专利名称：产生产量大大提高的phb缺陷型鞘氨糖(定优胶)的鞘氨醇单胞菌菌株的制作方法
技术领域：
本申请大体上涉及对产生高产量的具有改良过滤性的定优胶(diutan)的PHB缺陷型鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)菌株的构建。另一方面，本申请涉及从产生高产量的具有改良过滤性的定优胶的PHB缺陷型鞘氨醇单胞菌菌株产生的定优胶。2.相关技术描述大量鞘氨醇单胞菌属细菌产生称作鞘氨糖(sphingan)的多糖，所述多糖具有带大体上保守的四糖骨架结构和不同侧链的相关结构(参考文献第1、6、7、8、10号)。商业上生产用于食品、油田或个人护理应用的鞘氨糖结冷胶(gellan)、威兰胶(we 1 an)、鼠李胶 (rhamsan)和定优胶。鞘氨糖多糖的价值在于其改变水性溶液流变学即增稠液体、悬浮固体、稳定乳剂或形成凝胶和膜的能力。鞘氨糖在结构上互为相关，但不完全相同。鞘氨醇单胞菌属的通常成员和其产生的鞘氨糖包括多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea)ATCC31461，该菌产结冷胶(S-60)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)ATCC31555，该菌产威兰胶(S-130)；鞘氨醇单胞菌ATCC 31961，该菌产鼠李胶(S-194)；鞘氨醇单胞菌ATCC 53159，该菌产定优胶(S-657)；鞘氨醇单胞菌ATCC 31554，该菌产尚未命名的多糖(S-88)；鞘氨醇单胞菌 ATCC31853，该菌产尚未命名的多糖(S-198)；鞘氨醇单胞菌ATCC 21423，该菌产尚未命名的多糖(S-7)；鞘氨醇单胞菌ATCC 53272，该菌产尚未命名的多糖(NW-Il)；鞘氨醇单胞菌 FERM-BP2015(之前的广泛产碱菌(Alcaligenes latus) B-16)，该菌产阿卡兰胶(alcalan) (生物聚合物B-16)等。对鞘氨醇单胞菌(Sphingomonads)和其产生的多糖的描述可以见于例如美国专利第4，377，636号；第4，326，053号；第4，326，052号和第4，385，123号(关于ATCC 31461及其S-60多糖)；美国专利第4，342，866号(关于ATCC 31555和S-130)；美国专利第4，401，760号(关于ATCC 31961和S-194)；美国专利第5，175，278号(关于 ATCC 53159 和 S-657)；美国专利第 4，331，440 号和第 4，535，153 号(关于 ATCC 31554 和 S-88)；美国专利第4，529，797号(关于ATCC 31853和S-198)；美国专利第3，960，832号 (关于ATCC 21423和S-7)；美国专利第4，874，044号(关于ATCC 53272和NW-11)；美国专利第5，175，279号(关于FERM BP-2015和B-16)，以与本文公开内容无不一致处的程度将所述每一篇文献通过引用整体并入本文。通过菌株鞘氨醇单胞菌ATCC 53159的发酵，制备了特定鞘氨糖定优胶(也称作杂多糖S-657)(参考文献第17号)。定优胶在水性溶液中展现独特的流变性质，包括高热稳定性、极佳的悬浮性质和低浓度下生成高粘度的能力。所述定优胶多糖对诸如水的极性溶剂赋予显著的假塑性，以致定优胶能用作有微粒悬浮、摩擦减小、乳剂和泡沫稳定化、滤饼沉淀和过滤控制能力的流变改性剂。因此，已发现定优胶在包括如美国专利第6，110，271 号所公开的水泥基系统(cementitious system)在内的多种背景下作为流变改性剂的工业效用，以与本文公开内容无不一致处的程度将该美国专利通过引用整体并入本文。定优胶由重复单元构成，所述重复单元具有由[—4)-a -L-鼠李糖-(1 — 3)-i3_D-葡萄糖-(1 — 4)-i3_D-葡糖醛酸-(1 — 4)-i3_D-葡萄糖-(1 —]构成的骨架和结合至(1 — 4)连接的葡萄糖残基的二 -糖L-鼠李糖侧链(参考文献第2、7 号)。每个重复单元将两个0-乙酰基结合至(1 — 3)连接的葡萄糖的2’和6’位(参考文献第4号)。在阐明定优胶和其它鞘氨糖生物合成潜在的遗传学和生物化学方面已取得进展。 用于鞘氨糖S-88、S-7和结冷胶生物合成的基因已被鉴定(参考文献第5、12、13、15号)。 已生化分析了数种骨架结构糖基转移酶的基因(参考文献第11、14号)，这有基因gelC和 gelE，其潜在地参与链长度决定(参考文献第9号)。用于合成糖核苷酸前体的基因中的数种也已阐明(参考文献号第12号)。较少定义多聚、分泌和多糖分子长度控制的遗传学和生物化学。已鉴定参与定优胶生物合成的基因簇，包括用于糖基转移酶的基因、编码用于合成前体分子dTDP鼠李糖的酶的基因以及用于分泌该多糖的基因(参考文献第3号)。表明含有前述簇中的一些基因的质粒例如PS8和p)(6将定优胶产量提高约10 %，并且特别地，发现一质粒(PS8)显著改良野生型菌株的定优胶流变性质(参考文献第18号)。通常用于产生定优胶和其它鞘氨糖的生长条件还促进内部储存聚合物聚羟基丁酯(“PHB”)的产生，PHB—般被认为是不期望的副产物，并难以在鞘氨糖制备中移除。PHB 可以形成干扰澄清度和过滤性的小的不溶微粒，从而限制鞘氨糖的可用性。