专利名称：经稳定化的酶组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含酶和辛醇的组合物。另外，本发明涉及包含过渡金属离子的组合物。
背景技术：
展示许多不同官能团的酶的复杂化学结构不仅给予了酶在催化大范围转化时前所未有的特异性和反应性，并且是酶属于相对易变的化合物的原因。显然，这一现象导致了下述事实用于优化酶稳定性的研究持续进行，导致对一般性问题产生了大量的通常是特异性的解答。酶可以通过酶三维结构的解折叠(unfolding)或通过化学降解而去稳定化 (destablized)。去稳定化可由于与极性溶剂、微生物攻击、电解质、表面活性剂、温度和极端PH的接触而容易地发生。为了补偿储藏阶段期间酶活性的损失，配制者可在液体酶组合物中使用过量的酶。然而，这是一种不受欢迎的解决方案，因为酶是相对昂贵的配制物成分。该问题可以通过添加稳定剂来克服。用于使酶稳定化的材料包括多种有机和无机化合物，例如多元醇，羧酸，羧酸盐，羧酸酯，和糖；钙盐；硼化合物，及其多种组合。也可以使用蛋白质提取物，通过抑制酶而使酶稳定化。然而，由于存在大量多种酶，所以仍然需要、并且将来也需要对酶去稳定化这一问题的替代性解决方案。发明详述本发明的第一方面中公开了包含酶和辛醇的组合物。这样的组合物令人惊讶地展示出与不含辛醇的相同混合物相比增强的稳定性。优选地，所述辛醇是ι-辛醇，但同分异构体例如2-辛醇、3-辛醇、2-甲基-1-庚醇、3-甲基-1-庚醇也展示出类似的特性。组合物中优选的辛醇量是占总组合物重量的0. 05%到15%，更优选地占总组合物重量的0. 1% 至Ij 5%。在本发明第一方面的一个实施方案中，酶是乙内酰脲消旋酶。具有乙内酰脲消旋酶活性的多肽(也称作乙内酰脲消旋酶)是本领域已知的。它们已在多种生物中被发现，例如 WO 01/2；3582 描述了来自 Arthrobacter aurescens (DSM 3747)的乙内酰脲消旋酶，JP 04271784描述了来自I^seudomonas NS 672的乙内酰脲消旋酶(Watabe et al.，J. Bact. 174,3461-3466(1992))。还描述了 Sinorhizobium meliloti (保藏号 CAC 47181，Capela et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 98,9877-9882 (2001))中，Microbacterium Iiquefaciens (保藏号 CAD 32593，EP 1188826)中，禾口 Agrobacterium tumefaciens 菌株 C58(保藏号 AAL 45498、AAK 88746 和 AAK 90298, Las Heras-Vazquez et al.，Biochem. Biophys. Res. Commun. 303,541-547 (2003), Wood et al.，Science 294,2317-2323(2001) 禾口 Hinkle et al. , NCBI database, Complete Genome Sequence of Agrobacterium tumefaciens C58(Rhizobium radiobacter C58), the Causative Agent of Crown Gall Disease in Plants. Direct Submission, submitted August 14,2001)中的乙内酰脲消旋酶。显示乙内酰脲消旋酶并且不具有底物抑制的经分离的多肽已在WO 2003/100050中描述。通常，乙内酰脲消旋酶意味着存在多于一种酶，例如乙内酰脲酶和消旋酶。已经发现本发明还适用于包含其他酶例如氨甲酰基水解酶(carbamoylases)的混合物。在第二个实施方案中，本发明提供了包含酶、辛醇和过渡金属离子的组合物。酶和金属的组合本身是已知的。事实上，某类酶(即金属酶)仅能在存在金属时发挥功能。金属酶是含有金属离子辅因子的酶的总称。事实上，所有酶中约四分之一到三分之一需要金属来发挥它们的功能。金属离子通常通过属于多肽链中氨基酸和/或掺入酶内的大环配体的氮、氧或硫原子来配位。金属离子的存在允许金属酶发挥功能，例如通过氨基酸中存在的有限的官能团集合不容易进行的氧化还原反应(.Messerschmidt et al. , (2001)Handbook of Metalloproteins ；Wiley, ISBN 0-471-62743-7)。通常，这些金属(例如过渡金属)的量非常低，从而在配制物中的浓度不超过l-lOOymol/kg。事实上，更高的浓度对酶而言通常是有毒的。惊讶地发现，某些相对高浓度的过渡金属对酶具有稳定化效应。因此，在包含酶的组合物中，范围从2mmol/kg到lOOmmol/kg的过渡金属离子浓度导致增强的酶稳定性。优选地，所述过渡金属以范围从2. 5mmol/kg到50mmol/kg，更优选地从3mmol/kg到25mmol/ kg的浓度存在。优选地，本发明的过渡金属是钴或锰。在本发明的上下文中，术语过渡金属(有时也称作过渡元素)是指下述元素，其原子具有不完全的d亚壳层，或能够产生具有不完全的d亚壳层的阳离子。该定义对应于元素周期表的第3族到第11族。本发明的第二个方面中提供了用于制备包含酶和辛醇的组合物的方法，所述方法包括在生产所述酶后添加辛醇。所述生产可以是发酵过程，任选地之后进行一个或多个下游加工步骤，例如浓缩，例如通过蒸发、渗滤(diafiltration)、冻干、微量过滤、超滤和技术人员已知的相似或其他技术进行。
