药剂的量。所述量通过患者的临床参数根据经验来确定，所述临床参数包括但不限于疾病阶段、年龄、性别、组织学以及复发可能性。 “斯耶格伦综合症”或“SjS”影响着大约4百万美国人，十分之九的患者为女性(Lemp(2005)Am J Ophthalmol. 140(5) :898_9 ;Hansen.,等(2005)Curr OpinRheumatol. 17(5) :558_65)。SjS为美国第二大常见自身免疫性疾病；提高此类自身免疫疾病的诊断和治疗的研究长期以来被女性健康研究局(ORWH)视为研究的重点，泪腺(LG)负责分泌维持眼表(OS)健康的蛋白质和液体。SjS的特征为LG和唾液腺(SG)的淋巴细胞浸润，然后发展为功能静止(例如不能分泌液体和蛋白质)以及这些腺体最终的炎症性损坏。由于腺体的功能静止和所分泌蛋白质谱的改变的原因，SjS患者的眼表变干并易于感染，这导致严重的角膜损伤并在某些情况下导致失明。SjS能自独立地发生(原发性SjS)或与另一种自身免疫性疾病如风湿性关节炎或全身性红斑狼疮协同发生(继发性SjS)。原发性SjS尤其与对其他器官包括脑、肾、肺、胰腺和胃肠道的重大影响有关(Hansen.，等(2005)Curr Opin Rheumatol. 17 (5) :558_65))。原发性SjS的诊断也与淋巴B细胞显著增加的风险有关。在原发性SjS和继发性SjS中，表现出的症状与其他干燥性角膜结膜炎(KCS)重叠，而对于继发性SjS，表现出的症状还与许多其他自身免疫性疾病重叠。SjS基金会估计，对于典型患者而言，需要将近7年的时间才能获得SjS诊断，因为症状与其他疾病的症状在很大程度上有重叠。因为SjS中的泪液和唾液被认为独特地改变，所以令人惊讶的是目前还没有被认为是有助于SjS特别是原发性SjS诊断的泪液或唾液生物标记，这种生物标记能够有助于早期识别将要经历更严重疾病的这类SjS患者。本申请所提出的目标的实现、与疾病严重程度成比例地释放到泪液中的独特的泪液生物标记的检测和证实以及为泪液中这种物质的测定的新范例的发展，将是识别和更早地治疗SjS患者以防止疾病恶性发展的最终目标中的关键性的第一步。由于与大部分自身免疫性疾病一样，与其他人群相比SjS在绝经期后的女性人群发病率极高，本发明的成功也将在对女性健康有巨大影响的疾病的诊断方面取得关键性的进步。SjS的疾病模型包括NOD小鼠、基因模型和注射了 IL-I的BALB/c小鼠。它们代表了炎性自身免疫LG疾病的两种模型。这两种模型的区别在于一个是基因模型而另一个是实验诱导的疾病模型，后者使用细胞因子注射诱导产生LG疾病。“N0D小鼠”是针对人胰岛素依赖性糖尿病和SjS的深入研究的基因动物模型(Barabino,等(2004) Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (6) :1641_6)。这一种系自发地患有颌下腺中的淋巴细胞浸润(唾液腺炎)和LG中的淋巴细胞浸润(泪腺炎)以及糖尿病。雄性NOD小鼠显著地更易受泪腺炎影响，而在雌性小鼠LG中疾病发展的可能性最小。这与人疾病不同，因为SjS在女性中更普遍。尽管存在这种区别，淋巴细胞浸润到雄性小鼠LG中是意义深远的，并且早在6周时就发生了，伴随着泪液生成减少。雄性NOD小鼠LG还显示显著的脂质沉积，这是人SjS的特征。这种基因模型系统已经用于针对泪液中蛋白质生物标记产生强引子，所述生物标记被认为在疾病中增加CtsS、Apo-F和Lcn-2。患有严重自身免疫炎性LG疾病的雄性NOD小鼠将被用于泪液收集，同时检测泪流量以及角膜、结膜和LG的完整性和炎症。被检测小鼠的年龄可以跨越疾病开始(4到12周)、疾病中期发展(12周到6个月)和疾病晚期(6到12个月)。可以使用年龄匹配的BALB/c小鼠和性别匹配的BALB/c小鼠作为对照。“注射IL-I的BALB/c小鼠”为诱导炎性自身免疫性疾病的小鼠模型，其可被用作在将IL-I β或IL-I α注射到雌性BALB/c或C57BL/6小鼠中的单一注射的基础之上的第二模型，其诱导可逆的炎症性的泪液缺乏(Zoukhri,等(2002) Invest Ophthalmol VisSci. 43(5) 1429-36),然后在依赖于被注射种系的确定的时间表内恢复。通常使用希尔默测试条定量检测泪液生成。标准的希尔默测试条由5X35mm的ffhatman#41滤纸条组成；所述滤纸在位于滤纸条一头5mm的地方有一个凹痕。该测试条可从如Alcon Manufacturing, Ltd.公司的供货商处得到。测试条凹痕的一端可被卷曲。如 美国专利5，006，310中所述，希尔默泪液测试可通过在凹痕处弯曲测试条(弯曲 120° )进行。然后将希尔默泪液测试条的弯曲的一端插入到每只眼的下结膜囊。然后闭眼，测试条由于在毛细管作用下吸取它们产生的泪液而逐渐被浸湿。5分钟后测量泪液前沿的迁移距离。以测试条的凹痕作为零点测量泪液的迁移距离。测试的读取包括将测试条从眼中取出，放置于以毫米标度的标尺前。5分钟内润湿15mm视为正常。对于泪液的产生水平，建议尽可能地靠近5分钟时间标记处测量泪液迁移前沿，因为在测试条从眼中移出后，泪液前沿会继续沿着测试条上移。因此，滞后读取产生的数据会人为地偏高。如本文中所使用时，术语“可探测的标签”指直接地或间接地与待测组合物例如多核苷酸或蛋白如抗体直接地或间接地结合的可直接或间接地探测的化合物或组合物，以便生成“标记的”组合物。该术语还包括与多核苷酸结合的序列，其在表达插入序列时会发出信号，例如绿色荧光蛋白(GFP)等。所述标签可以通过自身来探测(如放射性同位素标签或荧光标签)或者在酶标签的情况下，可以催化基底化合物或组合物可检测的化学变化。所述标签可适用于小规模检测或更适用于高通量筛选。为此，适合的标签包括但不限制于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。所述标签可以被简单地检测或其可被量化。被简单地检测的响应通常包括仅确认其存在的响应，而被量化的响应通常包括具有可量化(如数值上可报道的)值如强度、极化和/或其他性质的响应。在发光分析或荧光分析中，可探测的响应可通过使用与实际涉及的分析组分结合的发光体或荧光体直接产生；或使用与另一个组分(如报道分子或指示剂)结合的发光体或荧光体间接地产生。产生信号的发光标签的例子包括但不限制于生物发光和化学发光。可探测发光响应通常包括发光信号的改变或发生。发光标记分析组分的合适的方法和发光体为本领域已知的并且例如在 Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent ProbesandResearch Chemicals (第6版)中阐述。发光探针的例子包括但不限制于水母发光蛋白和荧光素酶。适合的荧光标签的例子包括但不限制于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、均二苯乙烯、荧光黄、Cascade Blue. TM.和德克萨斯红。其他适合的光学染料在 Haugland, Richard P. (1996) Handbook ofFluorescent Probesand Research Chemicals (第 6 版)中阐述。描述性实施方案本文中研究发现，患有自身免疫性疾病的患者泪液中的某些活性肽的表达水平发生改变。那么这些多肽的改变的活性或表达水平或可用作诊断或预测自身免疫性疾病的生物标记。因此，恢复所述表达水平或活性的方法，可用于治疗自身免疫性疾病。