例如，PHB微粒造成的混浊能够限制家用和个人护理产品的应用性，在这些产品中外观对于消费者接受而言是关键的。此外，某些油田用途需要过滤性；然而，PHB微粒可以塞住油田岩石形成物中的小孔，从而阻止在处理井之后鞘氨糖溶液的流动和/或粗油的回流。最后，由于PHB合成和鞘氨糖合成竞争可用碳源，因而PHB合成可对鞘氨糖产量产生一些不利影响。因此，已尝试在产鞘氨糖菌株中清除PHB的产生。参考文献第沈号描述了化学诱变后分离的多沼鞘氨醇单胞菌(产结冷胶的物种)菌株。称作LPG-2的该菌株已降低PHB 的产生，但产生质量和产量不一致的结冷胶。清除PHB的产生的更为靶向的方法由对PHB合成所需基因phaC基因的缺失来承担(参考文献第20号)。从产定优胶菌株(ATCC 53159)中精确缺失phaC可再现地导致低下生长和严重减少的定优胶产率(菌株NPD3和NPD6)。这些菌株展现增加的碳水化合物水解和有机酸积累，从而提示PhaC在维持正常细胞代谢中的关键作用。随后分离具有较少受损定优胶产率的衍生物。两种独立的衍生物PDD3和PDD6具有未表征的一个或多个自发突变并仍为PHB缺陷型(分别地，ATCC保藏号PTA-4865和PTA-4866)。虽然已报道恢复多达 90%的总定优胶产量(参考文献第20号)，但是仅在大大增加的培养物生长时间后获得该产量，并且该产量尚不是持续可再生的。在标准生长条件下，这些菌株的定优胶产率和产量仅为野生型水平的大约一半。概述有鉴于前，需要克服作为PHB缺陷型菌株特征的低鞘氨糖产率。本公开内容通过提供遗传修饰的鞘氨醇单胞菌菌株，来解决本领域中的这一需要，所述遗传修饰的鞘氨醇单胞菌菌株不仅缺少PHB的产生而且提供惊人高的定优胶产率。预料不到的是，现已表明， 质粒pS8和p)(6 (它们在产PHB菌株中仅带来中等的定优胶产率改良)大大改良PHB缺陷型菌株中的定优胶产率。定优胶产率的大大改良是特别令人惊讶的，这是因为所述质粒包含参与定优胶生物合成的基因，并且未知包含会补偿PHB缺陷型菌株代谢缺陷的任何基因。 在下文中描述的这些遗传修饰菌株的某些实施方式完全克服PHB缺陷型菌株的低下产量和低产率，而同时实现PHB缺陷型鞘氨糖的所期望过滤性和澄清度。某些实施方式包括具有遗传修饰的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，所述遗传修饰减少或优选地基本上或完全清除PHB的产生。在示例性实施方式中，所述遗传修饰使phaA基因、phaB基因、phaC基因或其任意组合失活。在另一示例性实施方式中，通过筛选或选择 PHB缺陷型生物体来获得损害PHB合成的遗传修饰。损害PHB合成的遗传修饰能够减少或完全清除PHB的产生，并可任选地是条件性的，诸如参与PHB合成的基因、抑制PHB合成的基因或其任意组合的条件性诱导、抑制、过表达、敲除等。任选地，具有减少或优选地基本上或完全清除PHB的产生的遗传修饰的鞘氨醇单胞菌属突变菌株还包含至少一种另外的抑制此类菌株的低下生长和/或低下定优胶产率的遗传修饰。在示例性实施方式中，所述另外的遗传修饰可以包括菌株PDD3、PDD6或两者所含抑制子突变中的至少一种或此类一种或多种抑制子突变的变体。某些实施方式包括提高诸如鞘氨醇单胞菌属生物体的宿主生物体中鞘氨糖产生的方法。提高鞘氨糖产生的示例性方法包括提高宿主生物体中参与鞘氨糖合成的至少一种基因的表达。此类基因能够参与鞘氨糖合成、分泌、多聚化、前体合成、多糖分子长度控制等。例如，可以在染色体外元件(诸如质粒)上导入参与鞘氨糖产生的至少一种基因的额外拷贝，或者可以将其整合进宿主基因组，或可以进行两者。此类基因可以衍生自宿主菌株或可以是衍生自另外物种或菌株的同源物。同源物可以包括参与鞘氨糖产生的基因或具有与参与鞘氨糖合成的基因相同或相似酶活性的基因的功能性、结构性或序列同源物。在示例性实施方式中，所述基因可以通过筛选或选择具有提高的鞘氨糖产生的鞘氨醇单胞菌菌株而获得。提高鞘氨糖产生的示例性方法还包括导入参与鞘氨糖的产生的具有修饰(非天然)的序列、诸如修饰的启动子或增强子元件、表达优化序列等的基因。另外，参与鞘氨糖合成的至少一种基因的天然染色体拷贝可以任选地被缺失或被前述中的任一所替换。在某些实施方式中，可以将含有质粒pS8和/或p)(6中插入物所含的至少一种基
6因、诸如全部基因或其同源物的染色体外的或整合的序列元件导入鞘氨醇单胞菌菌株。例如，所述至少一种基因可以包括 dpsS、dpsG、dpsR、dpsQ、dpsI、dpsK、dpsL、dpsJ、dpsF、dpsD、 dpsC、dpsE、dpsM、dpsN、atrD、atrB、dpsB、rmlA、rmlC、rmlB、rmlD、orf7> orf6> orf5 或其任意组合。在某些示例性实施方式中，所述的一种或多种基因包括至少一种编码鞘氨糖生物合成酶诸如dpsG聚合酶的基因。在另一示例性实施方式中，编码鞘氨糖生物合成酶的此类基因可以包括dpsG聚合酶和葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶基因；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-表异构酶基因；dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶基因；和dTDP_6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶基因。