核酸扩增方法

专利名称：核酸扩增方法
核酸扩增方法本发明一般性地涉及扩增目的核酸区域的方法，更特别地，本发明涉及通过巢式单管PCR(nested single tube PCR)来扩增目的核酸区域的方法。设计本发明方法以提供下述手段，即选择性失活外引物的功能并在整个反应过程中保持扩增效率。在单管巢式PCR 的背景下开发实现用外引物有效扩增而后用内引物有效扩增的手段可用于一些应用，其包括但不限于诊断和/或监测特征为特定基因序列的疾病状况，以及表征或分析特定目的基因区域。本发明方法不仅用于简单的检测，还能进行定量。
背景技术：
本说明书对任何现有出版物(或源自其的信息)或任何已知事实的引用不是并且不应被认为是承认或认可或以任何形式暗示现有出版物(或源自其的信息)或已知事实构成本说明书相关领域的公知常识。本说明书中作者所引用的出版物详细目录在本说明书结尾处按字母顺序汇总。聚合酶链式反应(PCR)是用于扩增DNA链的特定区域的技术。DNA链可以是单个基因、基因的仅仅一部分或非编码序列。大部分PCR方法通常扩增多达IOk碱基对(kilo base pair，kb)的DNA片段，但一些技术允许扩增大小达40kb的片段(Cheng等，1994， Natl Acad Sci. 91 :5695-5699)。目前实施的PCR需要几种基本组分(Sambrook禾Π Russel，2001，Molecular Cloning =A Laboratory Manual，第三版)。这些组分是· DNA模板，其包含待扩增DNA片段的区域；眷引物，其与待扩增DNA区域5，和3，端的DNA区域互补；· DNA聚合酶(例如Taq聚合酶或最适温度在70°C左右的其他热稳定DNA聚合酶)，其用于合成待扩增区域的DNA拷贝；和 三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)，DNA聚合酶利用其构建新DNA。PCR在包含通常为15-100 μ 1反应体积的小反应管(体积0. 2-0. 5ml)中进行，所述小反应管被插入热循环仪中。该仪器加热和冷却其中的反应管至反应每个步骤所需的精确温度。大部分热循环仪包含加热盖以防止在反应管帽内部上的冷凝。或者，可在反应混合物上放置一层油以防止蒸发。因此，PCR是允许较长DNA分子中的DNA序列以指数扩增的方法。该反应包括多个扩增循环，并且在每个循环中每个分子反应的模板是样品中初始DNA链或在先前循环中合成的DNA链。每个PCR循环包括以下步骤-加热变性以将DNA双链体的两条链分离-将上游和下游引物与它们的互补序列杂交-DNA聚合酶将引物延伸以产生模板序列的互补拷贝通常，选择PCR试剂和条件以使变性、杂交和延伸以接近最大效率进行，从而每个循环中期望序列的量以接近两倍的倍数增加。在PCR结束时产生大量的扩增，例如30个循环的PCR会使初始模板扩增倍数接近23° (1，000，000，000)。这种程度的扩增便于检测和分析扩增产物。
在多个扩增循环后，可以终止PCR并以多种方式分析产物，最常见地是通过凝胶电泳分析。当PCR进行至限定的终点时，扩增产物的量通常不与放入的靶DNA量密切相关， 并且这类PCR只是检测特定DNA存在与否的定性工具和/或为了提供进一步分析所用的足
量靶DNA。为了测量信使RNA(mRNA)，该方法首先使用逆转录酶将mRNA转化成互补 DNA (cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA并用琼脂糖凝胶电泳分析。类似地，逆转录而后进行终点PCR基本上是定性技术。为了提供定量能力，开发了实时PCR。该方法遵循PCR的一般模式，只是在每个循环中对所扩增的DNA定量。定量的两种常见方法是使用嵌入双链DNA的荧光染料以及使用其荧光在PCR步骤之一中发生变化的经修饰DNA寡核苷酸引物或探针。实时聚合酶链式反应经常与逆转录酶聚合酶链式反应相组合来对低丰度的信使RNA(mRNA)进行定量，使研究者对特定时间或特定细胞或组织类型中的相对基因表达进行定量。(i)使用结合双链DNA之染料的实时PCRDNA结合染料(如Sybr Green)在PCR反应中结合所有双链(ds)DNA，导致染料荧光增强。因此PCR中DNA产物的增加导致在每个循环所测量的荧光强度增加，从而允许对 DNA浓度进行定量。(ii)荧光报告序列法已经开发了使用荧光报告引物或探针的多种不同方法，它们倾向于比使用DNA结合染料更精确且更可靠。它们使用一种或多种DNA引物或探针从而仅定量与该引物或探针杂交的DNA。使用报告探针(如Taqman探针)显著提高了特异性，并且甚至可以允许在一些非特异性DNA扩增存在时进行定量。使用序列特异性引物或探针允许通过使用带有不同颜色标签的特异性序列或探针在同一反应中多重测定几种不同的扩增产物，前提是所有靶标以相似的效率扩增。对于定量，通过以对数刻度将荧光相对于循环数作图来确定反应指数期中所存在 DNA的相对浓度。测定荧光增加至高于背景或降低至低于背景(取决于确切方法)的阈值。 样品荧光跨过该阈值的循环数被称为循环阈值Ct。然后通过将测试结果与一种或多种标准品生成的结果进行比较来确定靶DNA的量。当靶DNA是基因组DNA时，则通常使用一系列标准品(通常是已知量的靶DNA的10倍稀释)。当靶DNA是cDNA时，则通常使用另一基因cDNA的一种或多种内部标准品。为提高PCR扩增特异性而设计的传统PCR的一种变化形式是巢式PCR反应。在该扩增反应中，在两个接连的反应中使用两组引物。在第一反应中，使用一对引物产生DNA 产物，该产物可能还含有从非靶标区域扩增的产物。然后将第一 PCR的产物用于起始第二反应，所述第二反应使用结合位点位于第一组引物以内的一个(半巢式)或两个不同引物 (巢式)。所有引物的特异性相结合，通常获得单个产物。巢式PCR通常这样实施在一个反应管中进行初始PCR，将扩增产物的等分试样转移到第二反应管中，然后进行第二 PCR。该方法有两个缺点。这比单个PCR更复杂，并且更重要的是，其具有第一 PCR的扩增产物对环境造成污染的风险，这可以导致后续试验过程的污染。因此，已经开发了几种方法来在一个反应管中进行接连的PCR。在一个反应管中进行两轮PCR涉及向初始反应混合物中添加两轮所用的引物。然后该方法已被用于进行两轮接连的PCR，第一轮使用外引物对，第二轮使用内部对，所述方法包括-对两轮PCR使用不同退火温度(Kemp等，Gene1990，94 :223_228，Erlich等美国专利5314809)-降低第一轮PCR的引物浓度(Erlich等美国专利5314809)-使两轮PCR的退火时间有所不同(Grosz等美国专利5340728)-改造第二轮PCR的引物结构，并在该轮中使用两种不同的退火温度(Xu Dingbang 公布 CN1858219)-对第二轮PCR使用低变性温度(Erlich等美国专利5314809)-对第一轮PCR使用经化学修饰的引物，以及使用逐渐对其进行破坏的酶(Du Breuil Lastrucci 美国专利 7273730)-对第一和第二轮PCR使用试剂的起始物理分离Wourno美国专利5556773， Ching等美国专利申请20060177844)所有这些方法的原理是在某点产生第一轮PCR引物之活性的快速或逐渐抑制，以使正在进行的扩增逐渐地依赖于第二轮PCR引物的活性。