因此，在一个方面中，本发明提供至少部分基于测定多肽表达或活性水平的诊断方法，所述多妝选自 Ctss> Ctsh> Ctsr> Ctsw> Ctsz、Ifng、I16ra> 1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F、Lcn-2、乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶。在一个方面中，测定至少一种多肽的表达水平，在另一个方面中，测定至少2种或至少3种或至少4种或至少5种或至少6种或至少7种或至少8种或至少9种或至少10种或至少11种或至少12种或至少13种或至少14种或至少15种或全部16种多肽的表达水平。在又一个方面中，从所述方法中排除了测定Apo-F的表达水平或活性水平。在一个方面中，使用选自Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra、I110、I110ra、1115、Tnfa、Apo-F、Lcn-2、乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶的多肽表达或活性水平作为针对治疗选择患者的基础。在一个方面中，测定至少一种多肽的表达水平，在另一个方面中，测定至少2种或至少3种或至少4种或至少5种或至少6种或至少7种或至少8种或至少9种或至少10种或至少11种或至少12种或至少13种或至少14种或至少15种或全部16种多肽的表达水平。在又一个方面中，从所述方法中排除了测定Apo-F的表达水平或活性水平。在一个实施方案中，本发明提供确定哺乳动物是否可能患有斯耶格伦综合症的方法，所述法包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成又或者由以下步骤组成在从哺乳动物分离的泪液样品中测定选自 Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra、1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F或Lcn_2中的至少一种第一多肽和/或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶中的至少一种第二多肽的表达水平或活性水平，其中，与合适的对照相比，第一多肽的增加的表达水平或增加的活性水平，或者第二多肽降低的表达水平或降低的活性水平，表明所述哺乳动物可能患有自身免疫疾病。在一个方面中，测定第一多肽中的至少一种多肽的表达水平，在另一个方面中，测定至少2种或至少3种或至少4种或至少5种或至少6种或至少7种或至少8种或至少9种或至少10种或至少11种或至少12种或全部13种多肽的表达水平。在一个方面中，测定第二多肽中的至少一种多肽的表达水平，在另一个方面中，测定至少2种或全部3种第二多肽的表达水平。在又一个方面中，从所述方法中排除测定Apo-F的表达水平或活性水平。测定多肽表达水平的方法在本领域是已知的。非限定性的例子包括蛋白质印记法、凝胶电泳法、ELISA、荧光分析质谱法或蛋白质阵列法。当应用于蛋白时“活性水平”是指蛋白质的酶活性水平。活性水平的测定基于蛋白质催化使用一种或多种底物的化学或生物反应的能力。在一个方面中，活性水平为能够 通过蛋白质在特定位点水解肽序列的能力来测定的蛋白酶活性水平。测定多肽活性水平的方法是本领域已知的。例如，对于具有蛋白酶活性的多肽，可以通过其水解底物肽的能力来测定它们的活性。用于包括CtSS的多种蛋白酶的蛋白酶活性测定试剂盒可从供货商如Sigma-Aldrich公司(St. Louis,MO)和Bio Vision Inc.公司(Mountain View, CA)处获得。蛋白表达水平或活性水平的测定可通过与适合的对照对比来实现。适合的内部对照可以是持续存在于来自不同哺乳动物的相同样品中的蛋白或其他试剂。适合的内部对照还可以是所收集样品的总量，如泪液的总量。适合的外部对照也可用于测定蛋白表达水平或活性水平。适合的外部对照可以是未表现出患有所关注疾病的哺乳动物。适合的外部对照也可以是收集的被证明来自未患病哺乳动物的历史样本。在一个方面中，针对NOD小鼠的适合的外部对照为BALB/e小鼠。
泪液的样品收集可使用本领域已知的方法完成，并且在本文中简略地描述。需要时可应用刺激方法，如在样品收集之前进行洗眼。仅为说明目的，泪液可被收集到包含或包埋有定量标记底物的希尔默测试条上，所述定量标记的底物如与可探测标记如荧光标签或底物结合的抗体。泪液中的多肽或蛋白质与可探测标记底物反应以测定，所述可探测标记底物允许检测一种第一多肽和/或第二多肽的表达水平或活性水平。在本文中使用时，“可能患有自身免疫疾病”的哺乳动物为比较有可能患自身免疫疾病的哺乳动物。在另一个实施方案中，本发明提供协助诊断哺乳动物自身免疫疾病的方法，所述方法包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成又或者由以下步骤组成在从哺乳动物中分离的泪液样品中测定选自 Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra、1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F或Lcn_2中的至少一种第一多肽和/或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶中的至少一种第二多肽的表达水平或活性水平，其中，与合适的对照相比，第一多肽的增加的表达水平或增加的活性水平，或者第二多肽降低的表达水平或降低的活性水平，表明哺乳动物自身免疫疾病可能的阳性诊断，从而协助诊断。在一个方面中，测定第一多肽中的至少一种多肽的表达水平，在另一个方面中，测定至少2种或至少3种或至少4种或至少5种或至少6种或至少7种或至少8种或至少9种或至少10种或至少11种或至少12种或全部13种多肽的表达水平。在一个方面中，测定第二多肽中的至少一种多肽的表达水平，另一方面，测定至少2种或全3种第二多肽的表达水平。在又一个方面中，从所述方法中排除测定Apo-F的表达水平或活性水平。在一个方面中，协助诊断是指为现有诊断提供证实。在另一个方面中，协助诊断是指使用一组诊断方法中的诊断方法，所述组中的每一种方法都有助于最终诊断。在又一个方面中，协助诊断还指组合使用一个以上本文中所列的标记来实施诊断。在另一个实施方案中，本发明提供诊断哺乳动物自身免疫疾病相对严重性的方法，所述方法包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成又或者由以下步骤组成在来自哺乳动物的泪液样品中测定选自 Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra> 1110、IllOra、1115、Tnfa、Ap0-F或Lcn_2中的第一多肽或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶中的第二多肽的表达水平或活性水平，其中，与合适的对照相比，第一多肽相对较高的表达水平或活性水平，或者第二多肽相对较低的表达水平或活性水平，表明个体患有相对更严重的自身免疫疾病。在一个方面中，测定第一多肽中的至少一种多肽的表达水平，在另一个方面中,测定至少2种或至少3种或至少4种或至少5种或至少6种或至少7种或至少8种或至少9种或至少10种或至少11种或至少12种或全部13种多肽的表达水平。