专利名称：一种温度敏感的猪肺炎支原体疫苗株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪肺炎支原体株，含有该株的疫苗，以及该疫苗在保护猪免患支原体肺炎中的应用。
背景技术：
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是引起猪支原体肺炎(也称为地方性肺炎(EP))的病源因素。这是在全球范围内最为常见，具有经济显著性并且影响到猪生产的呼吸性疾病之一。这种疾病通常会伴随着继发性感染，高发病率，低死亡率以及低饲料转化率，这种疾病所造成的全球经济损失估计为约每年十亿美元。在地方性肺炎中，猪肺炎支原体细菌粘附到猪肺部上皮细胞的纤毛上，摧毁健康的正常纤毛，同时造成机会性生物进入呼吸道组织中从而引起疾病。一旦造成，猪肺炎支原体会引起猪肺部损伤。这种疾病具有高传染性，其传播通常是由直接接触感染的呼吸道分泌物所造成， 例如打喷嚏或者咳嗽时由口鼻部或嘴喷出的液滴。目前已经研制出一些抗猪肺炎支原体的疫苗，其中大多数疫苗由约十个公司的22 个被注册为单价或二价/多价的疫苗商标所提供。所有的疫苗都是灭活或者失活的猪肺炎支原体制剂。全细胞失活的猪肺炎支原体疫苗的实例包括RESPISURE 和STELLAMUNE (辉瑞)，SUVAXYN Μ. ΗΥ0 (富道)，HY0RESP (梅里亚)，M+PAC (先灵葆雅)，以及 P0RCILIS (英特威)。虽然一些疫苗能够减弱EP的严重性，但没有任何一种全细胞灭活或者失活的疫苗能够完全免除猪肺炎支原体的感染，因此，制备更加高效的疫苗正是当务之急。本发明优选实施方式的目的在于提供适用于接种的活猪肺炎支原体株来抑制地方性肺炎。本说明书中引用的全部参考文献，包括任何专利或专利申请，在此一并纳入作为参考。在此明确表示尽管本文引用了一些现有技术的公开文件，但这些参考文件并不构成对这些文件中的任何内容都构成本领域的部分公知常识的认可。
发明内容
本发明大体上提供了一种活的减毒(live attenuated)猪肺炎支原体株，该株能够用来生产有效地保护猪免患地方性肺炎的活疫苗。第一方面，提供了一种减毒的猪肺炎支原体株，这种减毒的猪肺炎支原体株含有在至少一个表1中列出的基因上的突变。在一种实施方式中，疫苗株含有在表1中列出的全部基因上的突变。在一种实施方式中，疫苗株是温度敏感的。减毒疫苗通常具有很多优越性，因为他们携带着天然状态下的所有感染剂(infectious agent)的免疫原决定簇并将其带入宿主的免疫系统中，并且由于该试剂在疫苗宿主体内能够增殖，使得免疫剂的使用量相对少。减毒的方法包括将毒性株传代数次或者暴露于放射线或化学药物。可以猜想到，这些方式会向基因组中引入突变，造成微生物毒性降低但是仍可复制。这些方式的缺陷在于，引入的突变是随机性的，无法在分子水平上表征。筛选减毒的方法，例如伴随温度敏感的筛选，也是非常耗时的，而且会得到错误的结果，因为温度敏感的疫苗株可能未减毒，而减毒株不需要是温度敏感的。这个过程需要不断地尝试和错误。 另外，减毒株也可能进一步突变，转化为剧毒的。为了提供抗猪肺炎支原体的活疫苗，发明人用利用化学突变法得到的猪肺炎支原体进行试验，并筛选温度敏感的克隆体。发明人冻干了活的突变体细菌，发现一周之后该细菌能够恢复活性并且连续传代后仍保持活力。这适于用作抗猪肺炎支原体的疫苗株。对疫苗株和原株(master strain)进行测序并比较疫苗株中突变的、序列确认的基因，从而满足减毒株在基因水平上的表征。第二方面，提供一种减毒的猪肺炎支原体疫苗株，该疫苗株是温度敏感和减毒的， 已经被保藏于国家计量研究院(澳大利亚)，保藏号为NM04/41259。第二方面所述的疫苗株已显示出具有保护性免疫，并且显示出不会因为连续传代而转化为剧毒的(数据没有示出)。第三方面包括制备第一方面或第二方面的疫苗株的方法，该方法包括使用合适的猪肺炎支原体起始分离株(starting isolate)进行化学突变，以及筛选出在连续传代后仍保持活力的突变体。在一种实施方式中，基于温度敏感性对突变体进行第一次筛选。第四方面提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有第一方面或第二方面所述的猪肺炎支原体疫苗株，以及载体，可选的佐剂，和/或可选的至少一种额外添加的感染剂， 免疫量内的疫苗能够诱发对于由猪肺炎支原体引起的疾病的保护性免疫。