然而，所有这些方法都有缺点，缺点的性质取决于所述方法。它们的有效性各有不同，反应条件可能需要根据待扩增的目的序列来进行调整。在一些情况下，在整个第一轮PCR中，扩增可能是低效的(inefficient)， 在另一些情况下，在从第一轮到第二轮PCR过渡期间，扩增可能是低效的。因此，在实践中所述方法中的一些没有被广泛使用，而另一些仅用于检测而非定量。在导致本发明的工作中开发了单管巢式PCR法，其通过提供以下机制同时提高了特异性和效率，所述机制即一旦不再需要外引物则对其功能进行选择性失活，从而在使用外引物有效扩增后允许使用内引物有效扩增。因此这使得开发了这样的PCR方法，其足够有效地进行定量以及检测，并且提供单管巢式PCR反应的独特优势。

发明内容
在本说明书及所附权利要求通篇中，除非根据上下文需要有另外含义，应理解词语“包含”和变化形式如“包括”和“含有”表明包括所示整数或步骤或者整数或步骤的组， 但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。本文所用术语“衍生自”应理解为表明具体整数或整数的组来源于所指出的类群， 但不一定从所指出的来源直接获得。而且，除非上下文另外明确说明，否则不使用数量词时包括多个对象。除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同。本发明的一个方面涉及扩增目的核酸区域的方法，所述方法包括(i)将核酸样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和
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针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤⑴的核酸样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的核酸样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。本发明的另一方面涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。本发明的又一方面涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且所述反义寡核苷酸之一与所述引物的3’端杂交并且包含5’核酸标签序列，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点的5’端相邻的DNA区域之核苷酸序列是错配的其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。本发明的又一方面涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且一种或多种所述反义寡核苷酸包含不能进行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。本发明的又一方面涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且所述反义寡核苷酸包含 与所述引物的3’端杂交的所述反义寡核苷酸上的5’核酸标签序列，其，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点的5’端相邻的DNA区域之核苷酸序列是错配的；和
不能进行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。根据本实施方案，提供了扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm比所述第一正向引物的 Tm 低 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20°C ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm比所述第一反向引物的Tm 低 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20°C ；和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm比所述第一引物低 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 0C ；而且所述反义寡核苷酸包含 与所述引物的3’端杂交的所述反义寡核苷酸上的5’核酸标签序列，其，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点的5’端相邻的DNA区域之核苷酸序列是错配的；和 不能进行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。本发明的另一实施方案涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述目的区域的第三正向引物，其中所述第三正向引物针对位于所述第二正向引物所针对序列3’的DNA序列，并且所述第三正向引物的Tm低于所述第二正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第三反向引物，其中所述第三反向引物针对位于所述第二反向引物所针对序列5’的DNA序列，并且其中所述第三反向引物的Tm低于所述第二反向引物的Tm ；和(d)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；以及针对所述第二引物的一种或多种反义寡核苷酸，其中每种所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第二引物；其中(b)、(C)和(d)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所处退火温度使所述第一引物杂交，但不使所述第二引物以及第三引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所处退火温度使所述第二引物以及针对所述第一引物的所述反义寡核苷酸杂交，但不使所述第三引物以及针对所述第二引物的所述反义寡核苷酸杂交；(iv)在下述退火温度下扩增步骤(iii)的DNA样品，所处退火温度使所述第三引物以及针对所述第二引物的所述反义寡核苷酸杂交。


