通过力传导增加细胞生产的制作方法

专利名称：通过力传导增加细胞生产的制作方法
通过力传导增加细胞生产相关申请的交叉引用
本申请要求2009年7月15日提交的美国临时申请序列号61/225，694的权益，该申请由此以引用方式全文并入。
背景技术：
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是在生物制药工业中用于生产重组蛋白质的最普遍使用的哺乳动物宿主细胞系。用于生产生物治疗剂的使用包括CHO细胞的哺乳动物细胞的细胞培养方法面临诸多挑战，包括压缩的产品开发时线、能力不足以及细胞系增殖和生产率的限制。本发明通过将张拉整体(tensegrity)模型施加到哺乳动物细胞例如CHO细胞来解决这些问题。通过将张拉整体力施加到这种细胞，可以调节细胞产生的重组蛋白质的水平。发明_既述
本发明涉及经由在宿主细胞和细胞培养物上施加张拉整体力来调节蛋白质生产的方法。在某些实施方案中，本发明的方法涉及增加来自细胞和/或细胞培养物的靶标蛋白质的生产。张拉整体力可以是施加到细胞的应力，并且可以包括以下一种或多种机械应力、 剪切应力、拉伸效应、以及压力诱导应力例如由声波诱导的压力。在某些实施方案中，将这种张拉整体力施加到靶标蛋白质，该靶标蛋白质的生产受到调节，并且是抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG。在某些实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在某些实施方案中，细胞在培养物中为自由漂浮的。在替代性实施方案中，细胞是能够粘着于基底的粘着细胞。在某些实施方案中，本发明涉及通过将应力施加至细胞来调节来自细胞培养物的细胞的重组蛋白质生产的方法。在某些实施方案中，重组蛋白质是抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG。在某些实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在本发明的某些实施方案中，经受应力的细胞在市售生物反应器中进行培养。本发明的一个方法涉及使表达所关注的蛋白质的细胞经受受控的机械剪切应力。 在某些实施方案中，可以用涂布有可粘着于细胞的细胞骨架的抗体的膜结合铁磁珠，将剪切应力(扭矩)施加到细胞的表面。通过施加较弱的扭转磁场，可以在一个方向上磁化这些珠。本发明的替代性方法涉及使表达所关注的蛋白质的细胞经受生物力学培养系统， 该生物力学培养系统能够使粘着细胞受到不同的双轴应力/应变培养条件。在某些实施方案中，生物力学培养系统是牵引显微术。在本发明的某些实施方案中，生物力学培养系统允许细胞的实时显微镜成像(live microscopic imaging)。在某些实施方案中，可测量经受应力的细胞的活力。这种细胞活力测定的非限制性实例包括但不限于染料摄取测定(例如钙荧光素AM测定)、XTT细胞活力测定、以及染料排斥测定(例如锥虫蓝(trypan blue)、伊红(Eosin)、或丙啶(propidium)染料排斥测定)。
在某些实施方案中，可以测定由经受应力的细胞分泌的蛋白质的量。在某些实施方案中，蛋白质是IgG，其在形成细胞微环境的培养基中释放。在某些实施方案中，可以测定经受应力的细胞的行为。这种细胞行为包括但不限于细胞迁移和形态。在某些实施方案中，可以使用显微技术例如但不限于扫描电子显微术、 相差显微术和/或透射电子显微术来评估细胞行为随时间的变化。附图简述


图1为流程图，描述研究CHO细胞中张拉整体模型的实验程序的顺序。发明详述
本发明涉及经由在细胞和细胞培养物上施加张拉整体力来调节蛋白质生产的方法。在某些实施方案中，本发明的方法增加来自细胞和细胞培养物的蛋白质的生产。张拉整体力可以是施加到细胞的应力，并且可以包括以下一种或多种机械应力、剪切应力、拉伸效应、 以及压力诱导应力例如超声诱导应力。为清楚起见而非限制，将该详述分为以下子部分
1.施加张拉整体力的方法；
2.经由施加张拉整体力来调节靶标蛋白质生产；和
3.包括张拉整体力优化的大规模生产。1.施加张拉整体力的方法
在某些实施方案中，本发明涉及通过将张拉整体力施加到细胞或细胞培养物来调节蛋白质生产的方法。在细胞张拉整体模型中，张力通过细胞骨架微丝和中间丝来承受， 并且这些力通过抗压缩的互连的结构元件平衡，最值得注意地是内部微管支柱和胞外基质(ECM)粘着。(参见例如 Ingber, D. Ε. , Tensegrity: the architectural basis of cellular mechanotransduction. Annu Rev Physiol, 1997. 59: p. 575—99; Ingber, D. Ε. , Tensegrity II. How structural networks influence cellular information processing networks. J Cell Sci, 2003. 