Let-7微小rna的功能和靶标的制作方法

专利名称：Let-7微小rna的功能和靶标的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及分子生物学领域。更具体的说，本发明涉及关系到与这样的生物途径有关的疾病的诊断和治疗的方法和组合物，所述生物途径直接或间接受let-7微小RNA(miRNA)家族调节。

背景技术：
在2001年，有几个研究小组使用克隆方法，从线虫(C.elegans)、果蝇(Drosophila)和人类分离和鉴定了一大批“微小RNA”(miRNA)(Lagos-Quintana等人，2001；Lau等人，2001；Lee和Ambros，2001)。已在似乎没有内源siRNA的植物和包括人类在内的动物中鉴定了几百个miRNA。因此，miRNA虽然与siRNA相似，但却是不同的。
迄今观察到的miRNA其长度为大约21-22个核苷酸，它们是从较长的前体产生，而这些前体是从非蛋白编码基因转录而来。参见Carrington等人(2003)的综述。这些前体形成能在自身互补区域中自身折回的结构；它们然后被动物中的核酸酶切酶(Dicer)或植物中的DCL1加工。miRNA分子通过与其靶标的精确或不精确碱基配对来中断翻译。
许多miRNA在众多生物中是保守的，这引出了这样的提议，即miRNA参与生物体整个生命中的必要生物过程(Esquela-Kerscher和Slack，2006)。具体的说，已指出miRNA参与调节细胞生长及细胞和组织分化；与癌症的发展有关的细胞过程。例如，lin-4和let-7都调节线虫发育过程中从一个幼虫阶段向另一个幼虫阶段的传代(Ambros，2001)。mir-14和bantam是果蝇miRNA，它们显然是通过调节参与细胞凋亡的基因的表达来调节细胞死亡(Brennecke等人，2003，Xu等人，2003)。
随着科学家们开始理解到miRNA分子在调节真核生物基因表达中所起到的广泛作用，对这些分子的研究在不断增加。具体的说，最近几个研究已证实，有许多miRNA的表达水平与各种癌症有关联(Esquela-Kerscher和Slack 2006综述)。有两个miRNA其表达的减低与人类慢性淋巴细胞性白血病强烈相关，这提供了miRNA与癌症之间的一个可能关联(Calin等人，2002)。其他人评估了众多的miRNA在多种人类癌症中的表达模式，观察到几乎所有的miRNA在许多癌症类型之间有差异表达(Lu等人，2005)。大多数研究只是根据间接证据将miRNA与癌症关联。但是，He等人(2005)提供了更多的直接证据，证明miRNA可通过迫使六种miRNA在小鼠中过量表达，导致B细胞淋巴瘤显著增加，而直接有助于引起癌症。
在人类中，let-7据认为在肺癌发展中起到作用。在许多肺癌细胞系中(Takamizawa等人，2004)，和在肺癌患者的肿瘤样品中相对于其正常样品而言(Takamizawa等人，2004；Johnson等人，2005)，Let-7表达都减低。let-7的过量表达抑制了肺癌细胞系A549的生长(Takamizawa等人，2004)。已证实Let-7能减少HepG2细胞中RAS癌基因的表达(Johnson等人，2005)。这些资料合在一起提示，let-7miRNA可在肺组织中充当肿瘤抑制物。
let-7对靶标基因的调节据认为主要是通过翻译抑制来发生，但mRNA不稳定性也可能是一个机制(Bagga等人，2005，Reinhart等人，2000)。除RAS外，在癌细胞中受let-7调节的基因、基因途径和基因网络在很大程度上仍未知。目前，这代表着其中let-7可能起作用的癌症的治疗的一个显著限制。
在动物中，大多数miRNA据认为是通过在其基因靶标的3’非翻译区当中的不精确碱基配对，来调节基因的。生物信息学分析提示，任何给定的miRNA可结合多达几百种不同基因并改变它们的表达。此外，单个基因可被几个miRNA调节。因此，每个miRNA都可调节基因、基因途径和基因网络之间的复杂相互作用。这些与miRNA相关的调节途径和网络的误调节或改变，很可能会导致紊乱、病理状况和/或疾病如癌症的发展。虽然生物信息学工具有助于预测miRNA结合靶标，但所有的工具都有局限性。由于与其靶标结合位点的不完全的互补性，单单用生物信息学工具难以精确预测miRNA靶标。
通过操纵miRNA表达或通过修复miRNA误调节来纠正基因表达错误，这两种做法代表着修复遗传失调和治愈疾病如癌症的有希望的方法。目前这个方法的缺陷是，有关受任何给定miRNA影响的调节途径和网络的细节在很大程度上仍未知。如上所述，生物信息学只能提供对miRNA靶标的数目和身份(identity)的不精确估计。因此存在着鉴定受let-7表达调节或可调节let-7表达的基因、遗传途径和遗传网络的需求。


发明内容
在具体的各方面，可根据一个或多个miRNA或mRNA的表达和/或异常表达，来选择受治疗者或患者进行治疗。在又一个方面，可根据一个或多个生物或生理途径的异常，包括一个或多个与某途径有关的基因的异常表达，或者包括一个或多个由一个或多个与某途径有关的基因编码的蛋白质的异常表达，来选择受治疗者或患者进行治疗。在某些方面，将本发明的组合物给予患有、怀疑患有或有危险发展以下疾病的受治疗者代谢性疾病、免疫疾病、感染性疾病、心血管疾病、消化疾病、内分泌疾病、眼睛疾病、泌尿生殖器疾病、血液疾病、肌肉骨骼疾病、神经系统疾病、先天性疾病、呼吸疾病、皮肤疾病或癌性疾病或病症。
在进一步的方面，可根据miRNA表达或者生物和/或生理途径的异常，来选择受治疗者或患者。可根据对miRNA或mRNA表达或该表达的缺乏的评估和/或分析，对受治疗者进行疗法或治疗方案的敏感性、抗性和/或功效方面的评估。可在将一个或多个疗法给予受治疗者或患者之前、给予过程中或给予之后，对受治疗者进行其对某些疗法的顺应性(amenability)的评估。通常，可通过分析miRNA和/或mRNA以及结合包括但不限于组织学、免疫组织化学、血液研究等在内的其他评价方法，来进行评估或评价。
在一些实施方案中，感染性疾病或病症包括细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或真菌性感染。这些基因和途径中有许多与各种癌症和其他疾病有关。癌性病症包括但不限于间变性大细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、睾丸肿瘤、星细胞瘤、急性骨髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、脂肪瘤、黑素瘤、套细胞淋巴瘤、黏液纤维肉瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、头部和颈部的鳞状细胞癌、甲状腺癌、尿路上皮癌，在这些癌性病症中对一个或多个基因的调节足以引起治疗应答。通常，癌性病症是一种异常高增殖性病症，它与生长不受控制或者不能进行包括细胞凋亡在内的细胞死亡有关。