图1是两阶段巢式单管定量PCR策略的示意图。该反应包含具有高Tm的外引物、 反义寡核苷酸(其Tm足够低以防止在第一阶段的高温度下结合外引物，但足够高以使得在第二阶段的低温度下结合)和内引物(其Tm也足够低以防止在第一阶段的高温度下结合模板链，但足够高以使得在第二阶段的低温度下结合)。反义寡核苷酸可以有多种设计，在图中显示了 2种。最优选的设计包含(a)5’端小延伸，这样设计使得如果外引物与反义寡核苷酸结合并延伸，会产生对模板链的错配，和(b)3’端的小延伸，其导致错配，该错配防止反义寡核苷酸沿外引物全长延伸。在PCR的第一阶段中，退火温度足够高以使杂交仅发生在外引物和模板之间，从而发生有效的扩增。在PCR的第二阶段中，退火温度足够低以使得发生2种机制。-反义寡核苷酸与外引物杂交，外引物沿它们延伸，从而即使外引物确实随后与 PCR模板杂交也不能导致沿PCR模板的延伸。-内引物杂交并延伸以使得有效的PCR扩增继续。图2是反义寡核苷酸上的5’标签序列产生的功能效果的示意图。不同的核苷酸碱基示意性表示为A、B、C、D，互补碱基表示为a、b、c、d。如果标签序列从3’至5’方向为 abcd，则引物延伸会是5’至3’方向的AB⑶并且延伸的引物会与其模板完美匹配，进一步延伸并有效扩增。任何其他寡核苷酸标签序列会导致延伸的引物和模板链之间部分地或完全地错配，并且使引物部分地或完全地失活。产生完全错配的最简单策略是将序列ABCD用于标签序列，其与模板序列abcd(3’至5’)互补，并且也是原有引物在其模板上延伸所产生的序列(5’至3’)。图3是对IOOng至50pg DNA质量的N-RAS基因进行定量的CT值，最初15个循环PCR退火温度是72°C，剩余循环是58°C。红色显示的点是使用“外”引物的标准PCR结果。 蓝色显示的点是两阶段单管方案的结果，其中PCR包含外引物、针对外引物的反义寡核苷酸和内引物。可以发现两阶段单管方案与标准PCR结果相同，说明其具有最佳效率。在最初15个循环中，由于反义寡核苷酸和内引物均不能退火，因此扩增由外引物引导以最佳效率进行。在随后的循环中，所述反义寡核苷酸逐渐失活外引物，但内引物可以退火并以最佳效率产生扩增。绿色数据是PCR仅包含外引物和反义寡核苷酸的结果。50或更大的Ct值表示无扩增，可以发现一旦退火温度为58°C外引物就逐渐失活。蓝紫色显示的点是内引物单独存在的Ct值。Ct值被延后约15个循环表明内引物在最初的15个循环中不退火。空心和实心三角形是不包含DNA的对照管的结果。图4是两阶段单管巢式PCR系统的性能分析的示意图。研究了四个基因N-RAS、 APC、BCR和重排的IGH基因，并且使用一系列DNA质量进行扩增以产生一系列Ct值。在 72°C进行15个循环，剩余的循环为58°C，用Taqman探针确定Ct。蓝色符号表示仅使用外引物的常规PCR;红色符号表示包含外引物、反义寡核苷酸(其针对外引物)和内引物的两阶段PCR ；以及绿色符号表示包含外引物和反义寡核苷酸的PCR。两阶段系统的Ct结果与常规PCR相同，但58°C的第二阶段的扩增由内引物介导，正如内引物不存在时反义寡核苷酸的抑制作用所证明。Ct值为55表示阴性结果。本方法使得能够对全部4个基因并且使用相同的实验条件开发出有效的巢式单管PCR的结果证实了所述方法的有效性(robustness)。图5是两阶段巢式PCR系统动力学的示意图并且说明反义寡核苷酸对外引物活性的逐渐抑制作用。使用两阶段系统、仅外引物或者在反义寡核苷酸存在下的外引物进行PCR 扩增。在15、18、21、M或32循环后，终止PCR并且在第二轮PCR中测定等分试样，以测量下述扩增子的扩增即两阶段PCR中的长和短扩增子或者另外两种PCR中的长扩增子(其中不存在内引物，扩增只是由外引物介导的)。注意Ct值是逆向显示的，以表明随PCR循环增加产生的产物量增加。两阶段PCR中扩增子的总数和仅存在长引物的PCR中长扩增子的数目均呈指数增加(显示两组数据的回归线)。然而，在存在反义寡核苷酸时，在两阶段 PCR中和所存在的引物仅为长引物的PCR中长扩增子的扩增均逐渐减缓。图6是当退火温度为72°C (如两阶段巢式PCR的第一阶段的情况)时反义寡核苷酸对外引物引起的扩增缺乏抑制作用的示意图。研究了 3个基因N-RAS、APC和BCR，以及检测了针对N-RAS的Tm值稍有不同的2对反义寡核苷酸和针对APC的1对反义寡核苷酸和针对BCR的1对反义寡核苷酸的作用。在PCR中使用多种DNA质量。观察到的仅有的抑制作用是具有高Tm的针对N-RAS的寡核苷酸在33个PCR循环后产生的。图7是用Sybr Green或Taqman探针进行荧光检测的示意图。进行了研究N-RAS、 APC和BCR基因的三个实验，并将两阶段巢式PCR与仅用外引物的常规PCR比较。用多种量的DNA开始进行PCR，并且用Taqman探针或Sybr Green测量终点。使用常规PCR，用Sybr Green的Ct值比用Taqman的小，这表明在常规PCR中扩增了一些非特异性物质，并且被 Sybr Green检测到。2个终点之间的差异在2阶段巢式系统中没有观察到，这表明在该系统中没有非特异性扩增。发明详述本发明部分地基于以下结果通过使用具有独特解链温度的引物和能失活外引物
11的反义分子，可以设计保持恒定且最佳效率水平从而利于定量PCR读出(而不只是定性读出)的单管巢式PCR法。更特别地，该进展已实现了之前在单管巢式PCR背景下未获得的控制程度和有效性程度。本发明方法可用于需要分析特定目的DNA区域(如特定基因)的任何应用背景下。因此，本发明的一方面涉及扩增目的核酸区域的方法，所述方法包括(i)将核酸样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；以及其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的核酸样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的核酸样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。应理解提及核酸“目的区域”是指待扩增的任何DNA或RNA区域。它可以是基因、 基因一部分或基因间区域。对此，应理解提及“基因”是指编码蛋白质产物(全长蛋白质或蛋白质片段)的DNA分子。对于染色体DNA，基因会包含内含子和外显子区域两者。然而， 在目的DNA为cDNA时(例如如果目的DNA是载体DNA或经逆转录的mRNA时会发生的)，可以不存在内含子区域。这样的DNA仍可以包含5’或3’非翻译区。因此，应理解本文提及的“基因”涵盖编码蛋白质或蛋白质片段的任何DNA形式，其包括例如基因组DNA和cDNA。 本发明目的核酸区域还可以是未知与任何特定基因相关的基因组DNA的非编码部分(如通常所说的“垃圾"DNA区域)。它可以是由重组产生的任何基因组DNA区域，所述重组在2个基因组DNA区域之间进行或者在1个基因组DNA区域和外源DNA区域(例如病毒或引入的序列)之间进行。