116 (Pt 8): p. 1397-408; Ingber, D. Ε. , Tensegrity I. Cell structure and hierarchical systems biology. J Cell Sci. 2003 Apr 1; 116 (Pt 7): 1157-73;和 Wang, N. , J. D. Tytel 1，and D. Ingber, Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with nucleus. Molecular cell biology, January 2009. 10: p. 75-82)。这禾中张拉整体力可以包括向靶标细胞或细胞培养物施加应力、例如机械性施加应力的力。在某些实施方案中，接受张拉整体力，并经由活细胞中拉紧的微丝、压缩的微管和跨膜的整联蛋白受体之间的互补力平衡而将信号转导入细胞中。当力施加到整联蛋白时， 对于在物理上经受机械负荷的细胞骨架缔合分子，热力学和动力学参数可以局部地变化。 当力施加到未与细胞骨架连接的非粘着受体上时，应力在细胞表面局部地消散，并且生化响应缄默。在一个非限制性实例中，当张力施加到整联蛋白上时，新微管蛋白单体添加到微管的末端上，并且由于微管蛋白的临界浓度的变化而使微管减压。在某些实施方案中，被从整联蛋白传递到细胞骨架的应力物理性扭曲的分子可改变其动力学，例如，提高底物变成产物的其化学转变的速率常数。以此方式，细胞骨架中的细胞骨架结构(构造)和预应力 (张力)都可调节对机械应力的细胞响应。在某些实施方案中，经细胞骨架的力施加可以被转导到细胞的核孔并拉伸该孔，开启内核孔复合体的笼状体(basket)和其它组分，改变孔的开启动力学或调节其分子组成，从而提高核转运。这种效应可以影响基因表达的转录后控制。在某些实施方案中，张拉整体力可以是受控的机械剪切应力。在某些实施方案中， 剪切应力可以直接施加到细胞表面。用涂布有粘着于细胞的细胞骨架的抗体的膜结合磁珠例如铁磁珠，可将剪切应力(扭矩)施加到该表面上。通过施加扭转磁场，可以在一个方向上磁化这些珠。可以获得电子显微图像以示出铁磁珠如何连接到细胞的表面。在某些实施方案中，将剪切应力以有效增加来自细胞的蛋白质生产水平的量施加到细胞上。在某些实施方案中，铁磁珠的直径是约0. 25到0. 5 μ m，约0. 5到0. 75 μ m,约0. 75 至Ij 1 μ m，约 1 至Ij 2 μ m,约 2 至Ij 3 μ m,约 3 至Ij 4 μ m,约 4 至Ij 5 μ m,约 5 至Ij 6 μ m,约 6 至Ij 7 μ m,约 7至IJ 8 μ m，约8到9 μ m，或约9到10 μ m。在某些实施方案中，铁磁珠的直径是约1到6 μ m。在某些实施方案中，细胞为CHO细胞，并且铁磁珠涂布有抗CHO抗体。可以用磁扭转细胞计量术(magnetic twisting cytometry，MTC)确定引起对应力施加的响应的细胞变形，MTC是用于通过首先磁化并然后旋转与细胞的表面结合的铁磁珠来对活细胞施加机械应力的技术。在某些实施方案中，MTC装置可以由七个主要元件组成 (i)提供电流以磁化所述珠的高压发电机；(ii)用于扭转所述珠的一个[用于一维(ID) MTC]双极电源；(iii)用于控制扭转设备的计算机；(iv)用于观察样品的倒置显微镜；(ν) 电荷耦合装置(CCD)相机，其使用能够使图像俘获与阶跃函数或振荡波磁场同步的软件； (vi)维持培养细胞的正确温度的装置；和(vii)显微镜插入件，其保持样品并且含有用于 ID MTC的两对线圈，所述线圈产生用于磁化和扭转所述珠的交变电场。在某些实施方案中，可以通过能够使细胞受到不同双轴应力/应变的生物力学培养系统来产生张拉整体力。在一个非限制性实例中，生物力学培养系统可以是牵引显微术 (traction microscopy)。例如，细胞可以与基底连接，基底例如但不限于有机硅、水凝胶、 聚丙烯酰胺、层粘连蛋白、或弹性蛋白。基底可以进一步涂布有胶原。微珠例如荧光微珠可以包埋在基底的顶表面的附近，以追踪显微镜下细胞骨架网络的动力学。在某些实施方案中，微珠的直径为至少0. 001 μ m,至少0. 005 μ m,至少0. 01 μ m，至少0. 05 μ m,至少0. 1 μ m， 至少0· 15 μ m,至少0· 2 μ m，至少0· 25 μ m,至少0· 3 μ m，至少0· 35 μ m，至少0· 4 μ m,至少 0. 45 μ m或至少0. 5 μ m。在某些实施方案中，微珠的直径为0. 2 μ m。刚性和拉伸是系统内可以控制的两个变量。例如，刚性可以通过调整基底例如水凝胶基底的浓度来控制，并且拉伸力可以通过施加到基底的力的量级来控制。基底可以沿轴被拉伸。例如，基底可以沿两个正交轴应用计算机控制的步进电机被对称地拉伸。在某些实施方案中，将拉伸和刚性以有效增加来自细胞的蛋白质生产水平的量施加到细胞上。在某些实施方案中，在细胞培养板例如多孔细胞培养板内的基底上培养细胞。在某些实施方案中，可以通过向细胞或细胞培养物施加声压例如超声波或任何其他高频或低频声波来产生张拉整体力，该声压可以任选地以循环(cyclic)方式提供。这种声压可以改变细胞的性质。例如，在低声频下，经受循环声音应力的CHO细胞可以变更其表达和/或分泌途径并增加蛋白质生产水平。在某些实施方案中，将循环声压以有效增加来自细胞的蛋白质生产水平的量施加到细胞上。在某些实施方案中，可以监测经受张拉整体力的细胞的活力和形态。可以使用能透过细胞的膜的染料来测定细胞活力。例如，可以使用可透过膜的荧光细胞标记，例如钙荧光素AM，一种绿色荧光细胞标记，来监测细胞活力。钙荧光素AM是可透过膜的，并且可以经由温育而引入到细胞内。