在一个方面中，测定第二多肽中的至少一种多肽的表达水平，在另一个方面中，测定至少2种或全部3种第二多肽的表达水平。在又一个方面中，从所述方法中排除测定Apo-F的表达水平或活性水平。尽管未总是明确地指出，但是可以通过以下方式进一步修改本发明的方法检测或测定所述多肽中的至少2种或至少3种或至少4种或至少5种或至少6种或至少7种或至少8种的表达水平或活性水平并与合适的对照进行比较，并且可以基于它们的总表达水平或活性水平做出诊断。在以上实施方案的一个方面中,第一多肽选自Ctss、Apo_F或Lcn-2。在另一个方面中，从所述方法中排除测定Apo-F的多达水平或活性水平。此外，已经发现，与小鼠类似，在胞质细胞器和泡状细胞器中分散地分布有Apo-F的人患者很可能患有自身免疫疾病或处于患自身免疫疾病的风险中，而Apo-F位于腺泡细 胞中质膜的细胞质面的人个体可能未患有自身免疫疾病或未处于患自身免疫疾病的风险中。NOD小鼠LG和某些人LG中ApoF的分散分布被认为起因于腺泡细胞中ApoF的分类错误。在不受理论约束的情况下，申请人的发现表明，与健康小鼠相比，在NOD小鼠模型中观察到的错误分类的蛋白质如Apo-F和CATS的分散分布方式是用于自身免疫疾病诊断的标记，不仅在小鼠中，而且在人和其他哺乳动物中也是如此。因此，在哺乳动物的LG中腺泡细胞的质膜的细胞质面存在Apo-F或CATS表明哺乳动物可能未患有自身免疫疾病或未处于患自身免疫性疾病的风险中。在哺乳动物LG中腺泡细胞的胞质细胞器或泡状细胞器中Apo-F或CATS的分散分布表明哺乳动物患有自身免疫疾病或处于患自身免疫疾病的风险中。相应地，本发明的一个方面提供确定哺乳动物是否有可能患自身免疫疾病的方法，包括在分离自哺乳动物泪腺或唾液腺的腺泡细胞中测定选自以下蛋白质中的蛋白质的存在CATS或APO-F或在NOD小鼠LG中观测到的任何分类错误的蛋白质，其中，如果细胞中超过约10%或者约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、或约95%的所述蛋白质不存在于细胞基底膜附近，则所述哺乳动物有可能患有自身免疫疾病。对本领域技术人员来说明显的是，没有这一发现表明哺乳动物不大可能患自身免疫疾病。进一步提供协助诊断哺乳动物自身免疫性疾病的方法，包括在分离自哺乳动物泪腺或唾液腺的腺泡细胞中检测选自以下蛋白质的蛋白质的存在CATS或APO-F或在NOD小鼠LG中观察到的任何分类错误的蛋白质，其中，细胞中超过约IO %或者约20 %、约30 %、约40 %、约50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约90 %、或约95 %的所述蛋白质存在于细胞基底膜附近表明哺乳动物自身免疫疾病的可能的阳性诊断，从而协助诊断。对本领域技术人员来说明显的是，没有这一发现表明哺乳动物不是患自身免疫疾病的阳性诊断。如本文中所使用时，术语“附近”指细胞中比细胞直径相对小的距离。在一个方面中，不在细胞基底膜附近是指具有距离细胞基底膜至少约细胞直径的1/20或者约1/10、约1/9、约1/8、约1/7、约1/6、约1/5、约1/4、或约1/3的距离。在以上实施方案的另一个方面中，所述方法进一步包括用选自希尔默测试、裂隙灯检测、放射性测试或血液测试的测试诊断哺乳动物。得自这种附加测试的结果可与以上实施方案提供的方法结合以协助诊断。在这一方面中，如本文公开的方法，在与其他已知的或有待开发的诊断方法结合时，有助于诊断自身免疫疾病希尔默测试测定眼是否产生足以保持眼睛湿润的泪液。在人眼过分干燥或过分湿润时使用这种测试。希尔默测试使用纸条插入眼中若干分钟以测定泪液的产生。该技术测量基本的泪液功能。申请人采用常规用途的这些滤纸条收集用于蛋白活性的测定的人泪液。裂隙灯检查使用仪器裂隙灯以提供眼睛不同部位的放大的、三维的视图。裂隙灯为由高强度光源组成的设备，所述高强度光源能被聚焦成薄片状光照入眼中。其与生物显微镜组合使用。这种灯为检查人眼的前段或额结构和后段提供便利，人眼包括眼睑、巩膜、结膜、虹膜、天然晶状体和角质层。双目裂隙灯检查提供眼睛结构的详细的立体放大视图，使得能够针对各种眼睛病症进行结构诊断。放射性方法也能被用作可靠的和准确的诊断自身免疫疾病的方法。造影剂被注入到腮腺导管(腮腺管)中，所述腮腺导管是从脸颊通向上颌第二白齿齿颈对面的口腔前厅的导管。分散在整个腺体中的所注射的造影剂的广泛的混乱表明有自身免疫疾病。可以进行血液测试以确定患者是否具有表明病症的高水平的抗体，如抗核抗体(AM)和类风湿因子(因为SS继风湿性关节炎之后频繁地发生)，其与自身免疫疾病有关。典型的自身免疫疾病ANA型有SSA/Ro和SSB/La，其中SSB/La特异性更高；SSA/Ro与许多其他的自身免疫病症有关但常常出现在斯耶格伦综合症中(FranceschiniandCavazzana(2005) “Anti-Ro/SSA and La/SSB antibodies,^Autoimmunity 38(1) :55_63)。可以通过本发明的方法诊断的自身免疫疾病包括但不限于乳糜泻、I型糖尿病(IDDM)、红斑狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合症、Churg-Strauss综合症、桥本甲状腺炎、格雷夫症、原发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊椎炎、克隆氏病、皮肌炎、古德帕斯丘综合症、格林巴利综合症(GBS)、混合结缔组织疾病、多发性硬化症、重症肌无力、嗜眠病、寻常性天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病。所述方法用于哺乳动物、动物或人患者的诊断。仅为说明目的，哺乳动物包括但不限于人、猿猴、鼠、牛、马、猪或羊。在以上实施方案的又一个方面中，斯耶格伦综合症为炎症性自身免疫泪腺疾病。治疗方法本发明进一步提供了治疗患有以上所提到的自身免疫疾病或可能患以上所提到的自身免疫疾病的受试者或改善受试者自身免疫疾病的症状的方法。在一个实施方案中，所述法包括以下步骤或者基本上由以下步骤组成又或者由以下步骤组成向哺乳动物施用有效量的适宜的治疗，从而治疗哺乳动物。适宜治疗的非限制性例子包括环孢菌素、西维美林、匹罗卡品、非留体抗炎药、皮质类固醇、免疫抑制剂或缓解疾病的抗风湿药。这些治疗可以单独地使用或结合使用以治疗或改善自身免疫疾病的症状。可通过本发明的方法治疗的自身免疫疾病包括但不限于乳糜泻、I型糖尿病(IDDM)、红斑狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合症、Churg-Strauss综合症、桥本甲状腺炎、格雷夫症、原发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊椎炎、克隆氏病、皮肌炎、古德帕斯丘综合症、格林巴利综合症(GBS)、混合结缔组织疾病、多发性硬化症、重症肌无力、嗜眠病、寻常性天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病。水份替代疗法如人工泪液可减轻干眼的症状(问题更严重的某些患者使用护目镜增加眼局部湿度，或者植入泪小点栓以帮助泪液在眼表停留更长时间)。环孢菌素(环孢素)为处方供应药，其通过抑制使泪液分泌紊乱的炎症来协助治疗慢性干眼。有助于刺激唾液分泌的处方药也是可得到的，例如西维美林和匹鲁卡品。