所述感染剂可以是病毒，细菌，真菌或者寄生生物。第五方面提供了一种保护猪类动物免患由猪肺炎支原体引起的疾病的方法，该方法包括给药猪类动物免疫量的第四方面所述的疫苗组合物。第六方面提供了第四方面所述的保护猪类动物免患由猪肺炎支原体引起的疾病的疫苗。第七方面提供了一种制备根据第四方面的疫苗的方法，该方法包括，将所述第一方面或第二方面所述的猪肺炎支原体株与载体，可选的佐剂，和/或可选的至少一种额外添加的感染剂组合在一起。感染剂可以是病毒，细菌，真菌或者寄生生物。第八方面提供了第一方面或第二方面所述的猪肺炎支原体疫苗株在制备保护猪类动物免患由猪肺炎支原体引起的疾病的药物中的应用。在第四方面到第七方面中的实施方式中，“由猪肺炎支原体引起的疾病”指的是地方性肺炎或猪支原体肺炎。
图1 高度过量(high overdose)接种疫苗的猪中tsl9疫苗株的鼻定植(nasalcolonisation)0图2 :高度过量接种tsl9疫苗株的猪中，接种后(DPV) 59天的气管定植(tracheal colonisation)0图3 接种不同剂量tsl9疫苗株的猪的鼻定植。图4 研究期间(105天)不同的总体重。图5 :tsl9最小保护性剂量的确定。图6 基于肺损伤的严重性的减轻，tsl9和商品化疫苗的保护性指数。
具体实施例方式猪肺炎支原体株“LKR”最初从屠宰场样本中分离出来(Lloyd and Etheridge 1981，J of Comp Path 91 :77-83)。该生物从实验性感染的猪中再分离，然后在细胞培养基中传代约10次，得到克隆化分离物(CSIR0，Victoria)。该克隆体随后提交至南澳大利亚 Η ξ Ι^'^^Ι^' Φ^ Φ^ (University of Adelaide Mycoplasma collection)。然、 后，该LKR分离株由墨尔本大学兽医科学系(支原体组)得到，在该处，该LKR分离株在改良Friss肉汤中进行了 3次体外传代并保存，保存的药瓶表示为“LKR P3 29/5/97”。这个克隆体作为亲本株。LKR P329/5/97株在体外进行传代，使用先前描述的方法(Nonamura and Imada (1982) Avian Diseases 26 :763-775)进行 NTG 突变 QOOmg/ml)。从琼脂平板上筛选出温度敏感的克隆体(“ts-19”)，于3ml改良Friss肉汤中培养。这个克隆体的传代数目命名为“P0”，随后在体外使用改良Friss肉汤传代四次，每次传代按照1 4体积比稀释。 最终传代级别命名为“ LKR ts-19P4MS”。LKR ts-19P4MS在改良Friss肉汤中进行多次体外稀释传代，达到稀释为 3. 2X10—21，最终的突变克隆体命名为“LKR ts-19 3.2X10-21”。将LKR ts-19 3. 2X 10_21冻干，提交至澳大利亚政府分析实验室(布达佩斯条约中国际承认的用于专利程序目的生物体的保藏)，保藏号为NM04/41259。支原体具有高度简化的基因组，从而反映出它们有限的生物合成功能，它们依赖于宿主寄生。鉴于他们基因组中有限的冗余，通路特定组分的NTG突变，对于支原体细胞的生存有重要的意义。NTG突变能够导致基因组的随机突变(核苷酸的转换，颠倒，缺失或插入)。这样能够得到一系列的突变基因组，每个突变基因组含有一个或多个的突变。假定因为突变造成一个或多个至关重要的基因丧失功能从而使突变基因组中的大多数不能够存活。如果突变体不引发对生物体生长能力的有害影响，那么这些存活下来的突变体生物体能够进行下一步的筛选(例如温度筛选)。在tsl9的发展过程中，筛选基于该突变株在33°C的温度下生长为高滴度株(titre)的能力以及在39. 5°C的生长能力下降。基于猪肺炎支原体疫苗株tsl9与亲本株(LKR)的全基因组序列比对，tsl9基因组中的一些突变 (核苷酸改变)被确认。这些突变包括核苷酸的取代(转换和颠倒)，也有缺失以及插入。这些突变分散于全基因组中，包括一系列表达的基因和假定蛋白以及非编码序列。表1列出了由碱基取代，缺失或插入造成突变的已知基因。这些基因根据它们的主要功能进行了分类，本领域技术人员能够通过确定给定的参考序列(例如YP_278901. 1)与减毒株的序列是否具有差别来容易地理解如何检测猪肺炎支原体株是否含有表1中列出的任一基因的突变。Tsl9，保藏号为NM04/41259，是一种减毒株，包括表1中列出的所有突变。在一种实施方式中，所述减毒株包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 个或者所有表 1 中