一旦在细胞内部，钙荧光素AM被内源性酯酶水解成高负电荷的绿色荧光钙荧光素。荧光钙荧光素保留在活细胞的细胞质内。还可以使用染料排斥试验来确定在细胞悬液或细胞培养物中存在的活细胞的数目。活细胞具有排斥某些染料例如但不限于锥虫蓝、伊红和丙啶的完整细胞膜，而死细胞则不如此。在染料排斥试验中，细胞悬液或培养物可以与染料混合，并目测以确定细胞是否摄取或排斥染料。可以使用例如安装在倒置光学显微镜上的血细胞计数器来计数细胞。活细胞具有透明细胞质，而非活细胞具有经染料标记的细胞质。在某些实施方案中，细胞活力可以通过测量活细胞中酶的活性来测定。测定细胞活力的方法也可以用于测定细胞增殖的速率。例如，可以测量在细胞死亡之后短时间内失活的线粒体酶的活性以测定细胞活力。在某些实施方案中，可以用XTT细胞活力测定试剂盒(XTT Cell Viability Assay Kit)测量线粒体酶活性。XTT是四唑衍生物。活细胞中的线粒体酶将XTT还原为高水溶性橙色产物。从XTT产生的水溶性产物的量与样品中活细胞的数目成比例，并且可通过测量在475nm波长处的吸光度进行定量。细胞迁移和形态是下层细胞骨架组织和动力学改变的后果。可以使用显微技术监测经受张拉整体力的细胞的迁移和形态，以评估细胞迁移和形态随时间的改变。这种显微技术包括但不限于扫描电子显微术、相差显微术和透射电子显微术。在某些实施方案中，可以测量经受张拉整体力的细胞或细胞培养物分泌的蛋白质的水平，以确定蛋白质生产的增加。在一个非限制性实例中，蛋白质是由细胞分泌到其微环境中的抗体。例如，可以通过使含有抗体的溶液接触与基底的表面结合的抗体结合物质，测定所分泌抗体的量。可以定量结合抗体的量。例如，可以通过使抗体接触与大孔聚合树脂的表面共价结合的蛋白A配体，测量所分泌的IgG抗体。可将细胞离心，并可在蛋白A柱上注射所收集的上清液，由此俘获样品中的IgG。然后，可以通过降低pH并直接在280nm处检测洗脱的物质，洗脱结合的IgG。在某些实施方案中，一旦已获得包含抗体的溶液或混合物，则可以使用不同纯化技术的组合，实施抗体与细胞生产的其他蛋白质的分离，所述纯化技术包括一个或多个离子交换分离步骤和一个或多个疏水相互作用分离步骤。分离步骤基于蛋白质的电荷、疏水性程度或大小来分离蛋白质的混合物。在某些实施方案中，使用色谱法，包括阳离子、阴离子和疏水相互作用实施分离。对于这些技术中的每一种可得到几种不同的色谱法树脂，允许准确定制针对所涉及的具体蛋白质的纯化方案。每种分离方法的本质在于，可以使蛋白质以不同速率向下穿越柱，实现物理分离，该物理分离随蛋白质进一步向下通过柱而增强， 或者使蛋白质选择性粘着于分离介质，然后通过不同溶剂来差别地洗脱。在一些情况下，当杂质特异性粘着于柱而抗体不如此，即抗体存在于通过的流体内时，抗体与杂质分离。在某些实施方案中，使用分离步骤将抗体与一种或多种宿主细胞蛋白质分离。在某些实施方案中，纯化策略排斥使用蛋白质A亲合色谱法，例如IgG3抗体的纯化，因为IgG3 抗体与蛋白质A低效率结合。允许特别定制纯化方案的其它因素包括但不限于存在或不存在Fc区域(例如，与其Fab片段相比，在全长抗体的背景下)，因为蛋白质A与Fc区域结合；在产生所关注抗体中使用的具体种系序列；和抗体的氨基酸组成(例如抗体的一级序列以及分子的总电荷/疏水性)。共享一种或多种特征的抗体可以应用定制成利用该特征的纯化策略来纯化。2.经由施加张拉整体力来调节靶标蛋白质生产
在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞培养物表达所关注的靶标蛋白质。在某些实施方案中，靶标蛋白质是重组表达的蛋白质。在某些实施方案中，靶标蛋白质是抗体。在某些实施方案中，向细胞或细胞培养物施加张拉整体力增加通过细胞或细胞培养物的靶标蛋白质例如重组表达抗体的生产。术语“抗体”如本部分所用是指完整抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，细胞和细胞培养物表达并分泌抗体ABT-874。本发明的抗体可以通过多种技术产生，包括用所关注的抗原对动物免疫接种，随后进行常规的单克隆抗体法，例如Kohler和Milstein (1975) Nature 256 495的标准体细胞杂交技术。虽然在原则上优选体细胞杂交程序，但可以使用用于生产单克隆抗体的其它技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。一种用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠类系统。杂交瘤生产是一种非常充分确立的程序。用于分离已免疫脾细胞以供融合的免疫接种方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。抗体优选可以是人抗体、嵌合抗体、或人源化抗体。本公开的嵌合抗体或人源化抗体可以根据如上所述制备的非人单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的 DNA可以从所关注的非人杂交瘤获得，并使用标准分子生物学技术来工程化成含有非鼠类 (如人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠类可变区连接到人恒定区(参见例如授予Cabilly等人的美国专利号4，816，567)。