本发明提供用以鉴定这样的基因的方法和组合物，所述基因是let-7调节的直接靶标，或者是hsa-let-7介导的上游基因表达修饰后的下游调节靶标。此外，本发明描述了生物样品中受hsa-let-7表达影响的基因途径和网络。这些基因和途径中有许多与各种癌症和其他疾病有关。let-7在细胞中的表达或功能的改变，会导致这些关键基因的表达的变化和导致疾病或其他病症的发展。将let-7(对于其中miRNA被下调的疾病)或let-7抑制剂(对于其中miRNA被上调的疾病)导入到疾病细胞或组织或受治疗者中，会导致产生治疗应答。本发明提供了受let-7直接或间接调节的关键基因的身份及其相关疾病。在某些方面，细胞可以是上皮细胞、基质细胞或黏膜细胞。细胞可以是但不限于是脑细胞、神经元细胞、血液细胞、食道细胞、肺细胞、心血管细胞、肝细胞、乳腺细胞、骨细胞、甲状腺细胞、腺细胞、肾上腺细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、肾细胞、膀胱细胞、前列腺细胞、子宫细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、脾细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、心肌细胞或横纹肌细胞。在某些方面，细胞、组织或靶标在miRNA表达方面可能没有缺陷，但可能仍在对miRNA的表达或过量表达发生治疗性应答。let-7可用作任何这些疾病的治疗靶标。在某些实施方案中，let-7可用来调节受治疗者、器官、组织或细胞中的let-7活性。
细胞、组织或受治疗者可以是癌细胞，可以是癌组织，隐匿癌组织，或者可以是经诊断发展某种疾病或病症或者有发展某种疾病或病症的危险的受治疗者或患者。在某些方面，癌细胞是神经元细胞、神经胶质细胞、肺细胞、肝细胞、脑细胞、乳腺细胞、膀胱细胞、血液细胞、白血病细胞、结肠细胞、子宫内膜细胞、胃细胞、皮肤细胞、卵巢细胞、脂肪细胞、骨细胞、子宫颈细胞、食道细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、肾细胞、睾丸细胞或甲状腺细胞。在进一步的方面，癌症包括但不限于间变性大细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、睾丸肿瘤、星细胞瘤、急性骨髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道鳞状细胞癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、脂肪瘤、黑素瘤、套细胞淋巴瘤、黏液纤维肉瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、头部和颈部的鳞状细胞癌、甲状腺癌、尿路上皮癌。
本发明的实施方案包括调节细胞、组织或受治疗者中的基因表达或者生物或生理途径的方法，所述方法包括给予该细胞、组织或受治疗者一定量的包含let-7核酸序列、模拟物序列或抑制剂序列的分离核酸或其模拟物，所述let-7核酸序列、模拟物序列或抑制剂序列的量足以调节受let-7miRNA家族成员正调节或负调节的基因的表达。“let-7核酸序列”包括let-7的全长前体或其互补序列或者let-7的加工的(即成熟)的序列和本文给出的相关序列，以及前体miRNA或其加工的序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个或更多个核苷酸，包括其间的所有范围和整数的核苷酸，或者它们的互补序列。在某些实施方案中，let-7核酸序列或let-7抑制剂含有全长加工的miRNA序列或其互补序列，称为“let-7全长加工的核酸序列”或“let-7全长加工的抑制剂序列”。在仍然进一步的方面，let-7核酸包含let-7的至少一个5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50核苷酸(包括这些数字之间的所有范围和整数)片段或互补片段，所述片段或互补片段与SEQ ID NO1至SEQ IDNO11有至少75、80、85、90、95、98、99或100％同一性。let-7这个通用术语包括共享成熟let-7序列的至少一部分的let-7家族所有成员。
在某些方面，let-7核酸或其片段或模拟物将包含前体miRNA或其加工序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个或更多个核苷酸，包括这些数字之间的所有范围和整数的核苷酸。在某些实施方案中，let-7核酸序列含有全长加工的miRNA序列，称为“let-7全长加工的核酸序列”。在仍然进一步的方面，let-7包含let-7的至少一个5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50核苷酸(包括这些数字之间的所有范围和整数)片段，所述片段与本文给出的各个SEQ ID NO有至少75、80、85、90、95、98、99或100％同一性。
在具体的实施方案中，含let-7或let-7抑制剂的核酸是hsa-let-7或hsa-let-7抑制剂或者它们的变体。在又一方面，let-7核酸或let-7抑制剂可与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个miRNA或miRNA抑制剂一起给予。各miRNA或它们的互补序列可同时地、依次地或按规定的进程(in an ordered progression)给予。在某些方面，let-7或let-7抑制剂可与miR-15、miR-16、miR-20、miR-21、miR-26a、miR-34a、miR-124、miR-126、miR-143、miR-147、miR-188、miR-200、miR-215、miR-216、miR-292-3p和/或miR-331中的一个或多个联合给予。所有的miRNA或其抑制剂或者它们的组合都可以以单一制剂给予。给予可以是在进行第二次疗法之前、过程中或之后给予。
let-7核酸或其互补序列还可包括各种异源核苷酸序列，即那些通常发现在自然界中不与let-7可操作地连接的序列，如启动子、增强子等。let-7核酸是重组核酸，且可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸。重组核酸可包含let-7或let-7抑制剂表达盒，即当导入到含有核酸合成用的各成分的环境中时能表达核酸的核酸片段。在又一个方面，表达盒包含在病毒载体或质粒DNA载体或其他治疗性核酸载体或包括脂质体等的递送运载体中。在一个具体的方面，let-7核酸是合成核酸。此外，本发明的核酸可以是完全合成的或部分合成的。在某些方面，病毒载体可以以1×102、1×103、1×104 1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014pfu或病毒颗粒(vp)给予。
