包含非复制性益生菌微生物的婴儿米粉的制作方法

专利名称：包含非复制性益生菌微生物的婴儿米粉的制作方法
包含非复制性益生菌微生物的婴儿米粉本发明涉及婴儿米粉领域。特别地，本发明涉及可用于增强婴儿免疫系统和/或可用于治疗或预防炎症病症的婴儿米粉领域。例如通过益生菌微生物可以提供这些益处。本发明的实施方案涉及婴儿米粉，所述婴儿米粉包含非复制性益生菌微生物，例如有生物活性的经热处理的益生菌微生物。通常用母乳喂养或者用液体婴儿喂养配方奶喂养新生婴儿，所述液体配方奶与母亲乳汁的内容物尽可能的相似。在婴儿时期的第一年内通常持续施用母乳喂养和/或婴儿配方奶。然而，通常在4-6个月时，婴儿发展了对其他食品的兴趣并且准备接受其他食品。该兴趣的迹象是婴儿开始能够坐立并且控制头的运动。婴儿能将食物从嘴的前面移到后面，因此舌头的协调允许婴儿从匙中吞下食物。 固体食物的引入对婴儿与食物建立积极的联系是重要的。对于正在成长的快乐的婴儿，这是发展一生健康饮食习惯的第一步。在此阶段推荐婴儿开始消费婴儿米粉。婴儿米粉将帮助婴儿感受味道、质地和营养。然而婴儿的消化道仍在发育中并且需要应付新的挑战固体食物。益生菌作为肠道微生物区系的一部分帮助胃更易耐受食物并且也可以例如增强免疫系统。在这方面新的创新产品例如是包含乳双歧杆菌培养物的雀巢婴儿米粉。该培养物维持健康的消化道微生物区系并且帮助支持婴儿健康的成长和发育。一般，认为益生菌对婴儿是安全的。然而，在特定的情况下，例如如果婴儿具有受损的免疫系统，那么没有医生的允许，不建议给婴儿使用益生菌。因此在本领域需要婴儿米粉，所述婴儿米粉提供益生菌能提供的益处，并且具有受损的免疫系统的婴儿没有任何顾虑也可以消费该婴儿米粉。本发明人解决了该需要。因此本发明的目的是提供容易被婴儿消化的婴儿米粉，所述婴儿米粉允许婴儿感受味道、质地和营养，同时提供益生菌的益处，而在工业规模上生产简单并且理想地在更长的货架期或者升高的温度下不会失去活性。本发明人惊奇的看到通过独立权利要求的主题能实现该目的。从属权利要求进一步发展了本发明的思想。本发明人提供包含非复制性益生菌微生物的婴儿米粉。本发明人惊奇的看到，例如在免疫增强效应方面和/或在抗炎效应方面，非复制性益生菌微生物比复制性益生菌微生物更有效。该现象是令人惊奇的，因为益生菌通常被定义为“当以足够的量施用时赋予宿主健康益处的活的微生物”(FA0/WH0指南)。大量出版的文献涉及活的益生菌。另夕卜，一些研究调查了非复制性细菌传递的健康益处并且大部分益生菌表明例如通过热处理引起的益生菌的灭活导致它们据说的健康益处的丧失(Rachmilewitz, D.,等人，2004, Gastroenterologyl26 :520-528 ；Castagliuolo,等人，2005, FEMS Immunol. Med.Microbiol. 43 :197-204 ；Gill, H. S.和 K. J. Rutherfurd, 2001, Br. J. Nutr· 86 :285-289 ；Kaila，M.，等人，1995，Arch. Dis. Child 72 :51-53.)。一些研究表明灭活的益生菌可保留一些健康效应(Rachmilewitz,D.,等人，2004,Gastroenterologyl26 :520-528 ；Gill,H. S.和K. J. Rutherfurd，2001，Br. J. Nutr. 86 :285-289)，但是显然，在本领域认为活的益生菌更有效。因此，现在发明人提供包含非复制性益生菌微生物的婴儿米粉。这些非复制性益生菌微生物仍然有生物活性。本发明的一个实施方案是婴儿米粉，所述婴儿米粉包含至少O. 48g/100kJ的蛋白质来源，最多I. lg/100kj的脂肪来源，糖类来源和非复制性益生菌微生物。婴儿米粉在本领域是已知的。婴儿米粉是给婴儿施用的包含谷物的组合物。通常用匙将它们施用给婴儿，并且例如可以以干的谷物提供给婴儿。方便婴儿米粉也在本发明 的范围内。食品标准提供了婴儿米粉应该包含的成分的指导。“婴儿”指的是不超过12个月的人。通常，在婴儿米粉中存在的热量密度以及蛋白质的量和类型，糖类和脂类应该经过小心调整以适应婴儿的需要并且其取决于婴儿的发育阶段和年龄。众所周知婴儿的营养需求随着婴儿的发育和年龄改变，并且婴儿米粉的组成理论上反映了这种改变。因此，将施用于4-6个月龄婴儿的本发明婴儿米粉可以具有220_240kJ/15g的能量密度，O. 8-1. 2g/15g的蛋白质来源，O. 1-0. 3g的脂肪来源和12. 3-12. 7g/15g糖类来源。这种婴儿米粉可以包含例如，大米粉、玉米麦芽糖糊精、维生素C和铁。给6-12个月龄婴儿施用的本发明婴儿米粉可以具有220_240kJ/15g的能量密度，