为产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠类CDR区插入人框架中(参见例如授予Winter的美国专利号5，225，539，和授予Queen等人的美国专利号5，530，101,5, 585，089,5, 693，762 以及 6，180，370)。为表达本发明的抗体，将编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一种或多种表达载体中，使得基因操作地连接到转录和翻译控制序列。(参见例如美国专利号6，914，128， 其全部教导内容以引用方式并入本文。)在此背景中，术语“操作地连接”旨在意指抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控该抗体基因的转录和翻译的意图功能。表达载体和表达控制序列经选择以与所用表达宿主细胞例如CHO细胞相容。 可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独载体中，或更一般而言，将两种基因插入相同表达载体中。通过标准方法(例如，连接在抗体基因片段和载体上的互补限制位点，或者如果不存在限制位点则平端连接)，将抗体基因插入表达载体中。在插入抗体或抗体相关的轻链或重链序列之前，表达载体可以已携带抗体恒定区序列。例如，一种将抗体或抗体相关的VH和VL序列转变为全长抗体基因的方法是将它们分别插入到已编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段操作地连接到载体内的一个或多个CH区段并且VL区段操作地连接载体内的CL区段。另外或替代地，重组表达载体可以编码促进从宿主细胞生产抗体链的信号肽。抗体链基因可以被克隆到载体中，使得信号肽在框架内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。除了抗体链基因之外，本发明的重组表达载体可以携带控制宿主细胞中抗体链基因的表达的一种或多种调控序列。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录或翻译的其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这种调控序列描述在例如 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185，Academic Press, San Diego, CA (1990)中，其全部教导内容以引用方式并入本文。本领域技术人员会了解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可取决于这些因素，如待转化的宿主细胞的选择、期望蛋白的表达的水平等等。用于哺乳动物宿主细胞表达的适宜的调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白表达的病毒元件，例如源自下列的启动子和/或增强子巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40 (SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤。对于病毒调控元件和其序列的进一步描述参见例如Stinski的美国专利号5，168，062、Bell等人的美国专利号4，510，245和Schaffner等人的美国专利号4，968，615，其全部教导内容以引用方式并入本文。除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体可以携带一种或多种附加的序列，例如在宿主细胞中调控载体的复制的序列(例如复制起点)和/或选择标记基因。选择标记基因促进对其中已引入载体的宿主细胞的选择(参见例如均为Axel等人的美国专利号4，399，216,4, 634，665和5，179，017，其全部教导内容以引用方式并入本文)。 例如，一般而言，选择标记基因在其中已引入载体的宿主细胞上赋予对药物例如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。适宜的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr宿主细胞中连同氨甲喋呤选择/扩增应用)和neo基因(用于G418选择)。本发明的抗体或抗体部分可以通过在宿主细胞例如CHO细胞中免疫球蛋白轻链和重链基因的重组表达来制备。为重组表达抗体，用携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的一种或多种重组表达载体来转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达并分泌到宿主细胞在其中培养的培养基中，所述抗体可以从该培养基中回收。