列出的突变体。在一种实施方式中，所述减毒株包括表1中列出的一个或者每个毒性因子 (virulence factors)的突变，和/或参与糖代谢的一个或每个基因的突变，和/或参与磷脂代谢的一个或每个基因的突变，和/或参与辅酶代谢的一个或每个基因的突变，和/或参与转录或翻译的一个或每个基因的突变，和/或参与膜运输的一个或每个基因的突变，和/ 或参与DNA复制、修复或代谢的一个或每个基因的突变，和/或转座酶基因的突变。在一种实施方式中，所述减毒株含有每个毒性因子的突变。表1 猪肺炎支原体疫苗株tsl9的基因中的减毒突变。
权利要求
1.一种猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)疫苗株，其特征在于，该猪肺炎支原体疫苗株含有在至少一种列于表1中的基因上的突变。
2.一种猪肺炎支原体疫苗株，其特征在于，该猪肺炎支原体疫苗株保藏于国家计量研究院(澳大利亚)，保藏号为NM04/41259，这种疫苗株是温度敏感和减毒的。
3.制备权利要求1或2所述的疫苗株的方法，其特征在于，该方法包括使用合适的猪肺炎支原体起始株进行化学突变，以及筛选出在连续体外传代后仍保持活力的温度敏感的突变体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述起始株为猪肺炎支原体株LKRP3。
5.一种疫苗组合物，其特征在于，该疫苗组合物含有权利要求1或2所述的猪肺炎支原体株或者通过权利要求3所述的方法制备的猪肺炎支原体株，以及载体，可选的佐剂，和 /或可选的至少一种额外的感染剂，其中，免疫量的疫苗能够诱发保护性免疫以免患由猪肺炎支原体引发的疾病。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述感染剂为病毒、细菌、真菌或者寄生生物。
7.根据权利要求5或6所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物制成用于给药至呼吸道。
8.根据权利要求5或6所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物为气溶胶制剂。
9.一种抑制猪类动物患有由猪肺炎支原体引起的疾病的方法，其特征在于，该方法包括给药猪类动物免疫量的权利要求5-8中任意一项所述的疫苗组合物。
10.权利要求5-8中任意一项所述的疫苗用于抑制猪类动物患有由猪肺炎支原体引起的疾病。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述疫苗给药至呼吸道。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述疫苗通过吸入给药、鼻内给药或者通过气溶胶给药。
13.制备权利要求5所述的疫苗的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1或2所述的猪肺炎支原体株与载体，可选的佐剂，和/或可选的至少一种额外的感染剂组合在一起。
14.权利要求1或2所述的猪肺炎支原体株在制备用于抑制猪类动物患有由肺炎支原体引起的疾病的药物中的应用。
15.权利要求5所述的疫苗、权利要求9所述的方法或者权利要求10所述的应用中，所述由猪肺炎支原体引起的疾病为地方性肺炎或者猪支原体肺炎。
全文摘要
本发明涉及一种猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)疫苗株，该猪肺炎支原体疫苗株含有在列出的基因中至少一者上的突变，或为保藏于国家计量研究院(澳大利亚)，保藏号为NM04/41259的疫苗株，其中，所述株是减毒以及温度敏感的。本发明还涉及含有该株的疫苗及其制备方法和应用。
文档编号C12N1/20GK102458462SQ201080031403
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月19日 优先权日2009年5月19日
发明者G·布朗宁, P·马克姆, R·尤伟尔, Y·艾博斯艾尔奥斯塔 申请人:墨尔本大学, 澳大利亚生物资源公司