1.5-1.98/158的蛋白质来源，0.2-0.48的脂肪来源和11. 1_11. 5g/15g糖类来源。这种婴儿米粉可以包含例如，面粉、来自小麦的粗面粉、铁、维生素C、烟酸、维生素B6、维生素BI和玉米麦芽糖糊精。可从一种或多种去壳的谷物制备婴儿米粉，所述去壳的谷物基于干重组成最终混合物的至少25重量％。优选地用单一谷物-如稻或者小麦制备本发明的婴儿米粉-因为单一谷物组成不太可能引起变态反应。本发明的婴儿米粉可以进一步地包含益生元。在益生菌成为非复制性细菌之前益生元可以支持益生菌的生长。“益生元”指的是不能消化的食物物质，其促进健康有益的微生物和/或益生菌在肠中的生长。益生元在胃中和/或肠的上段不被分解并且在摄食它们的人的胃肠道中不被吸收，但是它们被胃肠道微生物群和/或益生菌发酵。例如Glenn R. Gibson 和 Marcel B. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human ColonicMicrobiota :Introducing the Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995125 :1401-1412 中定义了益生元。根据本发明可以使用的益生元没有特别地限制并且包括促进益生菌或健康有益的微生物在肠中生长的所有食物物质。优选地，它们可以选自任选地包含果糖、半乳糖、甘露糖的寡糖；膳食纤维，特别是可溶性纤维、大豆纤维；菊粉或者它们的混合物。优选的益生元是低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚异麦芽糖(MO)、低聚木糖(XOS)、低聚阿拉伯-木糖(AXOS)、低聚甘露糖(MOS)、大豆低聚糖、葡萄糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳酮糖(LA)、帕拉金糖(palatinose)低聚糖(PAO)、低聚麦芽糖、树胶和/或其水解产物、果胶和/或其水解产物。例如，婴儿米粉可以包含低聚果糖、菊粉或者它们的组合。通常地，在消费之前将婴儿米粉与水混合。例如本发明的15g婴儿米粉可以与9OmL水混合。根据本发明的婴儿米粉可以包含任何有效量的非复制性益生菌微生物，例如相应于约IO6至1012cfu/g干重的量的非复制性益生菌微生物。“非复制性”益生菌微生物包括已经受到热处理的益生菌。这包括灭活的、死的、无生活力的和/或以碎片如DNA、代谢物、胞质化合物和/或细胞壁物质存在的微生物。“非复制性”指的是通过经典的平板接种方法可以检测的无生活力的细胞和/或菌 落形成单位。在微生物书中概述了这些经典的平板接种方法James Monroe Jay, MartinJ.Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7th edition，SpringerScience, New York, N. Y. 790p。通常地,存活细胞的缺失可以按照以下显示用不同浓度细菌制备物(“非复制”的样品)接种并且在适合的条件(有氧和/或厌氧空气中持续至少24小时)下培育后，在琼脂平板上没有可见的菌落或者在液体生长培养基中没有增加的浊度。为本发明的目的将益生菌定义为“对宿主的健康或者安康有有益作用的微生物细胞制剂或者微生物细胞组分”(Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等人 “Probiotics :howshould they be defined” Trends Food Sci. Technol. 1999 :10107-10)。使用非复制性益生菌微生物的可能性提供了几个好处。在严重的免疫受损的婴儿中，在特殊的情况下由于患上菌血症的潜在风险，活的益生菌的使用受到限制。可以没有任何问题地使用非复制性益生菌。另外，非复制性益生菌微生物的提供在保留对婴儿健康益处的同时允许热重构。本发明的组合物包含足够至少部分产生健康益处的量的非复制性益生菌微生物。将足够实现该目的的量定义为“治疗有效剂量”。用于该目的的有效量将取决于本领域技术人员已知的很多因素如婴儿的体重和一般健康状况以及食品基质的影响。在预防应用中，根据本发明的组合物以一定量施用给易感染病症或者处在该病症的风险中的消费者，所述量足够至少部分地降低患上这种病症的风险。这种量被定义为“预防有效剂量”。再次，该精确量取决于很多因素如婴儿的健康状况和体重以及食品基质的影响。本领域技术人员将能适当地调节治疗有效剂量和/或预防有效剂量。一般本发明的组合物含有治疗有效剂量和/或预防有效剂量的非复制性益生菌微生物。通常，治疗有效剂量和/或预防有效剂量在每日剂量约0. 005mg-1000mg非复制性益生菌微生物范围内。在数值的量方面，经“短时间高温”处理的非复制性益生菌微生物可以在组合物中以相应于IO4至IO12当量cfu/g干组合物的量存在。显然，非复制微生物不形成菌落，因此，该术语将被理解为从IO4至1012cfu/g复制细菌得到的非复制微生物的量。该非复制微生物包括灭活的、无生活力的、死的或以碎片如DNA或细胞壁或胞质化合物存在的微生物。换句话说，组合物包含的微生物的数量用该数量微生物的菌落形成能力(CfU)表述，就好像全部微生物是存活的，而不考虑事实上它们是非复制的如灭活的或者死的、碎片化的或者这些状态的任一个或者全部的混合。优选地，非复制性益生菌微生物以相当于IO4至109cfu/g干组合物的量，更优选地以相当于IO5至109cfu/g干组合物的量存在。益生菌可以通过本领域已知的任何方法成为非复制性的。使益生菌菌株成为非复制性益生菌的如今可得到的技术通常是热处理、Y -照射、紫外线或者使用化学试剂(福尔马林、多聚甲醛)。