在一个具体的方面，let-7核酸或let-7抑制剂是合成核酸。此外，本发明的核酸可以是完全合成的或部分合成的。在仍然进一步的方面，本发明的核酸或编码本发明这种核酸的DNA可以以0.001、0.01、0.1、1、10、20、30、40、50、100、200、400、600、800、1000、2000或4000μg或mg，包括这些数字之间的所有数值和范围给予。在又一个另外的方面，本发明的核酸，包括合成核酸，可以以0.001、0.01、0.1、1、10、20、30、40、50、100至200μg或mg/千克(kg)体重给予。本文描述的每一个数量都可在一段时间里给予，这一段时间包括0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟、小时、天、星期、月或年，包括这些数字之间的所有数值和范围。
在某些实施方案中，组合物的给予可以是肠道给予或胃肠外给予。在某些方面，肠道给予是口服给予。在另外的方面，胃肠外给予是病灶内、血管内、颅内、胸膜内、肿瘤内、腹膜内、肌肉内、淋巴内、腺内、皮下、局部、支气管内、气管内、鼻内、吸入或滴注给予。本发明的组合物可进行区域或局部给予，不必直接给予到病灶(lesion)。
在某些方面，受调节的一个或多个基因包含表2、3、4、5、6、7和8中所示的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200个或更多个基因或者基因的组合。在某些方面，基因的表达被下调或上调。在一个具体的方面，受调节的基因包含或选自(甚至可排除)ATRX、AURKA/STK6、AURKB/STK12、BRCA1、BRCA2、BUB1、BUB1B、B7RP、CCNA2、CCNB1、CCNE2、CCNG2、CDC2、CDC20、CDC23、CDC25A、CDC6、CDCA7、CDK2、CDK6、CDKN2B、CDT1、CEBPD、CKS1B、CSF1、EIF4E、EPHB2、ERBB3、FASN、FGFBP1、FGFR4、FH、GMNN、IGFBP、IL8、ITGA6、JUN、JUNB、LHFP、MCAM、MET、MVP、MXI1、MYBL1、MYBL2、NRAS、P8、PDCD4、PLK1、PRKCA、RASSF2、SIVA、SKP2、SMAD4、TACC3、TFDP1、TGFBR3、TNFSF10和/或VIM中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个或全部，它们进行各种组合和排列。在某些实施方案中，受调节或选定进行调节的基因来自表2。在另外的实施方案中，受调节或选定进行调节的基因来自表3。在仍然进一步的实施方案中，受调节或选定进行调节的基因来自表4。在某些实施方案中，受调节或选定进行调节的基因来自表5。在另外的实施方案中，受调节或选定进行调节的基因来自表6。在仍然进一步的实施方案中，受调节或选定进行调节的基因来自表7。在某些实施方案中，受调节或选定进行调节的基因来自表8。本发明的实施方案还可包括在选定治疗模式例如给予let-7核酸、let-7的抑制剂或它们的模拟物之前，获得或评估靶标细胞的基因表达谱(profile)或miRNA谱。与登录号(accession number)或数据库提交(databasesubmission)所标示的所有核酸和基因有关的数据库内容，自本申请的提交日起通过引用并入本文。在本发明的某些方面，一个或多个miRNA或miRNA抑制剂可调节单个基因。在又一个方面，一个或多个遗传途径、细胞途径或生理途径中的一个或多个基因可被一个或多个miRNA或其互补序列，包括let-7核酸和let-7抑制剂与其他miRNA组合在一起进行调节。
在仍然进一步的方面，let-7核酸包含hsa-let-7a-1、hsa-let-7a-2、hsa-let-7a-3、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f-1、hsa-let-7f-2、hsa-let-7g、hsa-let-7i中的至少一个或者它们的片段。细胞、组织或受治疗者可以是癌细胞，癌组织或者隐匿癌组织，或者可以是癌症患者。在一个具体的方面，癌症是血癌、白血病、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、皮肤癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、唾液腺癌、小肠癌、甲状腺癌、肺癌或肝癌。
let-7核酸还可包括各种异源核苷酸序列，即那些通常发现在自然界中不与let-7可操作地连接的序列，如启动子、增强子等。let-7核酸是重组核酸，且可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸。重组核酸可包含let-7表达盒。在一个另外的方面，表达盒包含在病毒载体或质粒DNA载体或其他治疗性核酸载体或递送运载体中，所述递送运载体包括脂质体等。在一个具体的方面，let-7核酸是合成核酸。
本发明的另外一个实施方案涉及调节细胞途径的方法，所述方法包括给予该细胞一定量的包含let-7核酸序列的分离核酸，所述let-7核酸序列的量足以调节如下途径的表达、功能、状况(status)或状态(state)表13所述的细胞途径，或者已知包括一个或多个在本文中确定为受let-7调节的基因的途径。对细胞途径的调节包括但不限于调节表2、3、4、5、6、7和8中所示的一个或多个基因的表达。对基因的调节可包括抑制内源miRNA的功能或者给细胞、组织或受治疗者提供功能性miRNA。调节是指基因或其相关基因产物或蛋白质的表达水平或活性，例如mRNA水平，可被调节，或者mRNA的翻译可被调节等等。调节可增加或上调基因或基因产物，或者它可减少或下调基因或基因产物。
另外进一步的实施方案包括治疗有病理状况的患者的方法，所述方法包括以下的一个或多个步骤(a)给予该患者足以调节细胞途径表达的量的包含let-7核酸序列的分离核酸；和(b)给予第二疗法，其中对细胞途径的调节使得该患者对第二疗法敏感。细胞途径可包括但不限于本文各表中描述的一个或多个途径，或者已知包括各表中列举的一个或多个基因的途径。第二疗法可包括给予第二miRNA或治疗性核酸，或者可包括各种标准的疗法，如化学疗法、放射疗法、药物治疗、免疫疗法等。本发明的实施方案还可包括测定或评估基因表达谱以选择适当的疗法。