图1展示了辛醇和锰(Mn2+)的存在对来自Escherichia coll RV308的L-乙内酰脲酶随时间的残余活性的影响。Y-轴表示以％为单位的相对于起始活性(设定为100%) 的残余活性。X-轴表示孵育时间(g)。图例 =空白(未添加Mn2+或辛醇)；Δ= ImM Mn2+ ；A = 5mM Mn2+; =IOmM Mn2+；〇=辛醇；·=辛醇+ImM Mn2+；■=辛醇+5mM Mn2+ ；□ =辛醇+IOmM Mn2+。可以看出，辛醇的添加导致与空白样品相比残余活性的提高。与ImM、 5mM和IOmM Mn2+(它们自身也对酶活性的稳定化具有影响)的组合进一步增强了辛醇的积极贡献。
实施例材料和方法除非另有说明，使用的所有分子技术基本上根据Maniatis et al. (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. Molecular Cloning 2nd edition. CSH Press)进行。用于将pKECaroP-hyul 构建体转化进 Escherichia coli RV308 的流程·在冰上融化hcherichia coli RV308小份试样QOO μ 1，超感受态) 添加15 μ 1 LR反应混合物(见上文)·在冰上孵育30分钟
·42 热激1分钟·在冰上将细胞冷却2分钟·添加1ml LB培养基(5g/l NaCl、5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨) 在37°C孵育1小时·涂布在补充有卡那霉素的LB琼脂平板上(5g/l NaCl、5g/l酵母提取物、10g/l 胰蛋白胨、15g/l琼脂、50mg/l卡那霉素)·在下孵育M小时·分离单个菌落用于在Escherichia coli RV308中表汰Hyu基因的流稈使用来自转化(见上文)的单个克隆接种补充有0. 05g/l卡那霉素和分别为ImM MnCl2或CoCl2的5ml 2xTY培养基(10g/l酵母提取物、16g/l胰胨、5g/l NaCl) 0将培养物在和150rpm下孵育M小时，然后用于接种补充有0. 05g/l卡那霉素和分别为ImM MnCl2或CoCl2的IOOmlhTY培养基。将培养物在前述条件下再次孵育小时，随后通过离心(20分钟，5000rpm，4°C )收获。将细胞沉淀物重悬于5ml Tris-HCl (lOOmM,pH7)中， 再次离心(20分钟，5000rpm，4°C )，并将细胞冷冻于_20°C下。分析方法乙内酰脲酶活件测定法单位定义一个乙内酰脲酶活件单位被定义为在pH8. 0和40°C下每分钟生产 Iymol N-氨甲酰基苯丙氨酸的酶的量。底愈130mM TRIS/HC1缓冲液pH8. 0中的IOOmM D/L-苯丙氨酸乙内酰脲悬浮液， 其还含有1. 43mM MnCl2。样品预处理将一克样品悬浮于还含有1. 43mM MnCl2的IOmL 130mM TRIS/HC1缓冲液PH8.0中。混合后用相同的缓冲液将悬浮液稀释至约0.9U/mL。使用前将样品保持在冰上。该方法的线性范围是从0. 16到1. 62U/mL。测定法将2. ImL底物悬浮液置于反应管中，随后在40°C水浴中预加热10分钟。 通过添加100 μ L样品并混合来起始反应。通过用100 μ L缓冲液代替样品来孵育底物，使底物空白被包括在内。30分钟后如下所述终止酶促反应添加400 μ L IM HCl溶液，之后混合，并随后在冰水上冷却。将反应混合物在0.45 μ m滤器上过滤。将澄清的溶液转移进 HPLC注射管中。Ml=ImM N-氨甲酰基-L-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸。反应混合物和标准的HPLC ·柱Xbridge 苯基 5 μ m，4. 6X150mm, Waters·检测器UV@220nm 流速1.2mL/分钟 注射体积20 μ 1 样品架温度10°C·柱温度室温·运行时间20分钟·流动相 A :40mM 磷酸缓冲液；ρΗ5· 2/ 乙腈(98/2 (v/v))
·流动相 B :40mM 磷酸缓冲液；ρΗ5· 2/ 乙腈(70/30 (v/v))·梯度
时间[分钟]I流动相Α[%]~~流动相Β[%]
权利要求
1.包含酶和辛醇的组合物，其中辛醇的量为按总组合物重量计0.到5%。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述辛醇是1-辛醇。
3.根据权利要求1到2中任一项所述的组合物，其中所述酶是乙内酰脲酶。
4.根据权利要求3所述的组合物，其还包含氨甲酰基水解酶。
5.根据权利要求3到4中任一项所述的组合物，其还包含消旋酶。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，其还包含过渡金属离子。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述过渡金属是钴或锰。
8.用于生产包含酶和辛醇的下述组合物的方法，其中辛醇的量为按总组合物重量计 0. 到5 %，所述方法包括在生产所述酶之后添加辛醇。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述辛醇是1-辛醇。
全文摘要
本发明涉及包含酶和辛醇的组合物。另外，本发明涉及包含过渡金属离子的组合物。
文档编号C12N9/86GK102482661SQ201080031045
公开日2012年5月30日 申请日期2010年6月15日 优先权日2009年7月9日
发明者威廉·比杰勒威尔德, 洛兰德·克里斯琴·沃林格, 鲁道夫·范·德·波尔 申请人:中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司