在另一示例性实施方式中，编码鞘氨糖生物合成酶的此类基因可以包括dpsG聚合酶和鼠李糖基转移酶IV基因；β-1，4-葡糖醛酸基转移酶II基因；葡糖基异戊二烯基磷酸转移酶 I(glucosyl-isoprenylphosphate transferase I)基因；和葡糖基转移酶 III 基因。在另一示例性实施方式中，编码鞘氨糖生物合成酶的此类基因可以包括dpsG聚合酶和多糖输出基因dpsD、dpsC和dpsE中的一种或多种。在另一示例性实施方式中，编码鞘氨糖生物合成酶的此类基因可以包括鼠李糖基转移酶IV基因；β -1,4-葡糖醛酸基转移酶II 基因；葡糖基异戊二烯基磷酸转移酶ι基因；葡糖基转移酶πι基因；葡萄糖-ι-磷酸胸苷基转移酶基因；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-表异构酶基因；dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶基因；和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶基因。在另一示例性实施方式中，此类鞘氨糖生物合成酶可以选自由以下组成的组编码聚合酶、裂解酶、鼠李糖基转移酶IV、β-1， 4-葡糖醛酸基转移酶II、葡糖基转移酶III、多糖输出蛋白、分泌蛋白、葡糖基异戊二烯基磷酸转移酶I、葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶、dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-表异构酶、 dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶、dTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶的基因和其任意组合。在某些实施方式中，前述基因或其同源物的任意组合可以被导入鞘氨醇单胞菌菌株。在一示例性实施方式中，所述鞘氨醇单胞菌菌株是产定优胶菌株，诸如ATCC 53159，或其PHB缺陷型衍生物，诸如PhaC缺失菌株，如NPD3、NPD6、PDD3或PDD6。在另一示例性实施方式中，鞘氨醇单胞菌菌株衍生自多沼鞘氨醇单胞菌ATCC 31461、鞘氨醇单胞菌ATCC 31555、鞘氨醇单胞菌ATCC 31961、鞘氨醇单胞菌ATCC53159、鞘氨醇单胞菌ATCC 31554、鞘氨醇单胞菌ATCC 31853、鞘氨醇单胞菌ATCC 21423、鞘氨醇单胞菌ATCC 53272、鞘氨醇单胞菌FERM-BP2015， 或PHB缺陷型衍生物，诸如前述中任一的phaC缺失菌株、或携带改良生长或鞘氨糖产率的一个或多个其它突变的PhaC缺失菌株。在示例性实施方式中，PhaC缺失菌株衍生自产结冷胶菌株，诸如LPG-2 (参考文献第沈号)、NPG-I、NPG-2、NPG-3、PDG-1、PDG-3 (参考文献第20号)或其衍生物。 在示例性实施方式中，参与鞘氨糖合成的基因可以衍生自质粒pS8或p)(6所含基因的同源物。此类同源物可以是鞘氨醇单胞菌同源物，即衍生自鞘氨醇单胞菌属的生物体的同源物。可以衍生出鞘氨醇单胞菌同源物的示例性生物体包括多沼鞘氨醇单胞菌ATCC 31461、鞘氨醇单胞菌ATCC31555、鞘氨醇单胞菌ATCC 31961、鞘氨醇单胞菌ATCC 53159、鞘氨醇单胞菌ATCC 31554、鞘氨醇单胞菌ATCC 31853、鞘氨醇单胞菌ATCC21423、鞘氨醇单胞菌ATCC 53272、鞘氨醇单胞菌FERM-BP2015，或其任意组合。在另一示例性实施方式中，参与鞘氨糖合成的基因可以编码与 SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13、15、17、19、2U3、25、27、29、 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51或53的多肽序列具有至少约70%序列同一性、诸如约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约
797%、约98%、约99%或约100%序列同一性的多肽。在另一示例性实施方式中，参与鞘氨糖合成的基因可以由与 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24J6、28、30、32、 34、36、38、40、42、44、46、48、50或52的多核苷酸序列具有至少约60%序列同一性，诸如约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95 %、约96 %、约97 %、约98 %、约99 %或约100 %序列同一性的多核苷酸编码。本发明组合物的某些实施方式包括展现在大量不同粘度测量结果上的改良(相对于产自野生型菌株的定优胶)的定优胶，特别是PHB缺陷型定优胶。在这些测量结果中， 有i)大于约150、优选高于约155、更优选高于约160dL/g的特性粘度；ii)大于约35、诸如大于约37、诸如大于约40、诸如大于约42、诸如大于约45、诸如大于约47、诸如大于约50标度盘读数的海水3rpm粘度；iii)大于约35，000、诸如大于约39，000、诸如大于约40，000、 诸如大于约42，000、诸如大于约45，000、诸如大于约48，000、诸如大于约50，000、诸如大于约54，000厘泊(cP)的海水0. 