本发明的实施方案包括治疗有病理状况的受治疗者的方法，所述方法包括以下的一个或多个步骤(a)测定选自表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个基因的表达谱；(b)根据表达谱评估该受治疗者对疗法的敏感性；(c)根据评估的敏感性选择疗法；和(d)用选定的疗法治疗该受治疗者。通常，病理状况会具有表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个基因的误调节作为成分、指标或结果。
进一步的实施方案包括对指示细胞或组织中的let-7状况的表达谱进行鉴定和评估，包括对表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个基因或者它们的任何组合的表达评估。
术语“miRNA”按其通常和平常的含义使用，指在真核生物中发现的参与基于RNA的基因调节的微小RNA分子。参见例如Carrington等人，2003，该文献通过引用并入本文。该术语可用来指从前体加工而成的单链RNA分子，或者在某些情况中指前体本身。
在一些实施方案中，知道细胞是否内源表达特定的miRNA，或者这种表达在特定的条件下是否受影响或何时它处在特定的疾病状态是有用的。因此，在本发明的一些实施方案中，各方法包括测定细胞或含细胞的样品中是否存在一个或多个标记基因，或者mRNA，或者其他指示目的基因表达水平的分析物。因此，在一些实施方案中，各方法包括产生样品的RNA谱的步骤。术语“RNA谱”或“基因表达谱”指关于样品中一个或多个基因或遗传标记的表达模式的一组数据(例如鉴定表2的一个或多个标记的多个核酸探针)；考虑到核酸谱可用例如本领域普通技术人员熟知的核酸扩增或杂交技术，用一组RNA来获得。患者样品的表达谱与参考表达谱如正常样品或非病理样品的表达谱之间的差异，指示着病理状况、疾病状况或癌状况。包含或鉴定相应mRNA的某片段的核酸或探针组，可包括表2、3、4、5、6、7和8中列举的或者通过本文所述方法确定的基因或遗传标记或者代表它们的核酸、mRNA或探针的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、100、200、500个或更多个核苷酸的全部或部分，包括这些数字之间可得出的任何整数或范围。
本发明的某些实施方案涉及用以评估、预后或治疗患者的病理状况的组合物和方法，所述方法包括测量或测定患者样品中的一个或多个标记的表达谱，其中患者样品的表达谱与正常样品的表达谱或参考表达谱之间的差异指示着病理状况特别是例如癌症。在本发明的某些方面，细胞途径、基因或遗传标记是或者代表着表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和/或13中描述的一个或多个途径或标记，包括它们的任何组合。
本发明的各方面包括诊断、评估或治疗病理状况，或者防止病理状况显现。例如，各方法可用来筛选病理状况；评估病理状况的预后；对病理状况分级；评估病理状况对疗法的反应；或者作为第一疗法用来调节某基因、某些基因或相关途径的表达，或用来使受治疗者对第二疗法敏感或更具反应性。在具体的各方面，评估患者的病理状况可以是评估患者的预后。预后可包括但不限于估计存活时间或预期存活时间，评估对某疗法的反应，等等。在某些方面，一个或多个基因或标记的表达的改变预兆着患者有病理状况，其中所述标记是表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和/或13的一个或多个标记，包括它们的任何组合。
本发明的又一个实施方案涉及调节细胞途径的方法，所述方法包括给予该细胞一定量的包含let-7核酸序列或let-7抑制剂的分离核酸。细胞、组织或受治疗者可以是癌细胞，可以是癌组织或隐匿癌组织，或者可以是癌症患者。与通过登录号或数据库提交所标示的所有核酸和基因有关的数据库内容，自本申请的提交日起通过引用并入本文。
本发明的又一个实施方案涉及调节细胞途径的方法，所述方法包括给予该细胞一定量的包含let-7核酸序列的分离核酸，所述let-7核酸序列的量足以调节细胞途径特别是表2、3、4、5、6、7和8中描述的那些途径，或者已知包括表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个基因的途径的表达、功能、状况或状态。对细胞途径的调节包括但不限于调节一个或多个基因的表达。对基因的调节可包括抑制内源miRNA的功能，或者给细胞、组织或受治疗者提供功能性miRNA。调节是指基因或其相关基因产物(例如mRNA)或蛋白质的表达水平或活性，例如mRNA水平，可进行调节，或者mRNA的翻译可进行调节。调节可增加或上调基因或基因产物，或者它可减少或下调基因或基因产物(例如蛋白质水平或活性)。
仍然进一步实施方案包括给予miRNA或其模拟物，和/或治疗患有、怀疑患有病理状况或有发展病理状况的危险的受治疗者或患者的方法，所述方法包括以下一个或多个步骤(a)给予患者或受治疗者一定量的足以调节细胞途径表达的包含let-7核酸序列或let-7抑制剂的分离核酸；和(b)给予第二疗法，其中对细胞途径的调节使得该患者或受治疗者敏感或者提高第二疗法的功效。功效的提高可包括毒性的降低，第二疗法的剂量或持续时间的降低，或者加和作用(additive effect)或协同作用(synergistic effect)。细胞途径可包括但不限于下表2、3、4、5、6、7和8中描述的一个或多个途径，或者已知包括表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个基因的途径。第二疗法可在给予分离核酸或miRNA或抑制剂之前、过程中和/或之后给予。
第二疗法可包括给予第二miRNA或治疗性核酸，如siRNA或反义寡核苷酸，或者可包括各种标准的疗法，如药物、化学疗法、放射疗法、药物治疗(drugtherapy)、免疫疗法等。本发明的实施方案还可包括测定或评估基因表达或基因表达谱以选择适当的疗法。在一个具体的方面，第二疗法是化学疗法。化学疗法可包括但不限于紫杉醇(paclitaxel)、顺铂、卡铂、阿霉素、奥沙利铂、larotaxel、紫衫酚(taxol)、拉帕替尼(lapatinib)、多西他赛、甲氨喋呤、卡培他滨、长春瑞滨、环磷酰胺、吉西他滨、氨柔比星、阿糖胞苷、依托泊苷、喜树碱、地塞米松、达沙替尼(dasatinib)、替吡法尼(tipifarnib)、贝伐单抗、西罗莫司、西罗莫司脂化物(temsirolimus)、依维莫司、洛那法尼(lonafarnib)、西妥昔单抗、埃洛替尼(erlotinib)、吉非替尼、甲磺酸伊马替尼、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、诺考达唑、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、硼替佐米、阿仑单抗、吉妥单抗、托西莫单抗或替伊莫单抗(ibritumomab)。