非留体抗炎药可用于治疗肌肉骨骼症状。皮质类固醇或免疫抑制药可用于 减轻症状。缓解疾病的抗风湿药(DMARD)如甲氨蝶呤也有助于缓解患者症状。多种单克隆抗体目前正处在研究阶段(Meijer等(2007)Clin Rev Allergy Immunol 32(3) :292_7)。对于具有严重症状的患者，可以将泪小点栓植入到眼睛的下或上泪液排出通道中。在另一个方面中，本发明提供了治疗患有自身免疫疾病或处于患自身免疫疾病风险中的哺乳动物的方法，包括向哺乳动物施用有效量的药剂，所述药剂抑制选自Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw或Ctsz的多肽的表达或活性。在一个实施方案中，所述多肽为Ctss。在所述实施方案的一个方面中，所述药剂为Ctss抗体。在所述实施方案的另一个方面中，所述药剂为小分子Ctss抑制剂。小分子Ctss和Ctsl抑制剂已经被设计并以治疗目的使用。例如，Katunuma等公开了组织蛋白酶L抑制剂Katunuma(CLIK)的7种抑制剂，其中的一种还抑制组织蛋白酶S (Katunuma等25(1999)FEBS Letters 458 :6_10)。也可以使用抑制蛋白活性或表达的其他方法。非限制例子包括siRNA、dsRNA、miRNA、反义多核苷酸、核糖酶、三重多核苷酸、抗体和其他抑制性多肽。抑制蛋白表达的siRNA、dsRNA和miRNA按本领域已知的方法设计。参见，例如，Dykxhoorn, D. M.和 Lieberman, J. (2006) Annu. Rev. Biomed. Eng. 8 :377_402 ；Dykxhoorn,D. Μ.等(2006)Gene Therapy 13 541~52 ；Aagaard, L. and Rossi, J. J. (2007)Adv. DrugDelivery Rev. 59 :75_86 ;de Fougerolles, A.等(2007)Nature Reviews DrugDiscovery
6443-53 ；Krueger, U.等(2007)Oligonucleotides 17 :237_250 ;美国专利申请 No.2008/0188430 ;以及美国专利申请 No. :2008/0249055。可以使用本领域已知的方法实施向细胞递送siRNA、dsRNA或miRNA。参见，例如，Dykxhoorn, D. Μ.和 Lieberman, J. (2006) Annu. Rev. Biomed. Eng. 8 :377_402 ；Dykxhoorn, D. M.等(2006)Gene Therapy 13 :541_52 ；Aagaard, L.和 Rossi, J. J. (2007)Adv. Drug Delivery Rev. 59 :75_86 ;de Fougerolles, A.等(2007)Nature Reviews DrugDiscovery6 443-53 ；Krueger, U.等(2007)Oligonucleotides 17 :237_250 ;美国专利申请 No. :2008/0188430 ;以及美国专利申请 No. :2008/0249055。反义寡核苷酸具有与蛋白质编码序列或“正义”序列互补的核苷酸序列。反义RNA序列通过与互补的mRNA序列杂交和阻止翻译来发挥基因表达调节物的功能(Mizuno等(1984)PNAS 81 :1966 ;Heywood 等(1986)Nucleic Acids Res. 14 :6771)。包括目标转录或其任何部分的整个序列的反义多核苷酸可以通过本领域已知的方法合成。参见，例如，Fcrretti等(1986)PNAS 83:599。反义多核苷酸可以被置于载体结构中，并且被有效地引入细胞中以抑制基因表达(Izant等(1984)Cell 36:1007)。通常地，为保证特异性杂交，反义序列与目标序列基本上互补。在某些实施方案中，反义序列与目标序列完全互补。然而，只要保留与响应于基因的相关目标序列特异性结合作为多核苷酸的功能性质，反义多核苷酸可以还包括核苷酸取代、加成、消除、转变、换置或修饰或其他核酸序列或非核苷酸部分。反义核酸(DNA、RNA、修饰的、类似物等)可通过使用用于制备核酸任何适合的方法来制备，所述方法例如本文中所公开的本领域技术人员已知的化学合成和重组方法。在一个实施方案中，例如可通过全程化学合成或克隆制备本发明的反义RNA分子。例如，可以通过在反方向上插入(捆绑)与载体(如质粒)中启动子可操作性连接的基因序列中来制备反义RNA。条件是启动子优选地和终止信号以及聚腺苷酸化信号被合适地定位，与非编码链对应的插入序列的链将被转录并用作本发明的反义寡核苷酸。应当理解，可以使用非标准的碱基(例如除了腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷)或非标准的主链结构制备寡核苷酸以提供所期望的特性(例如增加的核酸酶耐受性、更紧密的结合、稳定性或期望的Tm)。赋予寡核苷酸核酸酶耐受性的技术包括在PCT公布TO 94/12633中所描述的那些技术。可以制备大量各种有用的修饰的寡核苷酸，包括有肽-核酸(PNA)主链的寡核苷酸(Nielsen等(1991) Science 254 1497)或合并2’-O-甲基核糖核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、甲基磷酸酯核苷酸、磷酸三酯核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、磷酰胺酯核苷酸的核苷酸。修饰的另一个例子为用硫原子替换非桥连磷酰基氧原子，其增强对核酸酶消化的耐受性。使用具有2-甲氧基乙基取代的主链的分子也可以实现增加的反义多核苷酸的稳定性。参见，例如，美国专利206，451，991和6，900，187。在另一个实施方案中，可以使用核糖酶(参见，例如Cech(1995)Biotechnologyl3 323 ;和 Edgington (1992) Biotechnology 10 256 和 Hu 等，PCT 公布 WO94/03596)。核糖核酸酶(“核糖酶”、“RNA酶”或“催化RNA” )为催化化学反应的RNA分子。很多天然的核糖酶既催化其自身磷酸二酯键中一个的水解，又催化其他RNA中键的水解，但它们也被发现催化核糖体转氨酶的活性。制备和使用核糖酶的方法可见于美国专利申请 No. 2006/0178326。相对于正常表达的核糖酶，“三重核糖酶”构型允许增加的目标裂解。三重核糖酶的例子包括发夹型核糖酶和锤头型核糖酶。制备和使用三重核糖酶的方法参见，例如，Aguino-Jarguin 等(2008)Oligonucleotides 18(3) :213_24 和美国专利申请No.2005/0260163。已经描述了具有跨细胞膜转运所期望核酸能力的蛋白质。典型地，这些蛋白质具有两性的或疏水的子序列，所述子序列具有用作膜转运载体的能力。例如，同源域蛋白质具有跨细胞膜转运能力。发现同源域蛋白质的最短的可内化肽，触角足，是所述蛋白质的从43到58氨基酸位的第三螺旋(参见，例如，Prochiantz (1996) Current OpinioninNeurobiology 6:629-634)。发现另一个子 序列,信号肽的h (疏水)结构域,具有类似的细胞膜转运特征(参见，例如，Lin等(1995) J. Biol. Chem. 270 :14255-14258)。这种子序列可以用于跨细胞膜转运寡核苷酸。使用这种序列能方便地将寡核苷酸衍生化。例如，可以使用连接子连接寡核苷酸和转运序列。可以使用任何适合的连接子，例如肽连接子或任何其他适合的化学连接子。可以升高抗体对抗提供抗原表位的蛋白质的任何部分。制备和使用抗体抑制蛋白质功能的方法在例如美国专利7，320, 789和美国专利申请No. 2009/0010929中有描述。