3rpm粘度；以及大于约3500、诸如大于约3700、诸如大于约 3900、诸如大于约4000、诸如大于约4200、诸如大于约4500、诸如大于约4700、诸如大于约 5000、诸如大于约5200、诸如大于约5500、诸如大于约5700、诸如大于约6000cP的PEG低剪切速率粘度。本发明菌株的某些实施方式包括能够以至少约0. 10g/L/小时、诸如至少约 0. llg/L/小时、诸如至少约0. 12g/L/小时、诸如至少约0. 13g/L/小时、诸如至少约0. 14g/ L/小时、诸如至少约0. 15g/L/小时、诸如至少约0. 2g/L/小时的速率产生PHB缺陷型定优胶和/或产生至少约12g/L、诸如至少约15g/L、诸如至少约16g/L、诸如至少约17g/L、诸如至少约18g/L、诸如至少约19g/L、诸如至少约20g/L、诸如至少约21g/L的PHB-缺陷型定优胶产量的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株。例如，某些实施方式可以包括能够以约0. 15g/L/ 小时至约0. 60g/L/小时、诸如约0. 16g/L/小时至约0. 5g/L/小时、诸如约0. 17g/L/小时至约0. 4g/L/小时、诸如约0. 18g/L/小时至约0. 35g/L/小时、诸如约0. 19g/L/小时至约 0. 3g/L/小时、诸如约0. 2g/L/小时至0. 25g/L/小时、诸如约0. 21g/L/小时至约0. 22g/L/ 小时的速率产生PHB缺陷型定优胶的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株。另外，某些实施方式可以包括能够产生约12g/L至约30g/L、诸如约13g/L至约25g/L、诸如约14g/L至约22g/L、 诸如约19g/L至约21g/L的PHB缺陷型定优胶产量的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株。本发明菌株的某些实施方式包括含有基本上或完全清除PHB的产生的遗传修饰和导致增加的鞘氨糖产生的遗传修饰的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株将PHB缺陷型定优胶的产生速率或产量相对于含有基本上或完全清除PHB 的产生的遗传修饰且缺少增加鞘氨糖产生的遗传修饰的同类系菌株(congenic strain), 提高至少约50%、诸如至少约60%、诸如至少约70%、诸如至少约80%、诸如至少约90%、 诸如至少约100%、诸如至少约110%、诸如至少约120%、诸如至少约120%、诸如至少约 130%、诸如至少约140%。例如，PHB缺陷型定优胶的产生速率或产量的增长可以为约50% 至约200%，诸如约60%至约190%、诸如约70%至约180%、诸如约80%至约170%、诸如约90%至约160%、诸如约100%至约150%、诸如约110%至约140%、诸如约120%至约 130%。在某些实施方式中，在某些鞘氨醇单胞菌菌株内，导入一个或多个拷贝的特定DNA 序列，以提供大致上无PHB的高粘度定优胶多糖的增加的生物合成产生。含有用于增加产生的此类基因的工程化细菌产生与非工程化细菌相比显著更大量的PHB缺陷型定优胶多糖，并产生具有前述所得高粘度性质的定优胶。可以将DNA(经质粒、其它已知方式)以多拷贝或经由适当方法、例如偶联更强的启动子以增加的基因表达递送进鞘氨醇单胞菌属细菌。在将该DNA插入靶细菌后，可以通过发酵所述工程化细菌并根据所产的量和所产的质对收获进行比较，来确定定优胶的产生。可以通过与其它产定优胶菌株的比较来确定增加的产量和粘度两者。诸如本文所述的遗传修饰菌株的鞘氨醇单胞菌菌株可以用来通过发酵产生鞘氨糖，诸如定优胶。一般地，发酵用的适当培养基是含有碳源(例如，包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、 麦芽糖或麦芽糊精的碳水化合物)、氮源(例如，无机铵、无机硝酸盐、尿素、有机氨基酸或含蛋白物质(诸如水解酵母、大豆粉或干酪素)、蒸馏可溶物(distiller’ s solubles)或玉米浆)以及无机盐的水性培养基。广泛种类的发酵培养基将支持根据本发明的定优胶的产生。本领域普通技术人员可以容易地确定合适的培养基制品。碳水化合物可以以变化的量(通常是发酵培养基的约I-IOwt % (优选2-8wt% )) 包含在发酵肉汤中。可以在发酵前或可选择地在发酵期间加入所述碳水化合物。氮的量可以例如为水性培养基的约0. 01wt%至约0. 的范围。可以使用单一碳源或氮源以及氮源或碳源的混合物。在可用于发酵鞘氨醇单胞菌细菌的无机盐中，有包括钠离子、钾离子、 铵离子、硝酸根离子、钙离子、磷酸根离子、硫酸根离子、氯离子、碳酸根离子和相似离子的盐。诸如镁、锰、钴、铁、锌、铜、钼、碘化物和硼酸盐的痕量金属也可以有利地被包含在肉汤中。在本发明方法的某些实施方式中，鞘氨醇单胞菌菌株经历发酵。可以例如在约 25°C至40°C、优选约27°C至35°C的温度下进行发酵。