优选地使用在食品工业中工业环境下相对容易应用的技术来使益生菌成为非复制性益生菌。今天市场上包含益生菌的大部分产品在它们的生产中是经热处理的。因此，方便 的是能对益生菌与生产的产品一起进行热处理或者至少以相似的方式处理，同时益生菌保留或者改进它们的有益性质或者甚至获得对于消费者新的有益性质。然而，在文献中通过热处理失活益生菌微生物通常与益生菌活性的至少部分损失相关联。本发明现在人惊奇的发现，例如通过热处理使益生菌微生物成为非复制性益生菌不会导致益生菌健康益处的损失，而是相反-可以增强现存的健康益处并且甚至产生新的健康益处。因此，本发明的一个实施方案是婴儿米粉，其中所述非复制性益生菌微生物通过热处理成为非复制性的益生菌。这种热处理可以在至少71. 5°C进行至少I秒。可以使用长期热处理或者短期热处理。今天在工业规模上，通常优选的是短期热处理，如UHT样的热处理。该类型的热处理减少了细菌负荷，并且减少了加工时间，因此减少了营养的破坏。本发明人第一次证实经高温短时间热处理的益生菌微生物显示抗炎免疫谱而不管它们起始的性质如何。特别地，通过该热处理发展了新的抗炎谱或增强了现存的抗炎谱。因此通过使用对应于通常工业可应用的热处理的特定的热处理参数可能产生具有抗炎免疫谱的非复制性益生菌微生物，即使该非复制性益生菌微生物的活的对应物不是抗炎菌株。因此，例如热处理可以是在约71. 5_150°C下约1_120秒的高温处理。高温处理可以是高温/短时间(HTST)处理或者超高温(UHT)处理。益生菌微生物可以在约71. 5_150°C下进行约1_120秒的短期高温处理。更优选地，微生物可以在约90_140°C，例如90° _120°C下进行约1_30秒的短期高
温处理。这种高温处理使微生物至少部分成为非复制性的。高温处理可以在正常大气压下进行，但也可以在高压下进行。典型的压力范围是I至50巴，优选I至10巴，更优选2至5巴。显然，如果益生菌在液体或者固体培养基中进行热处理，当加热时，压力是优选的。因此应用的理想压力将取决于提供微生物的组合物的性质和使用的温度。
高温处理可以在约71. 5_150°C，优选地约90_120°C，甚至更优选地约120_140°C的温度范围内进行。高温处理可以在约1-120秒，优选地约1-30秒，甚至更优选地约5_15秒的短期内进行。该给定的时间范围指的是益生菌微生物在给定的温度下进行的时间。注意取决于提供微生物的组合物的性质和量并且取决于使用的加热设备的结构，热应用的时间可以不同。然而，通常用高温短时间(HTST)处理、巴氏瞬间灭菌法或者超高温(UHT)处理处理本发明的组合物和/或微生物。 UHT处理是超高温处理或者超热处理(都简写为UHT)，所述UHT处理涉及在超过1350C (275 0F )的温度下通过短时间约1_10秒的加热使组合物至少部分灭菌，超过135°C的温度是灭活奶中细菌孢子需要的温度。例如，用超过135°C的温度的方式加工奶允许在必要的保持时间(2-5秒)内降低细菌负荷，使得能够连续流动操作。有两种主要类型的UHT系统直接和间接系统。在直接系统中，通过蒸汽注射或者蒸汽注入处理产品，然而在间接系统中，使用板式热交换器、管式热交换器或者刮面式换热器对产品进行热处理。UHT系统的组合可应用于产品制备方法中的任一步骤或者多个步骤。HTST处理定义如下(高温/短时间)设计的巴氏消毒法实现了 5个数量级的减少灭活奶中存活微生物数目的99. 9999%。认为该处理足够破坏几乎全部的酵母、霉菌和常见的腐败细菌并且也保证足够破坏常见致病性热抗性生物。在HTST方法中将奶加热到71. 7V (161 0F )持续 15-20 秒。巴氏瞬间灭菌法是易腐饮料如水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品的热巴氏消毒法。它在产品装入容器之前进行以杀死腐败微生物从而使产品更安全并且延长它们的货架期。当液体在71. 50C (160 0F )至74°C (165 0F )的温度下进行约15至30秒的处理时，液体在可控的持续流中移动。对于本发明的目的，术语“短时间高温处理”将包括例如高温短时间(HTST)处理、UHT处理、和巴氏瞬间灭菌法。因为这样的热处理提供了具有改进的抗炎谱的非复制性益生菌，本发明的婴儿米粉可用于预防或治疗炎症病症。使用本发明制备的组合物可以治疗或者预防的炎症病症不受特别的限制。例如，炎症病症可以选自急性炎症，如脓毒；烧伤；以及慢性炎症如炎性肠病，例如克隆病、溃疡性结肠炎、隐窝炎、坏死性肠结肠炎；皮肤炎症，如紫外线或者化学诱导的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤；易激肠综合症；眼炎症；变态反应；哮喘以及它们的组合。如果使用长期热处理使益生菌微生物成为非复制微生物，这种热处理可以在约70-1500C的温度范围进行约3分钟-2小时，优选地在80-140°C的范围进行5分钟-40分钟。尽管本领域一般性教导了通过长期热处理成为非复制的细菌在发挥它们的益生菌性质方面一般没有活细胞有效，但是本发明人能证实经热处理的益生菌比它们活的对应物更好地刺激免疫系统。