在以上实施方案的一个方面中，斯耶格伦综合症为炎症性自身免疫泪腺疾病。在另一个方面中，所述哺乳动物为人患者。试剂盒
如本文所列，本发明提供自身免疫疾病的诊断方法。在一些实施方案中，所述方法使用对选自 Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra> 1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F>Lcn-2、乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶的多肽特异的探针或抗体。相应地，本发明提供用于实施这些方法的试剂盒以及实施本发明方法的说明，例如收集泪液和/或进行筛选和/或分析结果，和/或施用有效量的适宜治疗。用于诊断试剂盒的测试样品可以是泪液。制备蛋白质提取物的方法是本领域已知的并可容易地使用从而获得与所使用的系统兼容的样品。非限制性的描述性实例为以上讨论的希尔默测试条。在一个实施方案中，测试条包含或包埋有被可探测标记的定量的底物，例如荧光标记的抗体，用于上述的一种或多种多肽的定量测定。所述试剂盒可以包括用于测定受试者蛋白质表达水平或活性水平的本文中所述的阳性对照、阴性对照、试剂、探针和抗体中的全部或一些。责任起见，可以以本领域技术人员常用的方式包装这些建议的试剂盒组分。例如，可以以溶液或液体分散剂等形式提供这些建议的试剂盒组分。现在总体上描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易地理解本发明，加入所述实施例仅是为了描述本发明实施方案的某些方面，并不是为了限制本发明。实验I雄性NOD小鼠为建立好的评估人疾病泪腺炎和唾液腺炎特征的进程的动物模型。这种小鼠品种自发地患有胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和SjS类疾病。泪腺炎在这种小鼠模型中比唾液腺炎更严重，其在12-16周时完全显现。NOD小鼠中受影响的LG的显现和病理学特征与患斯耶格伦综合症泪腺炎的患者LG中观测到的那些变化类似。N0DSCID小鼠品种为无免疫能力的NOD小鼠。可以将Prkdc同类品系与NOD小鼠进行比较以区分与炎症有关的事件与不依赖于T-细胞和B-细胞介导的炎症响应的品系的特征事件。NOD SCID品系缺乏功能性的T细胞、B细胞和NK细胞，并且没有外分泌组织破坏。与NOD小鼠中泪腺炎和其他疾病模型有关的早期病理学事件包括LG区域中功能静止的发展(如腺泡细胞不能从前期形成的分泌泡囊中分泌泪液蛋白)另外伴随正常出现且完好的腺泡细胞，炎症性细胞从管道浸润到LG的其他区域中形成病灶，以及细胞外基质及其他腺泡细胞被这些浸润的免疫细胞释放的因子损伤。随着时间的推移，LG中的健康腺泡细胞物质被淋巴细胞病灶和坏死和凋亡细胞碎片的区域取代。在其他正常出现的腺泡中的一些早期功能性的改变也与炎症性因子的暴露有关联。例如，研究显示ILla和IL13作为炎症性因子环境的组成部分可以在LG负责调节分泌响应的由刺激神经释放神经递质的过程中引起功能性改变，且当其在体外暴露于腺泡细胞时，也可能引起直接的功能静止。然而引发最初的自身免疫炎症性响应的因素仍然不甚清楚，这些因素促成LG中增高的细胞因子水平进而发展引起此损坏的循环。BALB/c小鼠也能够被用作实验模型。因为这种模型是被诱导的，研究者可以跟踪雌性小鼠中疾病发生、进展和康复，其相对于NOD模型能更精确地呈现SjS疾病统计学上的能力。BALB/c小鼠从细胞因子注射中一周内更快地恢复，而C57BL/6小鼠在几周内表现出更逐渐的恢复。研究者可从BALB/c小鼠开始。如果有必要利用更延长的时期进行分析，可以诱导C57BL/c小鼠。对于雌性小鼠的注射，将使用具有IL-1、重组人IL-I α的10-12周大的小鼠。IL-Ia和IL-I β在LG疾病模型中均引起相当的效应，但预计有可能将一些IL-Ia从NCI临床前资源库中拿出以补充研究。向被麻醉小鼠中每个LG注射2 μ L(Iyg)的IL-I α。向对照品中注射等体积的生理盐水。注射后I到10天可评价小鼠泪液收集、泪流量、以及角膜、结膜和LG的完整性和炎症。材料和方法 动物和动物操作=NOD和BALB/c小鼠群体在南加利福尼亚大学动物园繁殖，使用购自 Taconic (Hudson, NY)和 / 或 Charles River Laboratories (Wilmington, MA)的繁殖对。NOD SCID小鼠购自Harlan (Indianapolis，IN)。动物的处理和处死按照经南加利福尼亚大学学会动物保护和使用协会批准的政策执行。通过向每千克体重的小鼠腹腔内注射55mg的盐酸氯胺酮(Ketaject)和14mg的甲苯噻嗪安乐处死后进行颈脱臼，然后将LG从不同年龄的小鼠中移除，将移除后的每个LG迅速冷冻并存储于液氮中用于RNA制备，或立即用4%多聚甲醛和4%蔗糖固定于PBS中用于使用间接免疫荧光法的处理和分析。试剂和供应The VersaGene RNA组织试剂盒最初购自Gentra Systems,后来使用的购自 Thermo Fisher Scientific, Inc.公司(Fair Lawn, NJ),其商品名为5PRIMEPerfectPure RNA组织试剂盒(FP2302410)。用于微阵列的所有材料和试剂通过Vanderbilt Microarray Shared Resources(VMSR, Vanderbilt University, Nashville,TN)购自 Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA)。用于 RT 和原位 PCR 的材料和试剂均直接购自ABI :高容量cDNA RT试剂盒(4368814)、TaqMan 用于原位PCR的通用PCR 主混合器(4324018)、MicroAmp 光学 384-孔反应板(4309849)和 Micro Amp 光学粘合膜(4311971)，和TaqMan 基因表达分析仪(组I和组2)。组I探针包括针对针对以下所关注基因的那些探针IIlb(Mm01336189_ml 或 Mm00434228_ml)、116 (Mm ml),I110(Mm_ml)、1115 (Mm00434210_ml)、Tnfa (Mm ml)、Infg (Mm ml)、Ctsh (Mm00514455_ml)Ctss (Mm00457902_ml)和Ctsz (Mm00517697_ml)。组2探针包括针对包括以下用作内部对照的基因的那些探针Hprtl (Mm00446968_ml)和Sdha (Mm01352357_ml)。Mm后的8个数字代表公司用于与特定mRNA基因位点相一致的TaqMan基因表达测定的分析ID。用于蛋白印迹的大鼠抗组织蛋白酶H(CATH)单克隆抗体(MAB1013)和山羊抗-组织蛋白酶S (CATS)多克隆抗体(3366-100)分别购自R&D Systems, Inc.公司(Minneapolis, MN)和 Bio Vision, Inc.