本发明的实施方案包括治疗有疾病或病况的受治疗者的方法，所述方法包括以下的一个或多个步骤(a)测定一个或多个选自表2、3、4、5、6、7和8的基因的表达谱；(b)根据表达谱评估该受治疗者对疗法的敏感性；(c)根据评估的敏感性选择疗法；和(d)用选定的疗法治疗该受治疗者。通常，疾病或病况会具有表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个基因的误调节作为成分、指标或结果。
在某些方面，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个miRNA可依次使用或组合使用。例如，let-7或let-7抑制剂与另一miRNA的任何组合。进一步的多个实施方案包括鉴定和评估指示细胞或组织中的let-7状况的表达谱，包括对表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个基因或者它们的任何组合的表达评估。
术语“miRNA”按其通常和平常的含义使用，指在真核生物中发现的参与基于RNA的基因调节的微小RNA分子。参见例如Carrington等人，2003，该文献通过引用并入本文。该术语可用来指从前体加工而成的单链RNA分子，或者在某些情况中指前体本身。
在一些实施方案中，知道细胞是否内源表达特定的miRNA，或者这种表达在特定的条件下是否受影响或何时它处在特定的疾病状态是有用的。因此，在本发明的一些实施方案中，各方法包括测定细胞或含细胞的样品中是否存在一个或多个标记基因或mRNA，或其他指示目的基因表达水平的分析物。因此，在一些实施方案中，各方法包括产生样品的RNA谱的步骤。术语“RNA谱”或“基因表达谱”指关于样品中一个或多个基因或遗传标记或miRNA的表达模式的一组数据(例如鉴定表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个标记的多个核酸探针)；考虑到核酸谱可用例如本领域普通技术人员熟知的核酸扩增或杂交技术，用一组RNA来获得。患者样品的表达谱与参考表达谱如一个或多个基因或miRNA的表达谱之间的差异，指示着要给予哪些miRNA。
在某些方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-10或miR-10抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、慢性淋巴母细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、纤维肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、肺癌、平滑肌瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、肾细胞癌、头部和颈部的鳞状细胞癌、甲状腺癌、T细胞白血病。
在又另一个方面，可将let-7或let-7抑制剂和miR-15或miR-15抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、头颈癌、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、喉癌、黑素瘤、髓母细胞瘤、黏液纤维肉瘤、髓性白血病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌。
进一步的方面包括将let-7或let-7抑制剂和miR-16或miR-16抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤、胃癌、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、髓母细胞瘤、黏液纤维肉瘤、髓性白血病、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌。
在仍然进一步的方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-20或miR-20抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、脂肪瘤、黑素瘤、黏液纤维肉瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌、尿路上皮癌。
在某些方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-21或miR-21抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、膀胱癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、黑素瘤、髓性白血病、成神经细胞瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌。
本发明的各方面包括其中将let-7或let-7抑制剂和miR-26或miR-26抑制剂给予患有以下疾病的患者的方法急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、膀胱癌、子宫颈癌、头颈癌、慢性淋巴母细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、卡波济氏肉瘤、白血病、肺癌、平滑肌肉瘤、喉癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤。
在仍然进一步的方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-34或miR-34抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、头颈癌、慢性淋巴母细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、胃泌素瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、卡波济氏肉瘤、白血病、肺癌、平滑肌肉瘤、黑素瘤、髓母细胞瘤、髓性白血病、多发性骨髓瘤、间皮瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、口咽癌、骨肉瘤、胰腺癌、乳头状癌、前列腺癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、唾液腺肿瘤、散发性乳头状肾癌、甲状腺癌、尿路上皮癌。