本发明也涉及包含益生菌微生物的婴儿米粉，所述益生菌微生物通过在至少约70°C下至少约3分钟的热处理成为非复制的益生菌。通过体外免疫作图证实非复制性益生菌的免疫增强效果。使用的体外模型使用来自人外周血单核细胞(PBMCs)的细胞因子作图，并且在本领域中被接受为用于免疫调节化合物检测的标准模型(Schultz 等人,2003，Journal of Dairy Research 70,165-173;Taylor 等人,2006, Clinical and Experimental Allergy, 36,1227-1235 ;Kekkonen 等人，2008, World Journal of Gastroenterology,14,1192-1203) 一些作者/研究团队已经使用了体外的PBMC测定，例如根据它们的免疫谱，SP它们的抗-或者促-炎症特征对益生菌分类(Kekkonen等人,2008, World Journal ofGastroenterology, 14,1192-1203)。例如，在肠结肠炎的小鼠模型中已经显不该测定允许候选益生菌抗炎效应的预测(Foligne, B.,等人,2007, World J. Gastroenterol. 13 236-243)。此外，在临床试验中该测定通常用作读出并且显示得到与临床结果一致的结 果(Schultz 等人，2003, Journal of Dairy Research 70,165-173 ;Taylor 等人，2006,Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235)。在过去的几十年中变应性疾病已经逐步增加并且如今被WHO认为是流行病。一般来说，认为免疫系统的Thl和Th2反应之间的不平衡导致对Th2介体产生的强烈的偏向，弓丨起变态反应。因此，可通过恢复免疫系统的Thl和Th2臂之间适当的平衡减轻、下调或者预防变态反应。这暗示了减轻Th2反应或者至少暂时地增强Thl反应的必要性。后者将是免疫增强反应的特征，常伴随着例如IFN Y，TNF- α和IL-12的更高水平(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203 ；Viljanen M.等人，2005, Allergy,60,494-500)。因此，本发明的婴儿米粉允许治疗或者预防涉及受损的免疫防御的病症。因此，通过使用本发明制备的组合物可以治疗或者预防的与受损的免疫防御相关的病症不受特别地限制。例如，所述病症可以选自感染，特别是细菌、病毒、真菌和/或寄生虫的感染；吞噬细胞缺失；低到严重的免疫抑制水平，如通过应激或者免疫抑制药物、化学疗法或者放射疗法诱导的那些；免疫活性降低的免疫系统的天然状态，如新生儿的免疫系统；变态反应；以及它们的组合。本发明描述的婴儿米粉允许增强婴儿对疫苗特别是口服疫苗的应答。非复制微生物的任何量将是有效的。然而，通常优选地，至少90%，优选地至少95 %，更优选地至少98 %，最优选地至少99 %，理想地99. 9 %，最理想地全部益生菌是非复制的。在本发明的一个实施方案中，所有微生物是非复制的。因此，在本发明的婴儿米粉中，至少90 %，优选地至少95 %，更优选地至少98 %，最优选地至少99%，理想地99. 9%，最理想地全部益生菌是非复制的。所有益生菌微生物可用于本发明的目的。例如，益生菌微生物可以选自双歧杆菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属或者它们的组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilu)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、二丁酮乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和 / 或它们的混合物。根据本发明的婴儿米粉可以例如包含非复制的益生菌微生物，所述益生菌微生物选自长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、约汉逊氏乳杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球 菌NCC 2059、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC 15、乳乳球菌NCC2287或它们的组合。所有这些菌株按照布达佩斯条约保藏和/或可以通过商业途径得到。按照布达佩斯条约已经保藏的菌株如下长双歧杆菌NCC 3001 ATCC BAA-999双歧杆菌NCC 2705 :CNCM 1-2618短双歧杆菌NCC 2950 :CNCM 1-3865乳双歧杆菌NCC 2818 :CNCM 1-3446类干酪乳杆菌NCC 2461 CNCM 1-2116鼠李糖乳杆菌NCC 4007 :CGMCC I. 3724嗜热链球菌NCC 2019 :CNCM 1-1422嗜热链球菌NCC 2059 :CNCM 1-4153乳乳球菌NCC 2287 :CNCM 1-4154干酪乳杆菌NCC 4006 :CNCM 1-1518干酪乳杆菌NCC 1825 =ACA-DC 6002嗜酸乳杆菌NCC 3009 =ATCC 700396保加利亚乳杆菌NCC 15 CNCM 1-1198约汉逊氏乳杆菌Lal :CNCM 1-1225路氏乳杆菌DSM17983 :DSM17983路氏乳杆菌ATCC55730 ATCC55730大肠杆菌Nissle 1917 :DSM 6601本领域的技术人员将理解他们可以自由组合本文描述的本发明的所有特征，而不背离公开的本发明范围。