使用标准的重组DNA方法来获得抗体重链和轻链基因，将这些基因掺入到重组表达载体中并将载体引入到宿主细胞中，例如以下中描述那些方法Sambrook，Fritsch和Maniatis (编)，Molecular Cloning ；A Laboratory Manual, 第二版，Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989), Ausubel 等人(编)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)；以及美国专利号 4，816，397 和 6，914，128，其全部教导内容以引用方式并入本文。为表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用来将外源DNA引入到原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但适宜的是在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这种真核细胞、并且尤其是哺乳动物细胞比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠的和具免疫活性的抗体。据报道，对生产高收率的活性抗体来说，抗体基因的原核表达是低效率的(Boss和Wood (1985) Immunology Today 6 12_13，其全部教导内容以引用方式并入本文)。用于在本文载体中克隆或表达DNA的适宜宿主细胞是原核生物细胞、酵母细胞、或高等真核生物细胞。用于此目的的适宜原核生物包括真细菌属(eubacteria)，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠杆菌(E. col i)，肠道菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属 (Salmonella)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia) 如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis) (如地衣芽孢杆菌41P，公开在1989年4月12日公布的DD266，710中)，假单胞菌属 (Pseudomonas)例如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)，禾口链霉菌属(Streptomyces)。一种适宜的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294 (ATCC 31，446)，但诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776 (ATCC 31，537)、和大肠杆菌13110 (ATCC 27，325)的其它菌株也是适宜的。这些例子是说明性的而非限制性的。除了原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是用于多肽编码载体的适宜的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、或常见的面包酵母 (baker's yeast)是低级真核宿主微生物中最常用的。然而，若干其它的属、种和菌株在本文中通常是可利用和有用的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K. Iactis)、脆壁克鲁维酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16,045)、 魏氏克鲁维酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、瓦尔特克鲁维酵母(K. waltii) (ATCC 56，500)、果蝇克鲁维酵母(K. drosophilarum) (ATCC 36，906)、耐热克鲁维酵母 (K. thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia) (EP 402, 226)；毕赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244，234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；禾口丝状真菌(filamentous fungi),例如脉孢菌属(Neurospora)宿主、青霉菌属(Penicillium)宿主、弯颈霉属(Tolypocladium)宿主、和曲霉菌属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲菌(A. nidulans)禾口黑曲霄(A. niger)。用于表达糖基化抗体的适宜宿主细胞源自多细胞生物。