体液中乳糖测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种体液中乳糖测定方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II仅有乳糖酶有效成分；其测定方法为：体液中葡萄糖先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，体液中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成NADPH，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，乳糖水解后生成L-半乳糖和葡萄糖，葡萄糖经反应产生NADPH。仪器在334～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的NADPH为空白，由试剂Ⅱ反应产生的NADPH计算出乳糖的含量。本发明检测时不受内源性葡萄糖影响，其方法经济方便易行，不需要特殊检测设备，是一种准确性更高的乳糖检测方法。
【专利说明】体液中乳糖测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生 颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测体液中乳糖的测定方法。
【背景技术】
[0002] 乳糖是二糖的一种，分子式是C12H22O11,是在哺乳动物乳汁中的双糖，因此而得名， 它的分子结构是由一分子葡萄糖和一分子半乳糖缩合形成，味微甜，摩尔质量342. 3克，有 两种端基异构体：α -乳糖和β -乳糖，在水溶液中可互相转化，α -乳糖很容易结合一分子 结晶水，甜度是蔗糖的约五分之一，乳汁中2?8%的固体成分为乳糖，幼小的哺乳动物肠 道能分泌乳糖酶分解乳糖为单糖。成年动物，包括除高加索人种外的多数人类体内乳糖酶 的活性大大降低，故饮用乳类可产生腹泻、腹胀等症状，称为乳糖不耐症，成年动物若长期 持续饮用乳品（初期以少量多次慢饮为宜），也可刺激肠道内乳糖酶的活性并增加一定数 量，虽活性和数量不如幼儿时期，但仍能有效帮助分解乳糖，乳糖在人体中存在于乳汁中， 当人体饮入乳品后，人体肠屏障破坏时可进入人体血液和尿液中。
[0003]目前国内测定乳糖有高效液相色谱-串联质谱法，高效液相色谱-蒸发光散射法， 还有酶学分析法，通过乳糖酶分解乳糖生成L-半乳糖和葡萄糖，通过检测L-半乳糖的含量 来确定乳糖的含量，如北京金域高科诊断技术有限公司生产采用尿半乳糖测定试剂盒，受 检患者排空尿液，按正常饮食习惯哺乳，收集2?3h的尿液，混匀检测，乳糖经乳糖酶作用 水解生成葡萄糖和半乳糖，半乳糖吸收入血后经尿液排出，尿液经尿液纯化装置处理除去 干扰物，尿中半乳糖经半乳糖酶氧化酶作用生成半乳糖己二醛糖和过氧化氢，后者在四氨 基安替吡啉存在下，使3, 5-二氯-2-羟基苯磺酸氧化成红色，在一定范围内呈色深度与半 乳糖浓度成正比，与试剂盒的标准品对照判读结果，样品孔颜色与标准孔一致或较标准孔 浅为乳糖不耐受即乳糖不能被水解生成葡萄糖和半乳糖，尿中无半乳糖检验结果呈阳性为 乳糖不耐受，反之乳糖耐受呈阴性。
[0004] 本发明研究一种人体体液中乳糖测定方法，人体体液中葡萄糖和试剂I中三磷 酸腺苷、NADP在己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下，在镁离子的参与下反应生成 NADPH，加入试剂II后于37°C温浴4?7分钟，乳糖水解后生成L-半乳糖和葡萄糖，葡萄糖 再循环第一步反应也生成NADPH ;仪器在334?340nm波长处检测，以试剂I反应产生的 NADPH为空白，由试剂II反应产生的NADPH计算出乳糖的含量。
[0005] 第一步反应：
[0006]
【权利要求】
1. 一种体液中乳糖测定方法，其特征在于工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II中仅 有乳糖酶有效成分；其测定方法为：体液中葡萄糖先与试剂I于37°c温浴3?5分钟，体液 中葡萄糖与试剂I的反应生成NADPH，加入试剂II后于37°C温浴4?7分钟，乳糖水解后 生成L-半乳糖和葡萄糖，葡萄糖经反应也生成NADPH ;仪器在334?340nm波长处检测，以 试剂I反应产生的NADPH为空白，由试剂II反应产生的NADPH计算出乳糖的含量，计算公式 为： 0Dft# = 0D2- ODiXt (SV+RJi )/ (SV+RJi +R2V2)] 乳糖浓度=FXOD^^ 其中(》1#是乳糖产生的吸光度，ODi是样品加入试剂I反应后测得的吸光度，0D2反应 液加入试剂II反应后测得的吸光度，SV是样品的体积，RA是试剂I的体积，R2V2是试剂II 的体积，F是校正因数。
2. 根据权利要求1所述的体液中乳糖测定方法，其特征在于试剂I中含有三磷酸腺 苷、己糖激酶、NADP、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；试剂II中仅含有乳糖酶有效成分。
3. 根据权利要求1所述的体液中乳糖测定方法，其特征在于试剂I每升三乙醇胺盐酸 缓冲液内含三乙醇胺30 mmol?70 mmol、硫酸镁1. 0 mmol?3. 0 mmol、三磷酸腺苷2. 0 mmol ?4. 0 mmol - NADP 2. 0 mmol ?4· 0 mmol、己糖激酶 6000U ?10000U、葡萄糖 _6_ 憐 酸脱氢酶10000U?20000U、Proclin-300防腐剂10〇μ1?30〇μ1 ;试剂II每升三乙醇胺盐 酸缓冲液内含三乙醇胺30 mmol?70 mmol、乳糖酶1500?2500U、Proclin-300防腐剂 10〇μ1 ?30〇μ1。
4. 根据权利要求1所述的体液中乳糖测定方法，其特征在于试剂I和试剂II中三乙醇 胺盐酸缓冲液的pH值为7. 5±0. 2。
5. 根据权利要求1所述的体液中乳糖的测定方法，其特征在于测定的体积比为：样 品：试剂I :试剂11=1 : 60?90 : 20?30。
【文档编号】G01N21/31GK104237147SQ201410504960
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】李立和, 常玉芝, 丁弘 申请人:天津市宝坻区人民医院