它可以是部分或完全合成或者重组产生的核酸分子。本发明目的核酸序列还可以是之前通过任何核酸扩增法(包括聚合酶链式反应(PCR))扩增的DNA区域，即它已通过扩增方法产生。本发明“核酸”区域可以是DNA或RNA或者其衍生物或类似物。当目的区域是编码蛋白样分子的DNA序列时，它的形式可以是基因组DNA、从mRNA转录本产生的cDNA或者通过核酸扩增产生的DNA。而在所述DNA不编码蛋白质时，基因组DNA或者合成或重组产生的DNA均可以是分析对象。如技术人员所理解地，合成和重组产生的DNA两者都还可编码蛋白质的全部或部分。然而，如果本发明的方法涉及检测RNA区域，应理解首先需要将RNA 逆转录成DNA，例如使用RT-PCR。本发明的RNA可以是任何形式的RNA，如mRNA、初始RNA转录本(primary RNA transcript)、核糖体RNA、转运RNA、小RNA等。优选地，所述目的核酸区域是目的DNA区域。为此，所述DNA包括通过逆转录从RNA (其为最终的分析对象)产生的DNA以及通过核酸扩增法(如PCR)产生的DNA。因此，本发明的一个实施方案涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；以及其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。应理解所提及的“DNA”是指脱氧核糖核酸或其衍生物或类似物。对此，应理解其涵盖所有形式的DNA，包括cDNA和基因组DNA。本发明的核酸分子可以是任何来源的，包括天然的(例如源自生物样品的)、重组产生的或合成产生的。应理解所提及的“衍生物”包括来自天然、合成或重组来源的所述DNA的片段、同源物或直系同源物(ortholog)。应理解“功能性衍生物”是显示任何一种或多种DNA功能活性的衍生物。所述DNA序列的衍生物包括具有融合至其他蛋白样或非蛋白样分子之特定 DNA分子区域的片段。本文提及的“类似物”包括但不限于对核苷酸或核酸分子的修饰，如对其化学组成或整体构型的修饰。这包括，例如掺入新的或经修饰的嘌呤或嘧啶碱基，或者改变核苷酸或核酸分子与其他核苷酸或核酸分子的相互作用方式，例如在骨架形成或互补碱基对杂交的水平上。生物素化或其他形式的核苷酸或核酸分子标记是本文所定义的“功能性衍生物”的实例。优选地，所述DNA是基因或基因片段、染色体基因转位断裂点或由在先核酸扩增 (如PCR)产生的DNA。目的DNA可以是化学合成的，或者可以源自任何生物体(包括但不限于任何动物、植物、细菌或病毒)的DNA或RNA。在经典PCR中，设计引物和反应条件以使正向和反向引物的杂交和延伸处于或接近最大效率，从而每循环扩增子数大致上倍增，产生有效的指数扩增。足够浓度的引物对于达到最大效率很重要。如果在接连的反应中使用两组或更多组引物可以获得更大的DNA扩增特异性。以这种方式，可以通过用结合位点位于第一组引物的结合位点内的引物进行进一步扩增来使得非靶标区域扩增的非特异产物的影响最小化。所有引物的特异性相结合，通常产生单一产物。巢式PCR可以以一系列接连的分开反应进行，或者其可以在单个反应容器中进行。尽管单管巢式PCR反应的吸引力是明显的，但该方法仍有一些问题，如不同轮扩增之间的效率不一致，这使得在期望获得定量结果时有显著局限性。为了以接连的顺序从不同引物组有效扩增，许多现有技术的方向主要关注于这样的方法降低外引物的浓度， 和在第一阶段有高退火温度并且在第二阶段有较低的温度。然而，不同引物组之间的扩增效率显著不同，从而限制了该方法的应用。不将本发明限制于任一理论或作用方式，已确定在用外引物组扩增后，针对外引物的反义寡核苷酸的作用可以有效地使通过外正向引物进行的扩增下降。反义寡核苷酸与外引物的杂交会导致游离外引物的浓度降低，从而会导致该引物无法有效地与靶DNA模板杂交。杂交取决于多个变量。反义寡核苷酸与引物杂交的强度和程度取决于寡核苷酸的Tm， 该Tm继而取决于寡核苷酸序列和长度、任何错配或者降低或增加杂交的修饰的存在、寡核苷酸的浓度以及退火温度和时间。除反义寡核苷酸的大部分3’碱基与引物的大部分5’碱基杂交的反义寡核苷酸之外，反义寡核苷酸的杂交会导致其沿3’方向延伸。这会产生具有更高Tm的更长反义寡核苷酸，其在随后的循环中更强地杂交。认识到影响杂交的这些不同因素会帮助本领域技术人员设计单管巢式PCR，其包含一种或多种反义寡核苷酸引物，以使在PCR起始的较高温度阶段反义寡核苷酸与引物的杂交最小化或不存在，而在随后的较低温度阶段发生。本领域技术人员还应理解，在高温度阶段外引物以高功能性浓度存在，因此该阶段的PCR扩增效率是最佳的，而在较低温度阶段外引物以低得多的游离浓度存在，但内引物以不变的高浓度存在，从而扩增可以以最佳效率继续。在较低温度阶段的扩增中，一旦内引物开始产生扩增子，所有其“后代，，扩增子和随后循环中产生的扩增子将仅由内引物产生。因此在该阶段中，每循环的扩增将逐渐地从由外引物引发转化为由内引物引发。应理解所提及的“引物”和“反义寡核苷酸”是指包含核苷酸序列或其功能性衍生物或类似物的任何分子，其功能包括与目的核酸分子区域(目的DNA也称为“靶DNA”)杂交和扩增DNA序列的5’至该区域。应理解引物或反义寡核苷酸可以包含非核酸成分。例如， 引物或反义寡核苷酸还可以包含非核酸标签(如荧光或酶标签或一些其他非核酸成分)， 它们利于所述分子用作探针的用途，或者利于其检测或固定化。引物或反义寡核苷酸还可以包含另外的核酸成分。在另一实例中，引物或反义寡核苷酸可以是蛋白质核酸，其包含展示核酸侧链的肽骨架。优选地，所述寡核苷酸引物是DNA引物。 应理解所涉及的“正向引物”是指通过与靶DNA的反义链杂交而在PCR中扩增目的DNA样品中的靶DNA的引物。应理解所涉及的“反向引物”是指通过与靶DNA的有义链杂交而在PCR中扩增目的DNA样品中的靶DNA的引物。如之前详述地，巢式PCR基于使用两组或更多组正向和反向引物，它们用于逐渐地与目的DNA区域中更靠内的序列杂交。在本发明背景中，应理解所提及的“第一”正向和反向引物是指杂交目的DNA区域最外位置的引物。应理解“第二”正向和反向引物指内引物。也就是说这些第二引物设计成分别与第一正向引物下游和第一反向引物上游的序列杂交。本领域技术人员可以设计这些引物沿目的DNA区域杂交的间隔。应理解本文所涉及的 “第三”正向和反向引物组是指更靠内的引物组，其设计成分别与第二正向引物下游和第二反向引物上游的序列杂交。本发明的反义寡核苷酸设计成与特定正向引物杂交。因此，“针对(directed to)，， 是指反义寡核苷酸与本发明的引物区域杂交。因此，反义寡核苷酸可以仅与所述引物的一部分杂交，或者它可以在引物的全部长度上杂交。应理解尽管该寡核苷酸被称为“反义”寡核苷酸，该术语的使用旨在表示该寡核苷酸的核苷酸序列设计成使该寡核苷酸与本发明的引物杂交。还应理解本说明书中描述反义寡核苷酸的命名中，与所述引物3’端杂交的寡核苷酸末端被称为寡核苷酸的5’端，而另一端是寡核苷酸的3’端。