在另外进一步的方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-124或miR-124抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、膀胱癌、子宫颈癌、头颈癌、慢性淋巴母细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、卡波济氏肉瘤、白血病、肺癌、脂肪瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤、髓母细胞瘤、黏液纤维肉瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、口咽癌、骨肉瘤、胰腺癌、乳头状癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、唾液腺肿瘤、甲状腺癌、尿路上皮癌。
在又另外的方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-126或miR-126抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、膀胱癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、胃泌素瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、肺癌、黑素瘤、髓性白血病、间皮瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、口咽癌、骨肉瘤、胰腺癌、乳头状癌、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、散发性乳头状肾癌、甲状腺癌。
在又另外的方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-143或miR-143抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、慢性淋巴母细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、肺癌、黑素瘤、髓母细胞瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌。
在一个另外的方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-147或miR-147抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、脂肪瘤、黑素瘤、黏液纤维肉瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌。
在另外进一步的另外的方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-188或miR-188抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性髓性白血病、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、膀胱癌、子宫颈癌、慢性淋巴母细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、白血病、肺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌。
在又一个方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-200或miR-200抑制剂给予患有以下疾病的患者乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴母细胞白血病、结肠直肠癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、白血病、肺癌、脂肪瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌。
在还另一个方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-215或miR-215抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、慢性淋巴母细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、胃泌素瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、卡波济氏肉瘤、白血病、肺癌、脂肪瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤、黏液纤维肉瘤、髓性白血病、多发性骨髓瘤、间皮瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、唾液腺肿瘤、甲状腺癌、尿路上皮癌。
在仍然进一步方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-216或miR-216抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、乳腺癌、子宫颈癌、头颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、白血病、肺癌、髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、前列腺癌、头颈鳞状细胞癌。
在其他的方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-292-3p或miR-292-3p抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、纤维肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、肝母细胞瘤、肝细胞癌、卡波济氏肉瘤、白血病、肺癌、脂肪瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤、黏液纤维肉瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、甲状腺癌、尿路上皮癌。