无脊椎细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴定了许多杆状病毒菌株和变体，以及来自诸如草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) ( ) ,i^RP^C (Aedes aegypti) ( 〒)、^^Cp^C (Aedes albopictus)(岐子)、黑腹果也黾(Drosophila melanogaster)(果也黾)禾口家香(Bombyx mori) 的宿主的对应许可的昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒菌株是可公开得到的，如苜蓿夜蛾(Autographa californica) NPV的L-I变体和家蚕NPV的Bm_5菌株，并且这种病毒可以在此用作根据本发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、 矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。用于表达重组抗体的适宜的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞) (包括dhfr-CHO细胞，描述在Urlaub和 Chasin，(1980) PNAS USA 77 4216-4220，连同 DHFR 选择标记应用，如描述在Kaufman和Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621，其全部教导内容以引用方式并入本文)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，抗体如下生产培养宿主细胞足够的时间以允许在宿主细胞中表达抗体或将抗体生产到宿主细胞生长于其中的培养基中。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CVl系(C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系 (亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人，J. GenVirol. 36:59 (1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR (CHO, Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；小鼠塞托利细胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23:243-251 (1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞 (VER0-76, ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA, ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL 34)；纯系大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)； TRI 细胞(Mather 等人，Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ;MRC 5 细胞；FS4 细胞；和人肝癌系(Hep G2)，其全部教导内容以引用方式并入本文。宿主细胞经用于抗体生产的上述表达或克隆载体转化，并在经适当改性用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中培养。用于生产抗体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售的培养基，例如Ham’ s FlO (Sigma)、Minimal Essential Medium ((MEM) (Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)禾口 Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma)适于培养宿主细胞。另外，在 Ham 等人，Meth. Enz. 58:44 (1979) ;Barnes 等人，Anal. Biochem. 102:255 (1980)； 美国专利号 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；WO 90/03430 ； WO 87/00195 ；或美国专利号Re. 30，985中所述的任何培养基可以用作用于宿主细胞的培养基，它们的全部教导内容以引用方式并入本文。可以根据需要，用激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液 (例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或等价的能量来源补充任何这些培养基中的任一种。也可以以本领域技术人员会已知的适当浓度包括任何其他必要的补充物。培养条件例如温度、PH等是连同选择用于表达的宿主细胞先前使用的那些， 并且对一般技术人员将是显而易见的。 宿主细胞也可以用于生产完整抗体的部分，例如Fab片段或scFv分子。应理解，上述程序的变化在本发明范围之内。例如，在某些实施方案中，可期望的是用编码本发明抗体的轻链或重链(但并非同时编码这两种)的DNA来转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于除去编码对与靶标抗原结合不是必需的轻链和重链中的任一或两者的DNA的某些或全部。 