不将本发明限制于任一理论或作用模式，本发明的反应可设计成使用一种或多于一种类型的反义寡核苷酸。当使用多于一种类型的反义寡核苷酸时，这些寡核苷酸可设计成与外引物的不同区域杂交。应理解所使用的反义寡核苷酸可以仅针对正向引物或仅针对反向引物。在另一备选方案中，反应可以设计成使用针对正向引物的反义寡核苷酸和针对反向引物的反义寡核苷酸两者。也不将本发明限制于任一理论或作用模式，本发明反应可设计成使用半巢式而不是巢式反应。在这种情况下，不使用第二正向或第二反向引物，并且不存在针对剩余的单个正向或单个反向引物的反义寡核苷酸。本发明反义寡核苷酸的形式可以是简单的反义寡核苷酸，或者它可以包含另外的功能或结构特征，所述特征增强反义寡核苷酸抑制正向引物所致进行中之扩增的作用，或者以其他方式使该作用更有效。这些特征可包括但不限于(i)反义寡核苷酸上的5’标签这是抑制外引物所致扩增的另外机制，并且其基于将反义寡核苷酸设计为与正向或反向引物的3’端杂交并且在寡核苷酸5’端安置寡核苷酸标签(本文中也相互替换地称为“寡核苷酸延伸”)。该寡核苷酸标签的作用在图2中显示。当引物与带有标签的反义寡核苷酸杂交时，引物沿3’方向延伸。该双链体解离后，在相同或随后的PCR循环中，延伸的引物可以与互补模板链杂交。为了沿模板有效延伸，引物延伸序列必须与和该延伸杂交的模板链序列互补，而为此所述寡核苷酸标签的序列必须与和该延伸杂交的模板链序列相同。相反，如果寡核苷酸标签的序列与和该延伸杂交的模板链序列不同，将不会发生进一步的延伸和扩增，即引物会失活。因此，在许可温度下的PCR中，发生了外引物分子随循环数增加而逐渐失活，该现象与反义寡核苷酸和外引物杂交所产生的直接抑制作用协同作用。本领域技术人员会理解标签的基本特性是作为正向和/或反向引物3’延伸的模板，从而使得延伸的引物在后续的PCR循环中不能发挥作用；这可以通过包含5’反义寡核苷酸标签来实现，该标签是正常核苷酸或经修饰的核苷酸，如异脱氧胞嘧啶或异脱氧鸟嘌呤(反应中必须存在互补核苷酸)；寡核苷酸标签序列与将和该延伸杂交的模板链序列之间的差异越大，引物失活得程度就越大；这样产生特别有效的失活，即通过使寡核苷酸标签序列与将和该延伸杂交的模板链序列完全互补来实现。(ii)抑制反义寡核苷酸的3’延伸可以设计反义寡核苷酸使得当其与引物杂交时可以阻止正在进行的3’延伸。当反义寡核苷酸分子在非引物5’端处与引物分子杂交时，它会进行3’延伸直至到达5’端。 不以任何方式限制本发明，在随后的PCR循环中，延伸的寡核苷酸分子(具有增加的Tm)会对外引物的扩增发挥更大的抑制作用，其原因是更多的杂交导致游离引物浓度降低以及更多的杂交导致由沿寡核苷酸标签的3’延伸引起的更多的失活。如果3’延伸的寡核苷酸的该增强的抑制作用太大以致导致PCR高温度阶段中对扩增的一些抑制，则该作用在一些情况下可能不利于生产。因此，可能期望阻止反义寡核苷酸的3’延伸。本领域技术人员应理解反义寡核苷酸的3’延伸可以通过3’端的多种不同修饰被阻止。这些包括但不限于-将导致标签与引物错配的标签放置在3’端；或-将不允许延伸的分子(例如双脱氧胸苷、异脱氧胞嘧啶或异脱氧鸟嘌呤)放置在 3’端；或-使3’端磷酸化。图1和图3-6显示的结果使用3个核苷酸的错配标签。本领域技术人员还应理解通过使用寡核苷酸(3’端未修饰或修饰)的混合物，可以控制反义寡核苷酸3’延伸发生的程度。(iii)掺入(i)和(ii)中所述的两种反义寡核苷酸修饰。因此，本发明的一个实施方案涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且所述反义寡核苷酸之一与所述引物的3’端杂交并且包含5’核酸标签序列，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点5’端相邻DNA区域之核苷酸序列是错配的其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。在另一实施方案中，本发明涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和
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针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且一种或多种所述反义寡核苷酸包含不能进行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。在另一实施方案中，本发明涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；而且所述反义寡核苷酸包含 与所述引物的3’端杂交的所述反义寡核苷酸上的5’核酸标签序列，其，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点的5’端相邻的DNA区域之核苷酸序列是错配的；和 不能进行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。应理解所提及的“寡核苷酸标签”是指与本发明反义寡核苷酸连接的核苷酸序列。 在一个实施方案中，所述标签长度为1-10个碱基，优选长2-5个碱基，更优选长2-3个碱基。所述标签设计成使与所述标签序列互补的核苷酸序列相对于引物3’端杂交位点的5’ DNA区域之核苷酸序列是错配的。“错配的(mismatched)”是指所述标签序列使得随后引物与反义寡核苷酸杂交并且引物沿标签延伸，只有对应于初始引物的延伸引物区段才能够与目的DNA区域杂交，而延伸的区段是不利于其与目的DNA区域杂交的序列。这样，由于引物的3’端不能与目的DNA区域杂交，则扩增期间该引物的任何进一步延伸均被抑制。 因此，当引物与反义寡核苷酸杂交时，引物沿3’方向延伸，并且当这样修饰的引物随后与其扩增子模板杂交时，产生阻止沿3’方向有效延伸的终止序列。因此，本发明方法使得最外部引物的初始扩增作为主要扩增反应在起始时有效地进行。然而，由于应该终止该扩增并进行内部第二引物对的扩增，反义寡核苷酸杂交以及第一正向引物沿反义寡核苷酸标签区域延伸的进行导致产生下述引物，即有效阻止在目的 DNA区域背景下进行任何进一步延伸的引物。伴随着退火温度条件的变化，正在进行的外引物扩增被最小化，并且内引物的扩增可以在利于有效扩增的条件下进行。应理解可以这样设计反应，使用针对正向引物或反向引物或者正向和反向引物两者的反义分子。适用于本发明的引物和反义寡核苷酸的设计和合成是本领域技术人员公知的。引物和寡核苷酸的Tm值很大程度上取决于不同PCR阶段期望的退火温度。例如，对于图1和 3-6所示的实验，由于使用了 Taqman探针并且为了使非特异性最小化，对第二阶段期望使用58°C的退火温度。根据经验，Tm值为58-66°C的内引物和Tm值为48_52°C的反义寡核苷酸会在该温度发挥满意作用，但会在高于68-70 V的温度下丧失作用。