公司(Mountain View, CA);用于免疫突光显微镜法的山羊抗-CATH多克隆抗体(sc-6497)、山羊抗-CATS多克隆抗体(sc_6505)和大鼠抗小鼠 CD14 单克隆抗体(sc-9150)购自 Santa Cruz Biotechnology, Inc.公司(Santa Cruz,CA)。来自 Abeam USA (Cambridge, MA)的大鼠抗-Lamp2 单克隆抗体(abl3524);来自 AbDSerotec USA (Raleigh，NC)的大鼠抗-CD68 单克隆抗体(MCA1957GA)，和来自 Jackson 免疫研究实验室(West Grove, PA)的罗丹明红-X结合的驴抗山羊IgG (705-295-147)、FITC_结合的驴抗山羊IgG(711-095-152)和FITC-结合的驴抗大鼠IgG(712-095-150)被用作免疫荧光分析。未加工的264. 7全细胞溶解物被用作蛋白质印迹分析的CATH和CATS蛋白质的阳性对照，且其被购自 Santa Cruz Biotechnology, Inc.公司(Santa Cruz CA, USA)。氨基甲酰胆碱(CCH)购自 Sigma 公司(St. Louis, MO，USA)。
荧光-激活细胞分类器(FACS)分析:根据如前描述的修正方案(Schenke-Lavland等，2008)在分离自12周大的BALB/c、N0D和NOD SCID小鼠(η = 5只小鼠，合并的)LG的炎症性细胞上进行FACS分析。炎症性细胞亚群用以下抗体双重标记异硫氰酸荧光素(FITC)结合的⑶49b/Pan-NK ;青色素_5(Cy5)结合的⑶I Ib (Mac-I)和藻红蛋白(PE)-结合的Grl ；PE-结合的B220和FITC-结合的CD 19 ；以及FITC-结合的CD4和PE-结合的CD8。所有这些抗体均购自BD Biosciences/Pharmingen公司(San Diego, CA, USA)且按照厂商的说明使用。非特异同型匹配的Cy5-、PE-和FITC-结合的IgGs用作对照。按照厂商说明书用7_氨基放线菌素(7-AAD ；BD Pharmingen, San Diego CA，USA)进行染色以排除死亡细胞。细胞被合适隔离且每个样品获得总数为10000的事件。所有的分析使用BD LSR2流式细胞仪(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)进行。通过使用 Flow Jo 8. 3. 3 软件(Tree StarInc.，Ashland, OR, USA)输出和分析 FACS 文档。总RNA的制各:所述制备使用VersaGene RNA组织试剂盒或5PRMEPerfectPureRNA组织试剂盒在室温下进行。从液氮中取出I到2对LG，并在溶解缓冲液中使用Brinkman Polytron组织均质器将其在冰上迅速地均质化。溶解物用Pre-Clear旋转柱通过离心作用过滤。使澄清的溶解物通过纯化柱通过离心分离。用DNase I处理RNA结合膜。用洗脱缓冲液将RNA从柱子中洗脱到收集管中。来自三只小鼠的3个LG RNA样品被等量合并进行微阵列分析和原位RT-PCR。每一个RNA样品被制备用于原位RT-PCR，所述样品来自3-4对被合并的四周大小鼠的LG。所有纯化的RNA样品被储存于-80°C。某闵表汰微阵列分析ABI小鼠基因组三倍体调查微阵列AB17001. O. I版(4382672)被用于每组小鼠。每个芯片用约3300060_mer作为探针的寡核苷酸印记，代表了完整注释的和策划的来自公共的和Celera数据库的大约32000小鼠基因集。用VMSR进行微阵列分析和序数据标准化。微阵列分析之前，通过用Agilent生物分析仪按照厂商使用指南测定来证实RNA的纯度和完整性。简言之，就是使用ABI NanoAmp RT-IVT标记试剂盒(4365715)按照厂商说明将I μ g的总RNA(约30ng mRNA)用于生成双链cRNA。全部cDNA产物被用于IVT反应生成地高辛(DIG) -标记的cRNA。cRNA使用配套柱纯化并通过Agilent生物分析仪定性分析。在ABI化学发光检测试剂盒(4342142)中提供所有的杂交试剂、杂交对照、清洗剂和化学发光剂，并且按照厂商说明进行随后的杂交程序。简言之，所述阵列用ImL的预杂交混合物在55°C杂交箱中以100RPM搅拌下预杂交60分钟。将与杂交对照混合的O. 5mL碎片DIG-标记的靶点加入到前期杂交溶液中。所述阵列继续在55°C下培育并以100RPM搅拌16小时。清洗所述阵列并用抗DIG-AP抗体培育20分钟。抗体清洗后，用化学发光增强溶液培养所述阵列20分钟。化学发光反应的底物被一次一个地单独地加入到每个阵列里面。立即将所述阵列在1700化学发光微阵列分析仪上成像。针对QA/QC分析图像并通过AB1700表达阵列系统软件(V I. I. I)完成初步分析。原始数据通过使用ABI基于分位数的方法被标准化并通过使用分析器和相关的软件按照标记的平均分被过滤。逆转录(RT)和原位聚合酶链反应(PCR):两个反应步骤采用ABI反应试剂盒和试剂按照厂商说明进行。简单地说，使用高容量cDNA RT试剂盒进行RT反应，以每IOyL反应体积I μ gRNA在25 °C下反应10分钟，然后在37 °C下反应2小时，然后在85 °C下以5秒钟的时间终止。原位PCR使用ABI7900HT快速原位PCR系统进行。在总体积为10 μ L的每个PCR反应中使用I μ L RT产物(用3. 5 μ L无核酸酶的水稀释)、0. 5 μ L TaqMan分析混合物和5μ L通用主混合。每个测定进行三次。样品被于95°C下预热10分钟，然后在95°C下15秒钟和在60°C下I分钟重复40次。用TaqMan进行PCR反应测定管家基因，Hprtl (次黄嘌呤磷酸核糖转移酶I)或Sdha(琥珀酸脱氢酶复合物，A亚型)作为内部对照。记录的数据通过使用ABI software SDS 2. I的Δ Δ Ct研究计算功能进行分析。特定mRNA的倍数变化(FC)通过计算为 Λ Ct = Ct (研究的 mRNA) -Ct (管家基因 mRNA)，Δ Ct (NOD) - Λ Ct (BALB/c) = Δ 八以，且卩((勵0/8六1^/(3) = 2“ct。共聚焦荧光显微法移除后，LG被置于包含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS中室温培养2到3小时。将腺体转移到含有30%蔗糖的PBS中过夜。将腺体包埋在O. C. T.中在液氮中速冻。块状物在进行组织切片之前存储于_80°C ο使用Microm Cryostat (Heidelberg,Germany)将块状物切成5微米厚的切片。置于组织切片上的培养片用稀释的第一抗体的1% BSA溶液在37°C下潮湿小室中培养I小时。顺序地将培养片用稀释的荧光标记的二级抗体的I % BSA溶液和荧光标记的鬼笔环肽(适当的)涂覆，并将培养片在37°C下潮湿小室中培养I小时。最后培养片用DAPI的PBS乳液培养5分钟，用水冲洗并用水溶性抗褪色 固定介质(Invitrogen,Carlsbad,CA)固定在盖玻片下。在整个进程期间，培养片在处理之间用PBS清洗2到3次。样品用Zeiss LSM 510 Meta NLO共聚焦/多光子成像系统成像。