本发明其他的优点和特征从以下的实施例和附图中是明显的。图IA和B显示用“短时间高温”处理的益生菌的抗炎免疫谱的增强。图2显示非抗炎益生菌菌株经过“短时间高温”处理后成为抗炎的益生菌菌株，即在体外展示显著的抗炎免疫谱。图3A和B显示通过商业途径可得到的产品中使用的益生菌菌株，其经过“短时间高温”处理后在体外展示增强的或者新的抗炎免疫谱。图4A和B显示乳品起始菌株(即Lcl起始菌株)，其经过高温热处理后在体外展示增强的或者新的抗炎免疫谱。图5显示非抗炎益生菌菌株，其经过HTST处理后在体外展示抗炎免疫谱。图6 :PBMC 数据的主要成分分析(IL-12p40，IFN_ Y，TNF_a，IL-10)，所述 PBMC 数据由活的和经热处理的(140°C 15秒)益生菌和乳品起始菌株产生。每个点代表活的或经 热处理的一种菌株，所述菌株通过它的NCC号或者名称鉴定。图7显示活的和受热处理的(85°C，20分钟)菌株的IL-12p40/IL_10比例。总的来说，在85°C 20分钟的热处理导致IL-12p40/IL-10比例的增加，该结果与本发明的“短时间高温”处理的结果相反(

图1、2、3、4和5)。图8显示体外细胞因子分泌的增强，该细胞因子分泌来自受热处理的细菌刺激的人 PBMCs。图9显示在用盐水攻击的OVA敏化的小鼠(阴性对照)中，在用OVA攻击的OVA敏化的小鼠(阳性对照)以及用OVA攻击并且用进行热处理的或者活的短双歧杆菌NCC 2950处理的OVA敏化小鼠中观察的腹泻强度的百分数。结果显示为腹泻强度的百分数(平均值土SEM，从4次独立的实验计算)，100%的腹泻强度相应于阳性对照(敏化并且用变应原攻击的)组中发生的症状。实施例I :方法学细菌制备活的益生菌在宿主免疫系统上传递的健康益处一般认为是菌株特异性的。在体外(PBMC测定)诱导高水平IL-10和/或诱导低水平促炎细胞因子的益生菌在体内已经显示是有效的抗炎菌株(Foligne, B.,等人，2007, World J. Gastroenterol. 13 :236-243)。一些益生菌菌株用于研究受热处理的益生菌的抗炎性质。这些益生菌菌株是长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC 2818、类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)以及大肠杆菌Nissle。也测试了一些起始培养菌株，其包括商业上用于生产雀巢Lcl发酵产品的一些菌株嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、保加利亚乳杆菌NCC15和乳乳球菌NCC 2287。在5-15L生物反应器中用为每种菌株优化的条件培养细菌细胞。可以使用所有常用的细菌生长培养基。本领域的技术人员已知这些培养基。当PH调节到5. 5时，连续地加入30%的碱溶液(NaOH或Ca(OH)2)。适当时，通过向顶空充入CO2维持厌氧条件。在标准的厌氧条件下培养大肠杆菌。通过离心(5，OOOx g，4°C )收集细菌细胞并在适当体积的磷酸缓冲盐水(PBS)中重悬浮以达到约109-101(lCfU/ml的终浓度。用15%的甘油将制备物的一部分冷冻于-80°C。对细胞的另一部分通过如下条件进行热处理-超高温通过间接热注射，在140°C持续15秒，
-高温短时间(HTST)通过间接热注射，在74°C，90V和120 V分别持续15秒，-长时间低温(85°C，20分钟)，在水浴中。热处理时，将样品冷冻于_80°C直至使用。细菌制备物的体外免疫作图评估活的和受热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导来自人血细胞的特定细胞因子分泌的能力)。从血液滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。用细胞密度梯度分离后，收集单核细胞并且用Hanks平衡盐溶液洗涤两次。然后用补充10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎，法国)、1 % L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/链霉素(Sigma)以及O. I %庆大霉素(Sigma)的Iscove’ s改良的Dulbecco’ s培养基(IMDM, Sigma)重悬浮细胞。然后在48孔板中将PBMCs (7xl05细胞/孔)与活的以及经热处理的细菌(相当于7xl06cfu/孔)共同培养36小时。培养36小时后，在细胞因子测量之前将培养板冷冻并保·存于-20°C。