因此第一阶段的退火温度被设置为72°C。单管巢式PCR的这种设计显示是稳定的，因为其对所研究的4个基因均运作良好。如果期望第二阶段有更低的退火温度或者如果第三阶段应使用甚至更低的温度进行，则本领域技术人员能对方案进行修改。所述引物可以是达到具有特定退火温度的功能目标的任何合适长度。例如，对象外引物长4至60个核苷酸，在另一实施方案中长10至50，在又一实施方案中长15至45， 在另一实施方案中长20至40，在又一实施方案中长25至35。在又一实施方案中，引物的长度为约26、27、观、29、30、31、32、33或34个核苷酸。本发明的内引物具有较低的Tm并且通常较短，长4至50个核苷酸，在另一实施方案中长8至40个核苷酸，在又一实施方案中长12至30个核苷酸，在另一实施方案中长13至30个核苷酸，在又一实施方案中长14至 25个核苷酸，在又一实施方案中长15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸。本发明引物被设计为显示彼此不同的解链温度(Tm)，同时反义寡核苷酸显示另外的Tm。不以任何方式限制本发明，独特解链温度和反义寡核苷酸的使用相联合使得保持一个扩增阶段到下一个阶段的良好扩增效率，特别是扩增的良好效率。更特别地，最外部的引物被设计为具有最高的Tm。这使得第一阶段的扩增在高退火温度下进行，并且使非特异退火和扩增最小化。具体而言，由于反义寡核苷酸和内引物显示更低的Tm值，不利于这些分子退火和扩增。本领域技术人员能容易地确定所述第一引物、所述第二引物和所述反义寡核苷酸杂交并使其有效或无效地行使功能的退火温度范围。因此，反应条件的设计(例如确定“能使所述第一引物杂交而不使所述第二引物和所述反义寡核苷酸杂交的退火温度”)是常规方法。所述确定可以直接通过使用多种qPCR仪器(例如BioRad生产的iQ实时PCR仪器) 之一来完成，它在一系列反应孔中提供退火温度的梯度，使得可以在不同退火温度进行独立的PCR。可以直接确定Ct值以及随之确定的使得能或不能杂交的退火温度。或者，可以通过获得所述第一引物、所述第二引物和所述反义寡核苷酸的预估Tm图(通过参考用碱基堆积算法来估计Tm的多个网站中的一个,例如http://www. promega. com/biomath/calcll.htm、http://www. idtdna. com/analyzer/App Ii cat ions/01 igoAnalyzer)来间接进行所述确定。我们实验室的实验结果表明在退火温度低于大约它们相应的预估Tm值加5°C时，所述第一和第二引物有效扩增；所述第二引物在高于大约相应预估Tm值加7°C时不产生显著扩增；以及在退火温度低于大约寡核苷酸的预估Tm加10°C时，所述反义寡核苷酸显示对所述第一引物扩增的可测量抑制。本领域技术人员还应理解，步骤(ii)可以在最高温度(使得通过所述第一引物有效扩增)和最低温度(在该温度所述内引物不显示可测量的扩增， 而且所述反义寡核苷酸不显示可测量的抑制)范围内的任何退火温度下方便地进行，步骤 (iii)可以在所述第二引物有效扩增而且所述反义寡核苷酸有可测量抑制的任何退火温度下方便地进行。还应理解可以利用任何适合技术将步骤(ii)的扩增设计为不能使第二引物以及反义寡核苷酸杂交，所述技术如，由于选定退火温度比它们各自的Tm值大，或者仅是由于在步骤(ii)的扩增发生时，第二引物和反义寡核苷酸还没有加入到反应混合物中。在一个实施例中，将第一组外引物设计为显示65-75°C的Tm，而第二组内引物被设计为显示约低KTCWTm，即55_65°C。如果使用第三组内引物，其将被设计为具有更低的 Tm，如45-55°C，针对第二正向引物的反义寡核苷酸显示最低的Tm。因此，所述不同引物的解链温度可以被设计为显示5-15°C的差异，如5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11 °C和12°C的差异。在一个实施方案中，所述第一引物显示70-75°C的Tm，而所述第二引物显示58-62°C的 Tm，而且所述反义寡核苷酸显示48-52°C的Tm。根据该实施方案，提供扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm比所述第一正向引物的 Tm 低 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20°C ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm比所述第一反向引物的Tm 低 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20°C ；和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm比所述第一引物低 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 0C ；而且所述反义寡核苷酸包含 与所述引物的3’端杂交的所述反义寡核苷酸上的5’核酸标签序列，其，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点的5’端相邻的DNA区域之核苷酸序列是错配的；和 不能进行正常延伸的3’端其中(b)和(C)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。在另一实施方案中，所述第一引物显示65-75 °C的Tm，优选69_73 °C，所述第二引物显示55-65 °C的Tm，优选59-63 °C，而且所述反义寡核苷酸显示45-55 V的Tm，优选 49-52 "C。应理解本发明的引物、寡核苷酸和标签不应限于本文示例的具体结构(线性、单链分子)，而是可扩展至达成本文详细描述的功能目标的任何适合结构构型。例如，所述引物可设计成包含下述5’序列，其自身可以作为3’端引物序列的反义寡核苷酸在PCR的低温阶段形成茎环结构(具有或不具有5’标签)；在这种情况下可以不需要单独的反义寡核苷酸。其他实例可以包括-由两个或更多个杂交序列组成的引物，所述杂交序列由一个或多个非杂交区域分隔开；-由两个或更多个杂交序列组成的反义寡核苷酸，所述杂交序列由一个或多个非杂交或弱杂交区域分隔开，每个这种区域包含一个或多个非杂交或弱杂交碱基或接头；-通过连接两个或更多个较小的反义寡核苷酸在PCR过程中形成的反义寡核苷酸。在一些情况下，可期望进行三阶段巢式扩增。本领域技术人员可以使用上述实施方案中涵盖的原理和多种变化来设计这种扩增。因此，本发明的另一方面涉及扩增目的DNA区域的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的 Tm;和(c)针对所述目的区域的第三正向引物，其中所述第三正向引物针对位于所述第二正向引物所针对序列3’的DNA序列，并且所述第三正向引物的Tm低于所述第二正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第三反向引物，其中所述第三反向引物针对位于所述第二反向引物所针对序列5’的DNA序列，并且其中所述第三反向引物的Tm低于所述第二反向引物的Tm ；和(d)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第一引物；以及针对所述第二引物的一种或多种反义寡核苷酸，每种所述反义寡核苷酸的Tm低于所述第二引物；其中(b)、(C)和(d)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交，但不使所述第二引物以及第三引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和