可以通过包括摇瓶培养和小规模深层搅拌发酵在内的体积放大标准方法来制备接种物。用于制备接种物的培养基可以与生产培养基相同或者可以是数种本领域公知标准培养基中的任一种，诸如路尼亚肉汤(Luria broth)或YM培养基。可以使用多于一个的种子期(seed stage)，以获得用于接种的所期望量。通常的接种量在约0.5%至约10%的总最终发酵量的范围。本发明方法的某些实施方式包括发酵培养基的搅拌。在一些实施方式中，搅拌器被包括在发酵容器内，该搅拌容器的内容物借其混合。容器还可以具有自动PH和发泡控制。可以将生产培养基加入容器中，并例如通过加热对其就地灭菌。可选择地，可以在加入前单独对培养基灭菌。可以将先前生长的种子培养物加入冷却的培养基中(通常在约27°C 至约35°C的优选发酵温度下)，并且可以将搅拌的培养物发酵约48小时至约110小时，从而产生高粘度肉汤。可以通过例如用醇、一般用异丙醇沉淀的标准方法，从肉汤中回收诸如定优胶的鞘氨糖。附图简述
图1显示携带质粒p)(6和pS8的PHB缺陷型菌株相对于无该质粒的PHB缺陷型菌株的大大改良的定优胶产率。图2显示携带质粒p)(6和pS8的PHB缺陷型菌株相对于无该质粒的PHB缺陷型菌株的大大改良的定优胶产量。图3A至图;3B示出两种独立的含PHB定优胶制备物(海水中0. 04% S657/pS8定优胶)的低下的过滤性。
图4A至图4C示出三种独立的PHB缺陷型定优胶制备物(海水中0. 04% PDD3/pS8 定优胶)的改良的过滤性。图5代表显示质粒pS8和p)(6所含插入物的图。图6示出质粒pS8所含插入物序列(SEQ ID NO :1)。图7示出质粒p)(6所含插入物序列(SEQ ID NO 54)。详述之前开发了衍生自鞘氨醇单胞菌ATCC 53159 (S657)的两种PHB缺陷型细菌菌株， 并将其命名为PDD3和PDD6 (见参考文献第20号)。这些菌株展现大约一半的野生型菌株 (S657)的定优胶产率。质粒pS8在多拷贝质粒中包含参与定优胶生物合成的数种基因，并且已被用以增强定优胶产率和流变学(参考文献第18号)。另见参考文献第21-23号，所述参考文献描述了质粒介导的基因扩增在提高多糖产量中的用途(用于增加多糖产生的 DNA片段和方法)。如下文更为详细地示出，本申请人现已表明，将质粒p)(6和pS8 —其包含参与定优胶生物合成的多种基因，但未知含有会补偿PHB缺陷型菌株的代谢缺陷的任何基因一导入 PHB缺陷型突变体PDD3和PDD6，相对于无导入质粒的PHB缺陷型菌株，导致预料不到的显著改良的PDD菌株产率(g/L/小时)和干重产量(g/L) (70%至> 100%增长)。PHB缺陷型菌株产生更少的细胞并且不产生PHB，因而，其干重产量中的更多为定优胶多糖。由于这些菌株提高的产率，这些菌株相比缺少所述遗传修饰的菌株，可以用于更为经济地产生PHB 缺陷型定优胶。此外，产自此类菌株的澄清的定优胶由于相对于含PHB定优胶来说不存在 PHB微粒，故展现改良的过滤性和澄清度。此类PHB缺陷型定优胶在多种应用中可以是特别期望的，包括家用和个人护理产品、水泥基系统，用于增强的油回收、压裂、洗井(well bore clean-up)和其它“油层(pay zone) ”应用，或涉及微粒悬浮、摩擦减小、乳剂和泡沫稳定化、 滤饼沉淀和过滤控制、或水性溶液流变学的改变(诸如增稠液体、悬浮固体、稳定乳剂或形成凝胶和膜等)的任何其它应用。另外，一旦酸水解，PHB缺陷型定优胶与含PHB定优胶相比，几乎无残留。这种低的酸水解残留使PHB缺陷型定优胶特别适于诸如压裂的油田应用， 其中稠化流体在压裂形成物后被降解，因而油的回流被最大化。与含PHB定优胶不同(含 PHB定优胶含有会塞住岩石形成物的孔的PHB微粒)，PHB缺陷型定优胶不会塞住形成物的孔，从而产生改良的油产量。在本发明菌株的一示例性实施方式中，含有相关DNA序列的质粒被插入受体鞘氨醇单胞菌细菌，并在受体细胞中复制，从而通常产生一个或数个(至少两个并通常4-10个) 拷贝的DNA片段，相对于缺少该DNA序列的菌株，其导致增加的高粘度定优胶多糖的产生。 可选择地或除了插入质粒携带的DNA序列外，还可以使用整合进细菌染色体的DNA序列。 利用接合或迁移将DNA转移进受体细菌一般是有效的。还可以利用用纯化DNA对感受态细胞的电穿孔或化学转化。可以使用其它载体或噬菌体将DNA转移进宿主细胞。无须维持 DNA片段在受体产定优胶鞘氨醇单胞菌中的质粒(或其它公知递送载体)上。常规的是， 将DNA片段的额外拷贝导入细菌染色体，以致借助复制细菌DNA的相同机制每一代复制所述片段。作为增加DNA序列拷贝数的方法的替代或与其联合，可以通过使用更强的启动子元件来实现提高的基因表达。如下术语将与本发明相关地贯穿本申请文件使用，并且具有所示含义