平行地进行(即对相同批次的PBMCs进行相同的实验)活的细菌和它们受热处理的对应物的细胞因子作图。36小时的培育后，按照制造商的说明用ELISA(R&D DuoSet人IL-10，BD OptEIA人IL12p40，BD OptEIA人TNFa，BD OptEIA人IFN-Y )测定细胞培养上清液中的细胞因子(IFN-y ,IL-12p40,TNF-a 和 IL-10)水平。IFN-Y，IL_12p40 和 TNF-a 是促炎细胞因子，而IL-10是有效的抗炎介体。结果表示成4个个体供体的平均值(pg/ml) +/-SEM，并且代表每次实验用4个供体进行的2次单独实验的结果。计算每种菌株的IL-12p40/IL-10比例作为体内抗炎效应的预测值(Foligne, B.,等人,2007, World J. Gastroenterol. 13 236-243)。将通过ELISA(见上文)测定的每种菌株的数值细胞因子值传送至BioNumericsv5. 10软件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利时)。对该组数据进行主要成分分析(PCA，尺寸标注技术)。该分析包括减去这些特征上的均值以及除以这些特征上的方差。结果通过超高温(UHT)/高温短时间(HTST)样的处理产生的抗炎谱对研究的益生菌菌株进行一系列的热处理(超高温(UHT)，高温短时间(HTST)以及85°C下20分钟)并将它们的体外免疫谱与活细胞的免疫谱比较。当与人PBMC温育时，活的微生物(益生菌和/或乳品起始培养物)诱导不同水平的细胞因子产生(图1，2，3，4和5)。这些微生物的热处理以温度依赖的方式改变PBMC产生的细胞因子水平。“短时间高温”处理(120°C或140°C 15秒)产生具有抗炎免疫谱的非复制细菌(图1，2，3和4)。实际上，经UHT样处理的菌株(140°C，15秒)诱导更少的促炎细胞因子(TNF-α，IFN- Y ,IL-12p40)而维持或者诱导额外的IL-10产生(与活的对应物比较)。与活细胞相比,任何经UHT样处理的菌株得到的IL-12p40/IL-10比例更低(图1，2，3和4)。对于经HTST样处理，即进行120°C 15秒(图1，2，3和4)，或74°C和90°C 15秒(图5)热处理的细菌，该观察结果也是有效的。热处理(UHT样或HTST样处理)对益生菌菌株(图1，2，3和5)和乳品起始培养物(图4)的体外免疫谱具有相似的效应。PBMC数据的主要成分分析揭示活的菌株全部沿着X轴散布，说明所述菌株在体外展示非常不同的免疫谱促炎细胞因子的从低(左侧)到高(右侧)的诱导物，所述PBMC数据由活的和经热处理(140°C，15秒)的益生菌和乳品起始菌株产生。经热处理的菌株聚集在图的左侧，表明经热处理的菌株诱导较少的促炎细胞因子(图6)。相比，在85°C热处理20分钟的细菌比活细胞诱导更多的促炎细胞因子和更少的IL-10，得到更高的IL-12p40/IL-10比例(图7)。UHT样和HTST样处理增强或者产生抗炎谱。不管它们各自起始的免疫谱(活细胞)如何，经UHT和HTST处理的菌株展示了抗炎谱。已知体内抗炎和体外展示抗炎谱的益生菌菌株(长双歧杆菌NCC 3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818)经“短时间高温”处理后在体外展示增强的抗炎谱。如图I显示，经UHT样处理的双歧杆菌菌株的IL-12p40/IL-10比例比活的对应物的IL-12p40/IL-10比例更低，因此经UHT样处理的样品显示改 进的抗炎谱。更显著地，为非抗炎活菌株也证实通过UHT样或HTST样处理产生抗炎谱。活的鼠李糖乳杆菌NCC 4007和类干酪乳杆菌NCC 2461都在体外展示高的IL-12p40/IL_10比例(图2和5)。显示这两种活的菌株不能提供针对小鼠中TNBS诱导的结肠炎的保护。经“短时间高温”处理后(UHT或HTST)，鼠李糖乳杆菌NCC 4007和类干酪乳杆菌NCC 2461诱导的IL_12p40/IL-10比例显著地降低，达到低至用双歧杆菌菌株得到的水平。这些低的IL-12p40/IL-10比例是由于IL-12p40产生的低水平以及IL-10分泌没有改变(鼠李糖乳杆菌NCC 4007)或者受到显著诱导(类干酪乳杆菌NCC 2461)(图2)。因此-通过UHT样和HTST样的热处理可以增强活的微生物的抗炎谱(例如长双歧杆菌NCC 2705、长双歧杆菌NCC 3001、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818)。-通过UHT样和HTST样的热处理可以从非抗炎的活的微生物(例如，鼠李糖乳杆菌NCC 4007、类干酪乳杆菌NCC 2461、乳品起始株嗜热链球菌NCC 2019)产生抗炎谱。-证实从商业途径可得到的产品中分离的菌株(图3A&B)也具有抗炎谱，所述菌株包括益生菌大肠杆菌菌株。对于所有测试的益生菌和乳品起始菌株，例如乳杆菌、双岐杆菌和链球菌，UHT样/HTST处理的影响是相似的。将UHT样/HTST处理应用于体外展示不同的免疫谱的一些乳杆菌、双岐杆菌和链球菌。