(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述针对所述第一引物的反义寡核苷酸杂交，但不使所述第三引物以及所述针对所述第二引物的反义寡核苷酸杂交；(iv)在下述退火温度下扩增步骤(iii)的DNA样品，所述退火温度使所述第三引物以及所述针对所述第二引物的反义寡核苷酸杂交。在一个实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含(a)与所述引物的3’端杂交的所述反义寡核苷酸上的5’核酸标签序列，其，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点的5’端相邻的DNA区域之核苷酸序列是错配的；和(b)不能进行正常延伸的3’端可用于该实施方案的条件的实例为第一正向和反向引物的Tm值为70-72°C，第二正向和反向引物的Tm为58-62°C，第三正向和反向引物的Tm为42-50°C，和；针对第一正向和反向引物之一或两者的反义寡核苷酸的Tm值为48-52°C，针对第二正向和反向引物之一或两者的反义寡核苷酸Tm为30-45°C。利用相似的原理，本领域技术人员可以设计包含 4阶段的单管巢式PCR，其使用4对引物和3对反义寡核苷酸。可以通过任何合适方法来利于引物和反义寡核苷酸与靶DNA的相互作用。这些方法为本领域技术人员已知。为此，应理解可以在任何时间点将反义寡核苷酸和/或内引物掺入反应管。尽管一般在初始扩增循环开始前掺入(即与正向和反向外引物一起掺入)，可以在用外引物进行初始扩增循环之后掺入其之一或更多。在任一情况下，反义寡核苷酸仅在反应温度降低至允许第二引物对扩增后发挥全部作用。反义寡核苷酸和/或内引物的掺入模式将取决于本领域技术人员选择如何进行扩增反应，但通常地，为了便于使用和避免污染，通常期望能够在单管中进行全部反应。但是可以使用任何其他达成本发明步骤的方法。本发明方法优选以两阶段反应进行。阶段1的退火温度保证仅有第一外引物组以任何程度杂交，而反义寡核苷酸或者第二或第三引物组不杂交。但是，阶段2的退火温度选择成使第二引物组以及针对第一引物组的反义寡核苷酸杂交。每个阶段进行的适合循环数可以由本领域技术人员确定。例如，通常第一阶段可以用15-30个循环，第二阶段10-40个循环。可以逐渐降低退火温度以使两个阶段逐渐转换，而不是在PCR第二阶段开始时急速降低退火温度。实现引物引导扩增的方法也是本领域技术人员公知的。在一个优选的方法中，所述扩增是聚合酶链式反应。应理解所提及的“样品”是指生物或非生物样品。非生物样品的实例包括，例如合成产生的核酸类群的核酸产物。应理解所提及的“生物样品”是指源自动物、植物或微生物 (包括微生物培养物)的任何生物材料样品，包括但不限于细胞材料、血液、粘液、粪便、尿液、组织活检样本、引入动物机体并随后取出的流体(如洗肺后从肺提取的盐溶液或者灌肠洗液中回收的溶液)、植物材料或植物繁殖材料(如种子或花)或者微生物集落。根据本发明方法检测的生物样品可以直接被检测或者可以需要在检测前进行一些形式的处理。例如活检样品在测试前可能需要勻浆。而且，在生物样品不是液体形式的情况下，可能需要添加试剂(如缓冲液)以使样品流动。
在靶DNA存在于生物样品中的情况下，可以直接测试生物样品，或者可以在测试前分离生物样品中存在的全部或一些核酸物质。在测试前对靶核酸分子进行预处理(例如灭活活病毒或者进行凝胶电泳)在本发明的范围内。还应理解生物样品可以是新收集的， 或者其可以在测试前被储存(例如通过冷冻)或者在测试前进行了另外的处理(如通过进行培养)。应理解所提及的将样品与引物或反义寡核苷酸“相接触”是指促使引物与样品混合以发生相互作用(例如杂交)。达到该目的的方法是本领域技术人员公知的。选择何种类型的样品最适于根据本文公开方法的测试将取决于情况的性质，如所监测病症的性质。例如，在一个优选的实施方案中，肿瘤病症是分析的对象。如果肿瘤病症是白血病，则血液样品、淋巴液样品或骨髓抽取物可能提供适合的测试样品。当肿瘤病症是淋巴瘤时，淋巴结活检或者血液或骨髓样品可能提供适合的测试样品来源。还需要考虑是否监测肿瘤细胞的初始来源，或者监测是否存在肿瘤从起始位点转移或其他形式的扩散。 为此，可期望从任一哺乳动物收集并检测多个样品。选择对任何给定检测情况适合的样品在本领域普通技术人员的能力范围内。本文所用术语“哺乳动物”包括人、灵长动物、家畜(例如马、牛、羊、猪、猴)、实验室测试动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、宠物(例如狗、猫)和捕获的野生动物(如袋鼠、 鹿、狐)。优选地，哺乳动物是人或实验室测试动物。甚至更优选地，哺乳动物是人。尽管本发明方法设计成使得其作为以退火温度转变区分的两阶段扩增进行，不应将其理解为对技术人员是否要加入另外的步骤(例如提供扩增目的核酸区域的有效手段) 的限制。本发明方法可用于一些应用，包括但不限于诊断和/或监测以特定基因序列为特征的疾病病症，表征或分析目的基因区域，细菌、病毒或其他急性或潜在病原生物体的全部检测和定量，研究司法或存档DNA样品或者研究存在PCR非特异性问题的任何样品。参照以下非限制性实施例进一步描述本发明。实施例1设计两阶段巢式单管PCR的公认标准基本循环条件
权利要求
1.一种扩增目的核酸区域的方法，所述方法包括(i)将核酸样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二正向引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的 Tm;和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的Tm ；和(c)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的TJS于所述第一引物；而且其中(b)和(c)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；( )在下述退火温度下扩增步骤(i)的核酸样品，所述退火温度使所述第一引物杂交但不使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的核酸样品，所述退火温度使所述第二引物以及所述反义寡核苷酸杂交。