LG组织溶解物或泪液的免疫印迹测定新移自2到3只小鼠或存储于_80°C的合并的LG使用电动均质器在包括蛋白酶抑制剂(组织缓冲液=I 5(w/v))的RIPA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris_Cl，O. 5%脱氧胆酸钠，O. 5mM EDTA,0. 1% TX-100,1% ΝΡ-40)中被均质化。生成的匀浆通过以10，OOOrpm转速在4°C下离心10分钟被澄清。收集上清液并将其储存于_80°C。等分的上清液与SDS凝胶的上样缓冲液混合，并于92°C加热5分钟用于后续分析。对于泪液收集，如按以上所述的方式麻醉小鼠。通过沿着眼睑和耳朵外部交叉的中轴线上的小切口处暴露小鼠LG，然后盖上一层切成和胰腺相似尺寸的细纤维素筛(Kimwipe )。该LG通过加入激动剂氨基甲酰胆碱(CCH) (5 μ L，10 μ Μ)到该腺体上的筛上被刺激，然后用玻璃毛细管在眼角中间收集泪液并注意不要碰到角膜。每只眼被刺激两次，每只眼的总共收集时间为10分钟。收集到的泪液被从玻璃毛细管中转移到含有蛋白酶抑制剂的埃彭道夫管，测量其精确体积，与SDS凝胶上样缓冲液混合，必要时进行样品合并，然后在92 °C加热5分钟。在每个孔中加载含有IOOyg总蛋白质的组织溶解物或IyL泪液并在10-12%SDSPAGE上分离。使用LI-COR Odyssey红外成像系统被扫描膜。组织蛋白酶的酶活性测定:对于LG溶解产物的活性测定，来自每个个体小鼠的新鲜收集的LG对，泪液收集的局部CCH之后的后刺激或不刺激，在组织蛋白酶S活性分析试剂盒(Biovision, Inc. Mountain View, CA)提供的CS细胞溶解缓冲液(Img组织/5 μ L缓冲液)中用Brinkman Polytron组织勻衆机在冰上均质化。在每个实验中使用同样数量的NOD和BALB/c小鼠。该匀浆通过以10，OOOx g转速在4°C下离心10分钟被澄清。得到的溶解物立即使用或存储于_80°C留待以后使用。对于泪液活性测定，按照以上描述的方式麻醉小鼠并从成对的12周大的雄性NOD和BALB/c小鼠中收集泪液，按照年龄和性别匹配成对。将小鼠侧躺放置于MoticSMZ-140解剖显微镜下(厦门，中国)。LG通过沿着眼睑和耳朵外部交叉的中轴线上的小切口处被暴露，并将包围腺体的结缔组织囊小心打开并从腺体上表面移除，向该腺体覆盖一层剪成腺体形状但比腺体稍小的细纤维素筛(Kimwipe )。该眼表用AK-眼部冲洗溶液(Akorn，Abita Spring, LA)清洗。通过向腺体局部加入激动剂CCH(3 μ L，50 μ Μ)刺激LG，并通过在眼角中间小心使用2 μ L的微升毛细吸管(Drummond, Broomall, PA)收集泪液5分钟,并注意毛细管不要碰到角膜。每只眼用CCH刺激3次，结果每只眼的全部收集时间为15分钟。毛吸管通过厂商提供的抽吸器被清空转移到无菌小瓶中。从同一小鼠两眼收集到的泪液被合并并立即用于CATS活性分析。使用组织蛋白酶S活性分析试剂盒分析LG溶解物和泪液样品中的CATS活性。从每只小鼠收集到的全部体积的泪液或IOyg LG溶解物按照厂商使用说明被稀释构成100 μ L有或没有抑制剂的反应混合物。反应于37°C被培育1、2和18小时。所得荧光产物的浓度使用有505nm发射过滤器的荧光计测定。用组织蛋白酶H活性分析试剂盒(BioVision，Inc.)分析CATH活性。该方法与为CATS活性分析的方法类似，除了在本分析中仅分析LG匀浆而没有分析泪液。 结果NOD和BALB/c小鼠LG中组织蛋白酶家族成员和其它炎症性因子的基因表达谱。严重细胞外基质降解和免疫细胞浸润是12到18周雄性NOD小鼠LG的主要特征。组织蛋白酶是负责调节细胞外基质的蛋白酶的主要种类；事实上作为泪液分泌蛋白它们的其中一个作用是调节细胞外基质的体内平衡。在雄性NOD小鼠LG中分析基因表达谱是为了确定在其表达中可能的改变，使用基因表达微阵列分析来研究组织蛋白酶家族成员是否促成与免疫细胞浸润有关的这些病理学事件。结果在表I中体现。NOD小鼠LG中的组织蛋白酶H(Ctsh)、R (Ctsr)、S (Ctss)、W (Ctsw)和 Z(Ctsz)的 mRNA 的杂交信号和 BALB/c 对照品比较被增强。对于组织蛋白酶K(Ctsk)的其他组织蛋白酶家族成员没有没有，除了组织蛋白酶K(Ctsk)表现出BALB/c对照品40%的表达。还检测了巨噬细胞表达的细胞因子和其受体在NOD小鼠LG中相对于BALB/c对照品中的它们的mRNA的水平。然而，由于该技术对低丰度mRNA的相对不敏感性，只有一小部分的这些细胞因子和受体被微阵列检测(见表2)。雄性NOD小鼠LG中干扰素-Y、白介素-10受体α和肿瘤坏死因子受体α的mRNA水平也明显高于匹配BALB/c小鼠的mRNA水平。数据验证和基因表汰的扩大研究。微阵列的结果通过原位RT-PCR验证，其评价了所关注的组织蛋白酶家族成员和细胞因子的表达水平。除了来自12周雄性NOD和BALB/c小鼠LG中的总RNA外，还对来自年龄匹配的NOD SCID小鼠的总RNA进行评价。表INOD小鼠与BALB/c小鼠LG中不同表达的组织蛋白酶家族成员的微阵列分析对比
权利要求
1.确定哺乳动物是否可能或不可能患有自身免疫疾病的方法，包括在从哺乳动物分离的泪液样品中测定选自 Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra> 1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F或Lcn_2中的至少一种第一多肽和/或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶中的至少一种第二多肽的表达水平或活性水平，其中，与合适的对照相比，第一多肽的增加的表达水平或增加的活性水平，或者第二多肽降低的表达水平或降低的活性水平，表明所述哺乳动物可能患有自身免疫疾病；或者与合适的对照相比，缺少第一多肽的增加的表达水平或增加的活性水平和缺少第二多肽降低的表达水平或降低的活性水平，表明所述哺乳动物不大可能患有自身免疫疾病。
2.协助诊断哺乳动物自身免疫疾病的方法，包括在从哺乳动物分离的泪液样品中测定选自 Ctss、Ctsh、Ctsr> Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra、1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F 或 Lcn-2中的至少一种第一多肽和/或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶中的至少一种第二多肽的表达水平或活性水平，其中，与合适的对照物相比，第一多肽的增加的表达水平或增加的活性水平，或者第二多肽降低的表达水平或降低的活性水平，表明哺乳动物自身免疫疾病的可能的阳性诊断，从而协助诊断；或者与合适的对照相比，缺少第一多肽的增加的表达水平或增加的活性水平和缺少第二多肽降低的表达水平或降低的活性水平，表明哺乳动物自身免疫疾病的可能的阴性诊断，从而协助诊断。
3.诊断哺乳动物自身免疫疾病相对严重性的方法，包括在哺乳动物的泪液样品中测定选自 Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra、1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F 或 Lcn-2中的第一多肽或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶中的第二多肽的表达水平或活性水平，其中，与合适的对照物相比，第一多肽相对较高的表达水平或活性水平，或者第二多肽相对较低的表达水平或活性水平，表明个体患有相对更严重的自身免疫疾病。