所有这些菌株经过UHT样/HTST处理后比它们活的对应物(图1，2，3，4、5和6)诱导更少的促炎细胞因子，表明UHT样/HTST处理对得到的非复制细菌的免疫性质的影响可以推广至所有益生菌，特别是乳杆菌和双岐杆菌以及特定的大肠杆菌菌株，并且推广至所有乳品起始培养物，特别是链球菌、乳球菌和乳杆菌。实施例2 方法学细菌制备用五种益生菌菌株研究非复制性益生菌的免疫增强性质3种双岐杆菌(长双歧杆菌NCC 3001、乳双歧杆菌NCC 2818、短双歧杆菌NCC 2950)和2种乳杆菌(类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007)。细菌细胞在MRS上以批次发酵的形式在37°C生长16-18小时，不控制pH。离心细菌细胞(5，OOOx g，4°C )并且在用盐水稀释之前用磷酸缓冲盐水重悬浮细菌细胞以达到约10E10cfu/ml的终浓度。长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC 2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007在水浴中85°C下热处理20分钟。短双歧杆菌NCC 2950在水浴中90°C下热处理30分钟。等分经热处理的细菌悬浮液，并且在使用之前将细菌悬浮液冷冻保存于_80°C。活的细菌在使用之前在15% PBS-甘油中-80°C贮存。细菌制备物的体外免疫作图评估活的和受热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导来自人血细胞的特异细胞因子分泌的能力)。从血滤器中分离人外周血单核细胞(PBMCs)。用细胞密度梯度分离后，收集单核细胞并且用Hanks平衡盐溶液洗涤两次。用补充10%胎牛血清(Bioconcept，巴黎，法国)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/链霉素(Sigma)以及0.1%庆大霉素(Sigma)的Iscove’ s改良的Dulbecco’ s培养基(IMDM, Sigma)重悬细胞。然后在48孔板中将PBMCs (7xl05细胞/孔)与活的以及经热处理的细菌(相当于7xl06cfu/孔)共同 培养36小时。检测活的和受热处理的细菌对PBMCs的效应，该PBMCs来自分入2次单独实验中的8个个体供体。培养36小时后，在细胞因子测量之前将培养板冷冻并保持在_20°C。平行进行(即相同的实验中在相同批次的PBMCs上)活的细菌和它们受热处理的对应物的细胞因子作图。按照制造商的说明，用ELISA (R&D DuoSet 人 IL-10，BD OptEIA 人 IL12p40, BDOptEIA人TNFa，BD OptEIAAlFN-Y)测定培养36小时后细胞培养上清液中的细胞因子(IFN-y ,IL-12p40,TNF-a 和 IL-10)水平。IFN-Y，IL_12p40 和 TNF-a 是促炎细胞因子，而IL-10是重要的抗炎介体。结果表示成4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM，并且结果代表2次单独实验(每次实验用4个供体进行)。活的和经热处理的短双歧杆菌NCC 2950在变应性腹泻的预防中的体内效应用变应性腹泻的小鼠模型检测短双歧杆菌NCC 2950的Thl促进效应(Brandt E. B等人，JCI 2003 ; 112 (I I) :1666-1667)。雄性Balb/c小鼠在致敏(以14天的间隔经腹膜内注射两次卵白蛋白(OVA)和硫酸铝钾；第O天和第14天)后受到6次OVA的经口攻击(第27天、29天、32天、34天、36天、39天)，导致暂时的临床症状(腹泻)和免疫参数的改变(总的IgE的血浆浓度，OVA特异的IgE，小鼠肥大细胞蛋白酶1，即MMCP-1)。在OVA致敏之前4天(第-3天、-2天、-I天、O天以及第11天、12天、13天和14天)以及在攻击时期中(第23天至39天)通过管饲法施用活的或者在90°C热处理30分钟的短双歧杆菌NCC2950。使用约IO9菌落形成单位(cfu)或者当量cfu/小鼠的每日细菌剂量。经过热处理后诱导‘促炎’细胞因子的分泌体外评估了经热处理的细菌菌株刺激人外周血单核细胞(PBMCs)的细胞因子分泌的能力。将经热处理的细菌刺激PBMCs时基于四种细胞因子的免疫谱与在相同的体外测定中活的细菌细胞诱导的免疫谱比较。平板接种经热处理的制备物并且用于评估任何活菌计数的缺失。经热处理的细菌制备物在平板接种后没有产生任何菌落。当用PBMCs温育时，活的益生菌诱导不同的和菌株依赖性的细胞因子产生水平(图8)。与益生菌活的对应物比较，益生菌的热处理改变了 PBMCs产生的细胞因子水平。经热处理的细菌比它们活的对应物诱导更多的促炎细胞因子(TNF- a，IFN- y，IL_12p40)。相t匕，与活细胞比较，经热处理的细菌诱导相似或者更低量的IL-10 (图8)。这些数据表明经热处理的细菌比它们活的对应物更能刺激免疫系统，并且因此更能加强弱化的免疫防御。换句话说，体外数据说明受热处理后细菌菌株的增强的免疫增强效应。为了说明经热处理的短双歧杆菌NCC 2950(与活细胞相比)对免疫系统的增强效应，在变应性腹泻的动物模型中测试了活的和经热处理的短双歧杆菌NCC 2950 (菌株A)。与阳性对照组比较，用经热处理的短双歧杆菌NCC 2950处理后，腹泻强度明显地持续降低(41.1% ±4. 8)，然而用活的短双歧杆菌NCC 2950处理后，腹泻强度只降低20±28. 3%。这些结果表明经热处理的短双歧杆菌NCC 2950比它的活的对应物展示针对变应性腹泻增强的保护效应(图9)。因此，显示经过热处理后益生菌增强免疫防御的能力得到提高。实施例3和4:
可以制备以下的组合物对于4-6个月龄的婴儿成分大米粉、玉米麦芽糖糊精、维生素C、矿物质(铁)。
权利要求
1.婴儿米粉，其包含至少O.48g/100kJ的蛋白质来源，最多I. lg/100kj的脂肪来源，糖类来源和非复制性益生菌微生物。
2.根据权利要求I的婴儿米粉，其将施用于4-6个月龄的婴儿，具有220-240kJ/15g的能量密度，O. 8-1. 2g/15g的蛋白质来源，O. 1-0. 3g的脂肪来源和12. 3-12. 7g/15g糖类来源，并且包含大米粉、玉米麦芽糖糊精、维生素C和铁。
3.根据权利要求I的婴儿米粉，其将施用于6-12个月龄的婴儿，具有220-240kJ/15g的能量密度，I. 5-1. 9g/15g的蛋白质来源，O. 2-0. 4g的脂肪来源和11. 1-11. 5g/15g糖类来源，并且包含面粉、来自小麦的粗面粉、铁、维生素C、烟酸、维生素B6、维生素BI和玉米麦芽糖糊精。
4.根据前述权利要求之一的婴儿米粉，其进一步包含益生元，例如低聚果糖和菊粉。
5.根据前述权利要求之一的婴儿米粉，其中约15g所述婴儿米粉将与90mL水混合。
6.根据前述权利要求之一的婴儿米粉，其包含相应于约IO6至IO12Cfu量的非复制性益生菌微生物。
7.根据前述权利要求之一的婴儿米粉，其中所述非复制性益生菌微生物通过热处理，优选地通过在至少71. 5°C至少I秒的高温处理成为非复制性微生物。
8.根据权利要求7的婴儿米粉，其中所述热处理是在约71.5-150°C约1_120秒的高温处理，并且优选地是高温/短时间(HTST)处理或者超高温(UHT)处理。
9.根据权利要求8的婴儿米粉，其用于炎性病症的预防或治疗。
10.根据权利要求7的婴儿米粉，其中所述热处理在约70-150°C的温度范围内进行约3分钟至2小时，优选地在约80-140°C的温度范围内进行约5分钟至40分钟。
11.根据权利要求10的婴儿米粉，其用于涉及受损的免疫防御的病症的预防或治疗。
12.根据前述权利要求之一的婴儿米粉，其中至少90%，优选地至少95%，更优选地至少98 %，最优选地至少99 %，理想地99. 9 %，最理想的全部所述益生菌是非复制性的。
13.根据前述权利要求之一的婴儿米粉，其中所述益生菌微生物选自双歧杆菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属或者它们的组合，例如长双歧杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约汉逊氏乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、乳乳球菌、嗜热链球菌、乳乳球菌、二丁酮乳球菌、乳脂乳球菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌、大肠杆菌和/或它们的混合物。
14.根据前述权利要求之一的婴儿米粉，其中所述益生菌微生物选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC 2705、短双歧杆菌NCC 2950、乳双歧杆菌NCC 2818、约汉逊氏乳杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC 2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、路氏乳杆菌DSM17983、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC 2019、嗜热链球菌NCC 2059、干酪乳杆菌NCC 4006、嗜酸乳杆菌NCC 3009、干酪乳杆菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳乳球菌NCC 2287或它们的组合。
15.根据前述权利要求之一的婴儿米粉，其每日剂量含有约O.005mg-1000mg的非复制性微生物。
全文摘要
本发明涉及婴儿米粉领域。特别地，本发明涉及可用于增强婴儿免疫系统和/或可用于治疗或预防炎症病症的婴儿米粉领域。例如通过益生菌微生物可以提供这些益处。本发明的实施方案涉及婴儿米粉，所述婴儿米粉包含非复制性益生菌微生物，例如有生物活性的经热处理的益生菌微生物。
文档编号A23L1/30GK102917714SQ201080030989
公开日2013年2月6日 申请日期2010年5月11日 优先权日2009年5月11日
发明者A·梅赛尼尔, S·努特恩, G·普里乌特 申请人:雀巢产品技术援助有限公司