术语“鞘氨醇单胞菌”贯穿本申请文件用于指来自鞘氨醇单胞菌属的革兰氏阴性细菌的菌株。术语“插入的”贯穿本申请文件用于描述将DNA转移进鞘氨醇单胞菌菌株的过程和结果。此类分离的DNA可以借助本领域公知技术首先被导入(作为一种非限制的可能性)所期望质粒(诸如PLAFR3)，并随后例如通过接合或迁移而被转移进受体鞘氨醇单胞菌细菌。术语“基因扩增”用于指例如通过将靶基因克隆在多拷贝质粒(诸如4-10个拷贝) 上或通过将多拷贝(诸如4-10个拷贝)的靶基因插入细菌基因组而增加基因的拷贝，或可选择地指借助增加基因表达的对启动子元件的修饰而增加基因表达。所述两种方法和其它方法可以导致增加量的所编码蛋白。术语“生物合成”贯穿本申请文件用以描述借助鞘氨醇单胞菌细菌的鞘氨糖的生物产生或合成。本发明中DNA的克隆依靠已变为本领域标准的一般的技术和方法。要注意的是， 可以使用任意数量的方法克隆根据本发明的DNA片段，并且本发明不限于例如质粒克隆载体的使用。例如，可以通过插入噬菌体载体而克隆DNA片段。在本方法的某些实施方式中， 将所克隆DNA序列经质粒或其它递送载体导入鞘氨醇单胞菌菌株。术语“异位启动子”用来指非天然启动子，即相对于天然启动子具有某种或某些序列差异的启动子。此类启动子可以是例如相对于天然启动子驱动可测量地增加转录水平的强启动子。异位启动子还可以是受调节启动子，借助受调节启动子，基因表达应答某种因素而提高或降低，所述因素诸如小分子、温度、基因产物的存在等。用于特定用途的适当的启动子为本领域公知。术语“遗传修饰”贯穿本申请文件用来指遗传变化。一般地，遗传修饰的生物体诸如鞘氨醇单胞菌菌株参照不含有该遗传修饰的“亲本”菌株而描述。示例性的遗传修饰包括提高、降低或废止基因表达的那些遗传修饰。此类变化包括染色体和染色体外遗传物质的修饰。示例性遗传修饰包括质粒的导入、染色体序列的缺失或替换。例如，可以通过部分或全部的编码序列和/或调节元件的靶向缺失(例如，如参考文献第20号中所述)或任选地包括诱变(例如，如参考文献第沈号中所述)的遗传筛选，来使染色体基因失活。染色体遗传修饰还可以涉及靶向替换，来例如用可诱导启动子、受调节启动子、强启动子等替换天然基因启动子。染色体基因修饰还可以涉及基因扩增，即导入至少一种基因的至少一个额外的拷贝。可以例如在质粒上导入染色体外遗传物质，所述质粒可以是单拷贝、多拷贝或高拷贝的，这为本领域所公知。遗传修饰可以与选择性标记、诸如抗生素抗性基因偶联，这帮助确保保留该遗传修饰。术语“大致上无PHB”贯穿本申请文件用来指当与野生型或含PHB菌株制备的相似组合物比较时，具有大大降低的PHB含量的组合物，诸如鞘氨糖(例如定优胶)。大大降低可以是PHB含量至少90 %降低、95 %降低、99 %降低、99. 5 %降低等(其中PHB含量示作鞘氨糖组合物干重的分数)。用于测量PHB含量的适当测定法包括15% HCl溶解性和残留检测、HPLC、气相色谱和偶联质谱术的气相色谱(GC-MQ。在本发明组合物的某些实施方式中， 大致上无PHB的澄清的(例如，纤维素酶澄清的)定优胶制备物可以在15% HCl溶解性和残留测试中产生少于大约1%、诸如少于大约0. 5%、诸如少于大约0. 的残留。
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术语“PHB缺陷型定优胶”贯穿本申请文件用来指产自PHB缺陷型菌株的定优胶， 所述PHB缺陷型菌株诸如携带使phaA基因、phaB基因、phaC基因或其任意组合失活的遗传修饰的菌株。术语“phaC基因”贯穿本申请文件用来指鞘氨醇单胞菌菌株的PhaC基因。phaC 基因序列的实例在(参考文献第20号)中提供；然而，除了上下文另外指出的情况以外，还包括其它PhaC基因直系同源物。量、浓度或其它值或参数以列出的上方优选值和下方优选值给出时，应将其理解为具体公开了从上方优选值和下方优选值的任意对形成的所有范围，无论范围是否被单独公开。如本文所用，术语“一(a)”或“一(an)”表示“一种/个”或“一种/个或多种/ 个”。如本文所用，术语“约”或“大约”表示在如本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，“约” 可以表示经本领域实践在1或大于1的标准偏差内。当本申请和权利要求书描述特定值时， 除非另有说明，术语“约”表示在该特定值的可接受误差范围内。除非另有说明，本说明书和权利要求书中所用的表示成分的数量、诸如分子量的性质、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”调整。因此，除非有相反说明，否则在如下说明书和随附权利要求书中阐明的数字参数是可依本发明设法获得的期望性质而变化的近似值。最低限度的是，且不试图限制等同原则对权利要求范围的应用，每一数字参数应至少根据所报道有效数字的数并通过应用普通舍入技术而解释。除另有说明之处，所有测量和操作步骤在标准温度和压力、即大约20°C和大约1 个大气压下进行。除另有说明之处，如以下实施例2(第W065]-W066]段(说明书17页第5行至说明书18页第4行))所述，测量“海水3rpm粘度”、“海水0. 3rpm粘度”和“在聚乙二醇存在下的低剪切速率粘度”。现在将就如下具体非限制实施例更为详细地描述本发明。 实施例实施例1定优胶的产生本实施例描述提高产量的产自数种遗传修饰鞘氨醇单胞菌菌株的PHB缺陷型定优胶。JjM借助如前所述(参考文献第3号)和为本领域公知的三亲本接合交配，将质粒pS8 和p)(6转移进PHB缺陷型鞘氨醇单胞菌菌株PDD3和PDD6。菌株PDD3、PDD6、S657和S657/ pS8 如前所述(参考文献第 17、18 和 20 号)。使菌株 PDD3/pS8、PDD6/pS8、PDD3/p)(6、PDD6/ pX6、PDD3、PDD6、S657和S657/pS8在20L Applikon发酵罐中以15L体积在搅拌和通风下生长。对于含质粒菌株，在整个发酵过程中加入5mg/L抗生素四环素，以确保该质粒的保留。视需要，加入KOH以控制pH。利用-6%接种物转移，使用两个种子期。发酵培养基包含作为碳水化合物源的玉米糖浆、可同化氮源和盐。