4.如权利要求I至3中任一项所述的方法,其中所述第一多肽选自Ctss、Apo-F或Lcn_2o
5.如权利要求I至4中任一项所述的方法，其中所述多肽的表达水平通过以下组中的一种或多种方法检测荧光分析法、蛋白质印迹法、凝胶电泳法、ELISA、质谱法或蛋白质阵列法。
6.如权利要求I至4中任一项所述的方法，其中所述多肽的活性水平通过蛋白酶活性分析法检测。
7.如权利要求I至6中任一项所述的方法，进一步包括用希尔默测试、裂隙灯检查、放射性测试检查哺乳动物以协助诊断。
8.治疗患有自身免疫疾病的或处于患自身免疫疾病风险中的以及通过权利要求I至7中任一项所述的一种或多种方法识别为需要这种治疗的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的以下组中的至少一种物质从而治疗所述哺乳动物环孢菌素、西维美林、匹罗卡品、非留体抗炎药、皮质类固醇、免疫抑制剂或缓解疾病的抗风湿药。
9.如权利要求I至8中任一项所述的方法，其中所述自身免疫疾病为选自乳糜泻、I型糖尿病(IDDM)、红斑狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合症、Churg-Strauss综合症、桥本甲状腺炎、格雷夫症、原发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊椎炎、克隆氏病、皮肌炎、古德帕斯丘综合症、格林巴利综合症(GBS)、混合结缔组织疾病、多发性硬化症、重症肌无力、嗜眠病、寻常性天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述自身免疫疾病为红斑狼疮或斯耶格伦综合症。
11.如权利要求10的任一项所述的方法，其中所述斯耶格伦综合症为炎症性自身免疫泪腺疾病。
12.如权利要求I至11中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为人患者。
13.治疗患有自身免疫疾病或处于患自身免疫疾病风险中的哺乳动物的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的抑制选自Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw或Ctsz的多肽的表达或活性的药剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述多肽为Ctss。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述药剂为Ctss抗体。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述药剂为小分子Ctss抑制剂。
17.用于诊断自身免疫疾病的试剂盒,包括对选自Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra、I110、I110ra、I115、Tnfa、Apo-F、Lcn-2、乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶的多肽特异的探针或抗体以及使用说明。
18.如权利要求17所述的试剂盒，进一步包括收集人(患者)泪液的希尔默测试条。
19.确定哺乳动物是否可能或不可能患自身免疫疾病的方法，包括在分离自哺乳动物泪腺或唾液腺的腺泡细胞中确定选自CATS或Apo-F中的蛋白质的存在，其中，如果所述细胞中超过约20%的所述蛋白质不存在于所述细胞的基底膜附近，则所述哺乳动物可能患有自身免疫疾病；或者如果所述细胞中超过约80%的所述蛋白质存在于所述细胞的基底膜附近，则所述哺乳动物可能不患有自身免疫疾病。
20.如权利要求19所述的方法，其中，如果所述细胞中超过约50%的所述蛋白质不存在于所述细胞的基底膜附近，则所述哺乳动物可能患有自身免疫疾病。
21.协助诊断哺乳动物自身免疫疾病的方法，包括在分离自哺乳动物泪腺或唾液腺的腺泡细胞中确定选自CATS或APO-F中的蛋白质的存在，其中，所述细胞中超过约20%的所述蛋白质不存在于所述细胞的基底膜附近表明所述哺乳动物自身免疫疾病的可能的阳性诊断，从而协助诊断；或者所述细胞中超过约80%的所述蛋白质存在于所述细胞的基底膜附近表明所述哺乳动物自身免疫疾病的可能的阴性诊断，从而协助诊断。
22.如权利要求19所述的方法，其中，所述细胞中超过约50%的所述蛋白质不存在于所述细胞的基底膜附近表明所述哺乳动物自身免疫疾病的可能的阳性诊断，从而协助诊断。
23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为AP0-F。
24.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述自身免疫疾病为选自乳糜泻、I型糖尿病(IDDM)、红斑狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合症、Churg-Strauss综合症、桥本甲状腺炎、格雷夫症、原发性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊椎炎、克隆氏病、皮肌炎、古德帕斯丘综合症、格林巴利综合症(GBS)、混合结缔组织疾病、多发性硬化症、重症肌无力、嗜眠病、寻常性天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病中的一种或多种。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述自身免疫疾病为红斑狼疮或斯耶格伦综合症。
26.如权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
27.如权利要求I至12中任一项所述的方法，其中，一种第一多肽和/或第二多肽的表达水平或活性水平的测定包括在希尔默测试条上收集患者的泪液样品，所述希尔默测试条含有定量的且可探测标记的对所述第一多肽和/或第二多肽特异的底物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述定量的可探测标记的底物为荧光标记的抗体。
全文摘要
本发明提供协助诊断哺乳动物自身免疫疾病的方法，包括使哺乳动物的泪液样品与抗体接触，所述抗体在有利于抗体-多肽复合物的条件下特异性地与选自Ctss、Ctsh、Ctsr、Ctsw、Ctsz、Ifng、I16ra、1110、IllOra、1115、Tnfa、Apo-F或Lcn-2的第一多肽或选自乳过氧化物酶、乳铁蛋白或溶菌酶的第二多肽结合；以及测定所形成复合物的量，其中，与合适的对照相比，抗体-第一多肽复合物的增加的形成或抗体-第二多肽复合物的减少的形成表明哺乳动物自身免疫疾病的可能的阳性诊断，从而协助诊断。还提供治疗自身免疫疾病的方法。
文档编号C12Q1/68GK102625852SQ201080031114
公开日2012年8月1日 申请日期2010年7月6日 优先权日2009年7月7日
发明者吴凯瑾, 玛丽亚·夏洛塔·埃德曼, 莎拉·哈姆-阿尔瓦雷斯 申请人:南加利福尼亚大学