在某些方面，将let-7或let-7抑制剂和miR-331或miR-331抑制剂给予患有以下疾病的患者星细胞瘤、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、血管肉瘤、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、头颈癌、慢性淋巴母细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、胃泌素瘤、肝细胞癌、卡波济氏肉瘤、白血病、肺癌、平滑肌肉瘤、喉癌、黑素瘤、黏液纤维肉瘤、髓性白血病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、食道癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、头颈鳞状细胞癌、散发性乳头状肾癌、甲状腺癌。
考虑到，当let-7或a let-7抑制剂与一个或多个其他的miRNA分子组合给予时，两个不同的miRNA或抑制剂可以同时给予或依次给予。在一些实施方案中，用一个miRNA或抑制剂进行治疗，接着在该治疗后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时，1、2、3、4、5、6、7天，1、2、3、4、5星期或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或任何这些时间组合，用另一个miRNA或抑制剂进行治疗。
进一步的多个实施方案包括对指示细胞或组织中的let-7状况的表达谱进行鉴定和评估，包括对表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个基因或者它们的任何组合的表达评估。
术语“miRNA”按其通常和平常的含义使用，指在真核生物中发现的参与基于RNA的基因调节的微小RNA分子。参见例如Carrington等人，2003，该文献通过引用并入本文。该术语可用来指从前体加工而成的单链RNA分子，或者在某些情况中指前体本身。
在一些实施方案中，知道细胞是否内源表达特定的miRNA，或者这种表达在特定的条件下是否受影响或何时它处在特定的疾病状态是有用的。因此，在本发明的一些实施方案中，各方法包括测定细胞或含细胞的样品中是否存在一个或多个miRNA标记基因或mRNA，或其他指示目的基因表达水平的分析物。因此，在一些实施方案中，各方法包括产生样品的RNA谱的步骤。术语“RNA谱”或“基因表达谱”指关于样品中一个或多个基因或遗传标记的表达模式的一组数据(例如鉴定表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个标记或基因的多个核酸探针)；考虑到核酸谱可用例如本领域普通技术人员熟知的核酸扩增或杂交技术，用一组RNA来获得。患者样品的表达谱与参考表达谱如正常样品或非病理样品的表达谱或者数字化参照(digitized reference)之间的差异，指示着病理状况、疾病状况或癌状况。在某些方面，表达谱是发展这种状况的倾向或可能性(即疾病或病症的危险因素)的指标。这种危险或倾向可表示需要治疗、加强监测、预防措施等。核酸或探针组可包含或鉴定相应mRNA的某片段，且可包括表2、3、4、5、6、7和8中列举的或者通过本文所述方法确定的基因或遗传标记或者代表它们的核酸、mRNA或探针的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、100、200、500个或更多个片段的全部或部分，包括这些数字之间可得出的任何整数或范围。
本发明的某些实施方案涉及用以评估、预后或治疗患者的病理状况的组合物和方法，所述方法包括测量或测定患者样品中的一个或多个miRNA或标记的表达谱，其中患者样品的表达谱与正常样品的表达谱或参考表达谱之间的差异指示着病理状况特别是癌症。在本发明的某些方面，miRNA、细胞途径、基因或遗传标记是或者代表着表2、3、4、5、6、7和8中描述的一个或多个途径或标记，包括它们的任何组合。
本发明的各方面包括诊断、评估或治疗病理状况，或者防止病理状况显现。例如，各方法可用来筛选病理状况；评估病理状况的预后；对病理状况分级；评估病理状况对疗法的反应；或者作为第一疗法用来调节某基因、各基因或相关途径的表达，或者用来使受治疗者对第二疗法敏感或更具应答性。在具体的各方面，评估患者的病理状况可以是评估患者的预后。预后可包括但不限于估计存活时间或预期存活时间，评估对某疗法的反应，等等。在某些方面，一个或多个基因或标记的表达的改变预兆着患者有病理状况，其中所述标记是表2、3、4、5、6、7和8的一个或多个标记，包括它们的任何组合。
本发明的某些实施方案包括用扩增测定法、杂交测定法、蛋白质测定法来测定一个或多个标记、基因或者代表它们的核酸的表达，这些中的多种所述测定法是本领域普通技术人员熟知的。在某些方面，扩增测定法可以是定量扩增测定法，如定量RT-PCR或诸如此类方法。在仍然进一步的方面，杂交测定法可包括阵列杂交测定法或溶液杂交测定法。样品的核酸可从该样品进行标记和/或将经标记的核酸与一个或多个核酸探针杂交。核酸、mRNA和/或核酸探针可偶联到载体。这种载体是本领域普通技术人员熟知的，包括但不限于玻璃、塑料、金属或乳胶。在本发明的具体的方面，载体可以是平面的，或者是珠粒(bead)或本领域公知的其他几何形状或构造。蛋白质通常通过免疫印迹法、色谱法或质谱法或者本领域普通技术人员公知的其他方法来测定。
本发明还涉及含有本发明的组合物或用以执行本发明方法的组合物的试剂盒(kit)。在一些实施方案中，试剂盒可用来评估一个或多个标记分子和/或表达一个或多个miRNA。在某些实施方案中，试剂盒含有至少或含有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、100、150、200个或更多个与所要评估的标记或者所要表达或调节的miRNA有关的探针、重组核酸或合成核酸分子，且可包括这些数字当中可得出的任何范围或组合。试剂盒可包含各成分，这些成分可各自单独包装或放置在容器中，如管子、瓶子、小瓶(vial)、注射器或其他合适的容器器具。各个成分还可在试剂盒中以浓缩的量提供；在一些实施方案中，成分以与含有其他成分的溶液中的相同浓度单独提供。各成分的浓度可以作为1x、2x、5x、10x或20x或更高浓度提供。供将本发明的探针、合成核酸、重组核酸或非合成核酸用于治疗应用、预后应用或诊断应用的试剂盒，作为本发明的一部分包括在本发明中。具体考虑到的是任何这样的分子，它们对应于任何据报道会影响一个或多个本文所述标记基因或基因途径的生物活性或表达的miRNA。在某些方面，将阴性对照和/或阳性对照包括在一些试剂盒实施方案中。对照分子可用来验证转染效率和/或监控细胞中由转染引起的变化。