2.权利要求1的方法，所述方法包括(i)将DNA样品与以下项相接触(a)针对所述目的区域的第一正向引物和针对所述目的区域的第一反向引物；和(b)针对所述目的区域的第二正向引物，其中所述第二引物针对位于所述第一正向引物所针对序列3’的核酸序列，并且所述第二正向引物的Tm低于所述第一正向引物的Tm ；和针对所述目的区域的第二反向引物，其中所述第二反向引物针对位于所述第一反向引物所针对序列5’的核酸序列，并且所述第二反向引物的Tm低于所述第一反向引物的Tm ；和(c)针对所述目的区域的第三正向引物，其中所述第三正向引物针对位于所述第二正向引物所针对序列3’的DNA序列，并且所述第三正向引物的Tm低于所述第二正向引物的 Tm;和针对所述目的区域的第三反向引物，其中所述第三反向引物针对位于所述第二反向引物所针对序列5’的DNA序列，并且所述第三反向引物的Tm值低于所述第二反向引物的Tm 值；和(d)针对所述第一引物的一种或多种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的TJS于所述第一引物；以及针对所述第二引物的一种或多种反义寡核苷酸，每种所述反义寡核苷酸的 Tm低于所述第二引物；其中(b)、(c)和(d)部分的所述分子可以在所述扩增步骤(ii)之前、期间或之后但在所述扩增步骤(iii)之前加入反应；(ii)在下述退火温度下扩增步骤(i)的DNA样品，所述退火温度使所述第一引物杂交， 但不使所述第二引物以及第三引物以及所述反义寡核苷酸杂交；和(iii)在下述退火温度下扩增步骤(ii)的DNA样品，所述退火温度使所述第二引物以及针对所述第一引物的所述反义寡核苷酸杂交，但不使所述第三引物以及针对所述第二引物的所述反义寡核苷酸杂交；(iv)在下述退火温度下扩增步骤(iii)的DNA样品，所述退火温度使所述第三引物以及针对所述第二引物的所述反义寡核苷酸杂交。
3.权利要求1或2的方法，其中所述核酸是DNA。
4.权利要求1或2或3的方法，其中所述反义寡核苷酸之一与所述引物的3’端杂交并且包含5’核酸标签序列，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点的5’端相邻的DNA区域之核苷酸序列是错配的。
5.权利要求1或2或3的方法，其中一种或多种所述反义寡核苷酸包含不能进行正常延伸的3’端。
6.权利要求1或2或3的方法，其中所述反义寡核苷酸包含 所述反义寡核苷酸上与所述引物的3’端杂交的5’核酸标签序列，所述标签的互补核苷酸序列相对于所述引物杂交位点的5’端相邻的DNA区域之核苷酸序列是错配的；和 不能进行正常延伸的3’端。
7.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述寡核苷酸标签长1-10个碱基。
8.权利要求7的方法，其中所述寡核苷酸标签长2、3、4或5个碱基。
9.权利要求8的方法，其中所述寡核苷酸标签长2或3个碱基。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述第一引物长10-50个核苷酸而且所述第二引物长8-40个核苷酸。
11.权利要求10的方法，其中所述第一引物长15-45个核苷酸而且所述第二引物长 12-30个核苷酸。
12.权利要求11的方法，其中所述第一引物长20、21、22、23、24、25、26、27、28、四、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 个核苷酸。
13.权利要求11的方法，其中所述第二引物长13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29 或 30 个核苷酸。
14.权利要求11的方法，其中所述第一引物长沈、27、观、29、30、31、32、33或34个核苷酸而且所述第二引物长15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述第二引物显示比所述第一引物的1低 5°C -20°C的Tm，而且所述反义寡核苷酸显示比所述第二引物的Tm低5°C至20°C的Tm。
16.权利要求2至15中任一项的方法，其中所述第三引物显示比所述第二引物的T1JS 5-20°C 的 Tm。
17.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述第二引物显示比所述第一引物的Tm 低7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14°C或15°C的Tm，而且所述反义寡核苷酸显示比所述第一引物的 Tm 低 10°C、11°C、12°C、13°C、14°C、15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、21°C、 22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C或 30°C 的 Tm。
18.权利要求15至17中任一项的方法，其中所述第一引物显示的Tm为651_75°C，所述第二引物显示的1为55°C _65°C，而且所述反义寡核苷酸显示的1为45°C _55°C。
19.权利要求18的方法，其中所述第一引物显示的Tm*69°C-75°C，所述第二引物显示的Tm为59°C _63°C，而且所述反义寡核苷酸显示的Tm为49°C _52°C。
20.权利要求16的方法，其中所述第一引物的Tm为70°C_72°C，所述第二引物的Tm为 580C -62°C，所述第三引物的Tm为42°C _50°C，而且所述反义寡核苷酸的Tm为30°C -45°C。
全文摘要
本发明一般性地涉及扩增目的核酸区域的方法，更特别地，本发明涉及通过巢式单管PCR来扩增目的核酸区域的方法。设计本发明方法以提供下述手段，即通过靶向至少一个外引物的反义核酸分子来选择性失活所述外引物功能，从而在整个反应过程中保持扩增效率。在单管巢式PCR的背景下开发实现用外引物有效扩增而后用内引物有效扩增的手段可用于一系列应用，其包括但不限于诊断和/或监测特征为特定基因序列的疾病状况，以及表征或分析特定目的基因区域。本发明方法不仅用于简单的检测，还能进行定量。
文档编号C12P19/34GK102459626SQ201080030802
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月2日 优先权日2009年6月2日
发明者亚历山大·艾伦·莫利, 迈克尔·朱利安·布里斯科 申请人:弗林德斯大学, 莫诺夸特有限公司