本发明的抗体也涵盖从这种截短的DNA分子表达的分子。另外，通过用标准化学交联法将第一抗体与第二抗体交联，可以生产双功能抗体，其中一个重链和一个轻链来自第一抗体， 并且另一重链和轻链对于不同抗原具有特异性。 在用于抗体或其抗原结合部分的重组表达的适宜系统中，通过磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自操作地连接到CMV增强子/AdMLP启动子调控元件以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许选择已应用氨甲喋呤选择/扩增用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达抗体重链和轻链，并且从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在周质间隙中生产，或直接分泌到培养基中。在某些实施方案中，如果在细胞内生产抗体，作为第一步骤，可以通过例如离心或超滤除去颗粒碎片，其为宿主细胞或裂解细胞(例如，由均化作用产生)。在将抗体分泌到培养基中的情况下，可以使用市售的蛋白浓缩滤器首先将来自这种表达系统的上清液浓缩，例如 Amicon “或 Millipore Pellicon 超滤装置。3.包括张拉整体力优化的大规模蛋白质生产
在某些实施方案中，张拉整体模型可以被按比例扩大，使得可以将张拉整体力施加到生产商业相关蛋白质的细胞，例如在市售生物反应器中培养的细胞。在某些实施方案中，可以将机械剪切应力施加到在生物反应器中培养的细胞。例如，可以经由以有效诱导机械应力例如细胞膜的拉伸的速率涡旋或混合细胞，将这种应力施加到细胞。在某些实施方案中，这种机械应力有效增加来自培养物中细胞的蛋白质的生产。在某些实施方案中，使生物反应器中培养的细胞与磁珠例如先前所述的铁磁微珠接触，其中可以以有效增加来自细胞的蛋白质生产的量使用膜结合磁珠，将剪切应力(扭矩)施加到表面。在某些实施方案中，例如，通过能够使细胞受到不同的双轴应力/应变的生物力学系统，可以将张拉整体力施加到生物反应器中培养的细胞。例如，生物反应器可以包括用于供培养物的细胞粘着的基底。这种基底可以包括细胞与其粘着的数个表面区域。在某些实施方案中，基底可以包括细胞与其粘着的蜂巢样基底。在某些实施方案中，生物反应器包括细胞可以与其粘着的珠或其它基底。在某些实施方案中，可以沿一个或多个轴，以有效改变粘着于基底的细胞的形态或形状的量，拉伸或操纵基底。在某些实施方案中，以有效增加来自细胞的蛋白质生产的量来改变细胞的形态或形状。在某些实施方案中，通过将循环声压施加到细胞，使生物反应器中培养的细胞经受张拉整体力。例如，可以以有效增加来自细胞的蛋白质生产的量，将超声波、或任何其他的高频或低频声波施加到细胞。在某些实施方案中，细胞为自由漂浮细胞。在某些实施方案中，张拉整体力可以产生细胞或细胞培养物的性质的持久或永久的改变，例如，通过细胞的蛋白质生产的增加。这种细胞性质的改变可以通过基因表达中的修改引起。例如，但并非限制，对板培养物上粘着CHO细胞的循环拉伸可以引起蛋白表达和 /或分泌、例如通过细胞的抗体表达和/或分泌的永久增加。然后，可以在其中细胞生长于悬浮液中的生物反应器内，按比例扩大具有增加的蛋白表达和/或分泌的这些细胞。
实施例1.细胞培养物
使用生产重组的、糖基化抗体(例如ABT-874)的CHO细胞。使生产ABT-874的漂浮 CHO细胞适应于在血清中生长。使细胞在补料分批反应器中所用的标称生长条件下于细胞
培养板上培养。2在细胞上张拉整体力的产生
使用如下2. 1和2. 2部分所述的两种不同技术将细胞引入张拉整体模型。使用基于细胞的测定来优化和评估由这些力诱导的力传导变化。2. 1 光磁扭转细胞计量术
在不同时间点，使细胞经受直接施加到细胞表面的受控的机械剪切应力。使用涂布有粘着于细胞的细胞骨架的抗CHO抗体的膜结合铁磁珠(直径1-6 μ m)，将剪切应力(扭矩) 施加到表面。通过施加较弱的扭转磁场，在一个方向上磁化珠。采取电子显微图像，以示出与CHO细胞的表面的铁磁珠连接。使用磁扭转细胞计量术(MTC)测定引起对应力施加的响应的细胞变形。MTC是用于通过首先磁化并然后旋转与细胞的表面结合的铁磁珠对活细胞施加机械应力的技术。 用于施加磁场的实验程序和参数描述在Na. S和Wang. N (2008) Science Signaling 1(34) :pll的方案中。简单来说，MTC装置由七个主要元件组成(i)提供电流以磁化珠的高压发电机；(ii)用于扭转所述珠的一个[用于一维(ID) MTC]双极电源；(iii)用于控制扭转设备的计算机；(iv)用于观察样品的倒置显微镜；(ν)电荷耦合装置(CCD)相机，其使用能够使图像俘获与阶跃函数或振荡波磁场同步的软件；(vi)维持培养细胞的正确温度的装置；和(vii)显微镜插入件，其保持样品并且含有用于ID MTC的两对线圈，所述线圈产生用于磁化和扭转所述珠的交变电场(可商购自Eberhard EOL Inc.，Switzerland)。Na. S和 Wang. N (2008) Science Signaling 1(34):pll。2. 2牵引显微术