在发酵结束时，通过导入葡糖淀粉酶来处理每一肉汤，以水解来自该玉米糖浆的任何残存寡糖。发酵肉汤的粘度经由以转轴(8 化(116)#4在6011)111下运行的81"001^丨61(1 粘度计来测量。随后用两体积异丙醇从等份试样肉汤中沉淀所产生的定优胶。在过滤器上收集定优胶纤维，并将其干燥。对于一些菌株，制备多个复制子(r印licate)，并且以下呈现的结果是这些复制子的平均值。MM含有参与定优胶合成的基因的质粒(p)(6或pS8，参见图5)的存在相比亲本PHB缺陷型菌株PDD3和PDD6，大大改良了 PHB缺陷型菌株的定优胶产生。相对于亲本菌株，PHB 缺陷型菌株的定优胶产率被大大改良70%至142% (图1和表1B)。该提高的产率比具有导入的pS8质粒的野生型(S657)菌株的高得多，后者证明产率提高仅33%。所述四种PHB 缺陷型含质粒菌株中的三种具有比野生型(S657)菌株更高的产率，和菌株PDD3/p)(6具有基本上等于S657/pS8的产率。携带这些质粒的PHB缺陷型菌株的定优胶产量相对于亲本菌株也大大改良53%至90% (图2和表1B)。该增长比具有导入的pS8质粒的野生型(S657) 菌株的高得多，后者仅使定优胶产量提高18%。与这些结果一致，PHB缺陷型菌株也展现归因于质粒导入的最终肉汤粘度的提高， 从而表明更高的定优胶含量。PHB缺陷型含质粒菌株也具有比有或无质粒pS8的野生型菌株更低的细胞密度(由OD6tltl测量)(表1B)，从而说明来自这些菌株的未澄清产物预期含有更高比例的定优胶(由于存在更少的细菌细胞)。归因于产自PHB缺陷型含质粒菌株的定优胶的更高纯度(由于更低的细胞含量和不存在PHB)，相比野生型菌株，这些菌株中产率和产量改良的程度很可能甚至比这些测量结果指明的更高。表1A.最终培养条件
权利要求
1.鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的突变菌株，所述突变菌株包含至少一种基本上或完全清除聚羟基丁酯(PHB)的产生的遗传修饰；至少一种导致增加的鞘氨糖产生的遗传修饰，所述遗传修饰包括提高参与鞘氨糖合成的至少一种基因的表达的遗传修饰，其中所述参与鞘氨糖合成的至少一种基因选自由质粒pS8中的插入物(SEQ ID NO :1)、质粒p)(6中的插入物(SEQ ID NO :54)、菌株ATCC PTA-10102所含质粒中的插入物、菌株ATCC PTA-10103所含质粒中的插入物所含基因及其鞘氨醇单胞菌同源物组成的组；借此，所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株能够相对于含有所述至少一种基本上或完全清除PHB的产生的遗传修饰并缺少所述至少一种导致增加的鞘氨糖产生的遗传修饰的同类系菌株，产生增加的大致上无PHB的鞘氨糖产生。
2.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述鞘氨糖选自由定优胶、 S-7、结冷胶、S-88、威兰胶、鼠李胶、S-198、NW-Il和阿卡兰胶组成的组。
3.如权利要求2所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述鞘氨糖是定优胶。
4.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述参与鞘氨糖合成的至少一种基因选自由以下组成的组鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)ATCC 53159基因dpsS、 dpsG、dpsR、dpsQ、dpsl、dpsK、dpsL、dpsj、dpsF、dpsD、dpsC、dpsE、dpsM、dpsN、atrD、atrB、 dpsB、rmlA、rmlC、rmlB、rmlD、orf7、orf6、orf5 和其鞘氨醇单胞菌同源物。
5.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中参与鞘氨糖合成的至少一种基因的所述鞘氨醇单胞菌同源物衍生自选自由多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas elodea) ATCC 31461、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp. )ATCC 31555、鞘氨醇单胞菌ATCC 31961、鞘氨醇单胞菌ATCC 53159、鞘氨醇单胞菌ATCC 31554、鞘氨醇单胞菌ATCC 31853、鞘氨醇单胞菌ATCC 21423、鞘氨醇单胞菌ATCC 53272和鞘氨醇单胞菌FERM-BP2015组成的组的鞘氨醇单胞菌物种。
6.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述至少一种导致增加的鞘氨糖产生的遗传修饰选自由以下组成的组(i)参与鞘氨糖合成的至少一种基因与异位启动子的可操作连接；( )参与鞘氨糖合成的至少一种基因的每细菌染色体的拷贝数增加；和(iii)其任意组合，其中所述参与鞘氨糖合成的至少一种基因中的每一种为细菌染色体或染色体外元件所包含。