牵引显微术是能够使粘着细胞受到不同的双轴应力/应变培养条件和测试并同时允许实时显微镜成像的生物力学培养系统。将细胞连接在水凝胶基底如聚丙烯酰胺上，该基底进一步涂布有胶原。直径0. 2 μ m的荧光微珠包埋在凝胶顶表面附近以在显微镜下追踪细胞骨架网络的动力学。An, S. S.，等人，(2006) Am J Respir Cell Mol Biol 35(1) P. 55-64。刚性和拉伸是系统内的两个受控变量。刚性通过调整水凝胶基底的浓度来控制， 并且拉伸力通过所施加的力的量级来控制。使用计算机控制的步进电机沿两个正交轴对称地拉伸水凝胶。该配置允许控制包括应变量级和应变速率的多个参数。Artmarm，G. Μ.和 S. Chien, (2008), Bioengineering in cell and tissue research. Springer。以约20秒的间隔拉伸水凝胶基底约30分钟。通过荧光成像俘获形态学变化。进一步温育细胞，并通过实施基于细胞的测定在各种时间点测量由力传导导致的变化。3.细胞活力的定量分析
钙荧光素AM是广泛使用的绿色荧光细胞标记。钙荧光素AM是膜渗透的，并且可以经由温育而引入到细胞内。一旦在细胞内部，则钙荧光素AM(非荧光分子)被内源性酯酶水解成高负电荷的绿色荧光钙荧光素。荧光钙荧光素保留在活细胞的细胞质内。由于其缺乏细胞毒性，钙荧光素AM作为用于研究细胞膜完整性和用于长期细胞追踪的优异工具。使用相差显微镜，通过获得荧光显微图像来进一步定量细胞。4.细胞活力的定性分析 4. 1 XTT测定
XTT细胞活力测定试剂盒提供用于使用标准小平板吸光度读数器确定活细胞数目的简单方法。活细胞数目的确定通常用于评价细胞增殖的速率和筛选细胞毒剂。XTT是四唑衍生物。其根据在还原XTT并在细胞死亡之后很快失活的活细胞中线粒体酶的活性来测量细胞活力。在温育时，其容易还原为高水溶性的橙色产物。从XTT产生的水溶性产物的量与样品中活细胞的数目成比例，并且通过测量在475nm波长处的吸光度进行定量。4.2 细胞活力的锥虫蓝排斥试验
使用染料排斥试验来确定细胞悬液中存在的活细胞的数目。其根据下列原则活细胞具有排斥某些染料例如锥虫蓝、伊红、或丙啶的完整细胞膜，而死细胞没有。在该试验中，将细胞悬液与染料混合，并且然后目测以确定细胞是否摄取或排斥染料。使用安装在倒置光学显微镜上的血细胞计数器对细胞进行计数。活细胞因其透明细胞质被区分，而非活细胞具有蓝色细胞质。5. IgG 的生产
在本研究中所用的细胞分泌IgG。IgG被直接释放到形成细胞微环境的培养基中。应用的生物系统免疫检测传感器盒(Biosystems ImmunoDetection Sensor Cartridge)是用于测量来自各种动物种类的大多数IgG (免疫球蛋白G)亚类的测定装置。其含有与大孔聚合树脂的表面共价结合的蛋白质A配体。将细胞离心，并在蛋白质A柱上注射收集的上清液。俘获样品中的IgG，并在传感器盒中浓缩。然后，通过降低流动相pH并直接在280nm 处检测洗脱的物质，从传感器盒洗脱结合的IgG。该程序适用于基于哺乳动物细胞培养物的发酵样品中所关注IgG的浓度确定。6.细胞形态
细胞迁移和形态的变化是下层细胞骨架组织和动力学改变的后果。其可用于理解因施加外力而导致的细胞结构的变化。贯穿其生命周期的细胞的发展以因果相关的细胞事件的连续性为基础。使用本领域显微技术如扫描电子显微术、相差显微术、透射电子显微术的状态来评估细胞行为随时间的变化。本文中引用各种出版物，它们的内容由此以引用方式全文并入。
权利要求
1.一种用于增加来自宿主细胞的蛋白质生产的方法，其包括使所述细胞经受张拉整体力，其中将所述张拉整体力以有效增加来自所述细胞的蛋白质生产的量施加于所述细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述张拉整体力是机械剪切应力。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞粘着于基底并且所述张拉整体力是双轴应力。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体是ABT-874。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞在生物反应器中培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞粘着于基底。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述张拉整体力是循环声压。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述循环声压是超声。
11.根据权利要求2所述的方法，其中使所述细胞与铁磁微珠接触，并且其中将磁力施加于所述铁磁微珠。
全文摘要
本发明公开经由在细胞和细胞培养物上施加张拉整体力来调节蛋白质生产的方法。本发明的方法增加来自细胞和细胞培养物的蛋白质的生产。张拉整体力可以是施加到细胞的应力，并且可以包括以下一种或多种机械应力、剪切应力、拉伸效应以及压力诱导应力。
文档编号C12N15/67GK102471775SQ201080031389
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月15日 优先权日2009年7月15日
发明者科雷亚 I., 皮帕里亚 R. 申请人:雅培制药有限公司