7.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述至少一种基本上或完全清除PHB的产生的遗传修饰是使选自由phaA基因、phaB基因和phaC基因或其组合组成的组的基因组成性或条件性失活或缺失的突变。
8.如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述至少一种基本上或完全清除PHB的产生的遗传修饰是使phaC基因失活的插入或缺失。
9.如权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株能够以至少约0. 15g/L/小时的速率产生定优胶或产生至少约12g/L的定优胶产量。
10.如权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株能够以至少约0. 2g/L/小时的速率产生定优胶或产生至少约15g/L的定优胶产量。
11.如权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株将定优胶的产生速率或产量相对于含有所述至少一种基本上或完全清除PHB的产生的遗传修饰并缺少所述至少一种导致增加的鞘氨糖产生的遗传修饰的同类系菌株，提高至少约50%。
12.如权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中产自所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株的澄清定优胶在15% HCl溶解性和残留测试中产生少于0. 5%的残留或当使用气相色谱测量时产生少于0. Iwt %的PHB。
13.如权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中产自所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株并再水合为1升的在海水中的0. 04%定优胶的澄清定优胶能够在大约20psi的流动压力下，在少于5分钟内通过核孔(Nucl印ore)过滤器；其中所述核孔过滤器直径大约47mm并具有大约3微米的孔径大小。
14.如权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，其中产自所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株的定优胶大致上无PHB，并且其中所述定优胶展现至少约40标度盘读数的海水 3rpm粘度、至少约37，OOOcp的海水0. 3rpm粘度或至少约3，500cp的在聚乙二醇分散剂存在下的低剪切速率粘度。
15.如权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属的突变菌株，所述突变菌株是选自由菌株 PDD3/pS8、PDD3/p)(6、PDD6/pS8 和 PDD6/p)(6 组成的组的鞘氨醇单胞菌 ATCC 53159 的菌株。
16.包含定优胶的组合物，其中所述组合物大致上无聚羟基丁酯(PHB)，并且其中所述定优胶展现至少约32标度盘读数的海水3rpm粘度、至少约24，OOOcp的海水0. 3rpm粘度或至少约3，OOOcp的在聚乙二醇分散剂存在下的低剪切速率粘度。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述定优胶展现至少约40标度盘读数的海水 3rpm粘度、至少约37，OOOcp的海水0. 3rpm粘度或至少约3，500cp的在聚乙二醇分散剂存在下的低剪切速率粘度。
18.如权利要求16所述的组合物，其中所述定优胶展现至少约45标度盘读数的海水 3rpm粘度、至少约40，OOOcp的海水0. 3rpm粘度或至少约5，500cp的在聚乙二醇分散剂存在下的低剪切速率粘度。
19.制备大致上无聚羟基丁酯(PHB)的鞘氨糖的方法，所述方法包括在促进鞘氨糖产生的条件下使鞘氨醇单胞菌属的突变菌株生长；和任选地，将所述鞘氨糖从所得培养物中分离，其中所述鞘氨醇单胞菌属的突变菌株包含至少一种导致增加的鞘氨糖产生的遗传修饰；和至少一种基本上或完全清除PHB的产生的遗传修饰。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述鞘氨糖是定优胶。
全文摘要
提供了具有改良的鞘氨糖(sphingan)产量的PHB缺陷型鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)菌株。鞘氨醇单胞菌菌株中的某些是因影响PHB和鞘氨糖合成的某些遗传修饰的组合而展现产率和产量巨大改良的产定优胶菌株。此外，产自此类菌株的鞘氨糖具有极佳的特征，包括改良的过滤性、澄清度和改良的流变学改性特征。所提供的鞘氨糖因而在多种商业和工业用途中是高度期望的，所述商业和工业用途包括个人护理物品、水泥应用和油田应用。
文档编号C12P1/04GK102471754SQ201080030594
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月30日 优先权日2009年7月31日
发明者Y·N·帕特尔, 南茜·E·哈丁, 托德·塔拉舍克 申请人:Cp凯尔科美国公司