某些实施方案涉及用以通过样品的核酸谱分析(nucleic acid profiling)来评估患者中的病理状况或发展病理状况的危险的试剂盒，所述试剂盒包含在合适的容器器具中的两个或多个核酸杂交或扩增试剂。试剂盒可包含用于标记样品中的核酸的试剂和/或核酸杂交试剂。杂交试剂通常包含杂交探针。扩增试剂包括但不限于扩增引物、试剂和酶。
在本发明的一些实施方案中，表达谱通过包括以下的步骤产生(a)标记样品中的核酸；(b)使核酸与多个探针杂交，或者扩增多个核酸；和(c)测定和/或定量核酸与探针的杂交，或者检测和定量扩增产物，由此产生表达谱。参见美国临时专利申请60/575,743和美国临时专利申请60/649,584及美国专利申请系列号11/141,707和美国专利申请系列号11/273,640，所有这些专利申请都通过引用并入本文。
本发明的方法涉及根据miRNA和/或标记核酸表达谱来诊断和/或评估患者的预后。在某些实施方案中，细胞中某特定基因或遗传途径或一组核酸的表达水平，相比于它们在正常的或非病理的细胞或组织样品中的表达水平，的升高或降低与疾病状态或病理状况相关。当测量所要评估的生物样品中的一个或多个核酸的表达水平，然后与正常的或非病理的细胞或组织样品进行比较时，这个相关性使得诊断方法和/或预后方法得以执行。具体考虑到，患者的表达谱，特别是那些怀疑患有或者倾向于患上特定疾病或病症如癌症的患者的表达谱，可通过评估本申请所述RNA的任何一个或几组miRNA和/或核酸来产生。从患者产生的表达谱将能提供有关特定疾病或病症的信息。在许多实施方案中，表达谱是用核酸杂交或扩增(例如阵列杂交或RT-PCR)来产生。在某些方面，表达谱可与其他的诊断和/或预后检测如组织学、血清中的蛋白质谱和/或细胞遗传分析联用。
本发明的方法还可包括以下一个或多个步骤(a)从患者获得样品；(b)从样品分离核酸，(c)对从样品分离的核酸进行标记，和(d)将经标记的核酸与一个或多个探针杂交。本发明的核酸包括一个或多个包含至少一个这样的片段，所述片段具有代表表2、3、4、5、6、7、8和/或12中的一个或多个基因或标记的核酸的序列或互补序列。
考虑到，本文描述的任何方法或组合物都可与本文描述的任何其他方法或组合物一起来进行，且不同的实施方案可进行组合。具体考虑到，本文讨论的关于miRNA分子、miRNA、基因和代表基因的核酸的任何方法和组合物，都可通过合成核酸来执行。在一些实施方案中，将合成核酸暴露于适当的条件，以让它变成加工的或成熟的核酸，如生理环境下的miRNA。考虑到，最初提交的权利要求包含任何提交的权利要求的多项从属权利要求或提交的权利要求的组合。
还考虑到，本发明任何通过名字涉及的具体基因(包括其代表性片段)、mRNA或miRNA的实施方案，也会覆盖涉及其序列与指定miRNA的成熟序列有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性的miRNA的实施方案。
还要理解到，采用速记符号，使得基因或其标记或者miRNA一般描述指代它的基因家族成员的任何一个(用数字区分)或其代表性片段，除非另有指明。本领域技术人员应该理解的是，“基因家族”指一组具有相同的编码序列或miRNA编码序列的基因。通常，基因家族的各miRNA成员用初始命名后面的数字来识别。例如miR-16-1和miR-16-2是miR-16基因家族的成员，而“mir-7”指miR-7-1、miR-7-2和miR-7-3。此外，除另有指明外，速记符号指的是相关的miRNA(由字母区分)。因此例如“let-7”指的是let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、i等等。这个速记符号的例外情况将另外指明。
表1.诊断和治疗用miRNA一览表 本发明的其他实施方案在本申请中讨论到。任何针对本发明的一个方面讨论的实施方案，也适用于本发明的其他方面，反之亦然。实施例部分和具体实施方式
部分中的实施方案，应理解为适用于本发明所有各方面的本发明的实施方案。
术语“抑制”、“降低”或“防止”或者这些术语的任何近义词，当在权利要求书和/或说明书中使用时，包括旨在达到期望结果的任何可测量的降低或完全的抑制。
在权利要求书和/或说明书中单词单数“一个”与“包含”一起使用时，可指代“一个”，但也可指“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”。
在本申请全文中，术语“约”用来表示某数值包括用来测定该数值的装置或方法的误差的标准偏差。
术语“或”在权利要求书中的使用是用来意指“和/或”，除非明确指出仅仅是指代两选项之一或者说两选项是互相排斥的，不过本公开内容对于指代仅仅两选项之一和“和/或”的定义是支持的。
本说明书和权利要求书中用到的词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包涵式或开放式含义，并不排除另外的未述及的要素或方法步骤。
本发明的其他目标、特征和优点由以下具体实施方式
将变得显而易见。但是应理解到，具体实施方式
和具体的实施例虽然指出了本发明的具体实施方案，但仅仅是以举例说明的方式给出，因为通过该具体实施方式
，各种落入本发明精神和范围内的变化和修改将对本领域技术人员显而易见。



以下附图构成本说明书的一部分，包括这些附图是为了进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图结合本文给出的对各具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。
图1.hsa-let-7处理的细胞相对于阴性对照miRNA处理的细胞(100％)的增殖百分数(％)。缩写let-7b，hsa-let-7b；let-7c，hsa-let-7c；let-7g，hsa-let-7g；siEg5，干扰动力蛋白驱动蛋白11(Eg5)的siRNA；Etopo，依托泊苷；NC，阴性对照miRNA。图中标出了标准偏差。
图2.用Alamar Blue增殖测定法得到的hsa-let-7对各种细胞系的剂量依赖性抑制。细胞增殖以相对于模拟品转染的(mock-transfected)细胞的增殖百分数(0pM＝100％增殖)的增殖百分数报道。图中标出了标准偏差。缩写NC，阴性对照miRNA。
图3.将1×106个H226细胞用1.6μM hsa-let-7b或阴性对照miRNA(NC)进行电穿孔，在标准的生长培养基中生长(第0天)。在第6、10和17天，对细胞进行计数并用1.6μM miRNA反复进行电穿孔(箭头表示)。为提供指数细胞生长，在第10和17天进行miRNA递送后，将总细胞群体的一部分进行再接种。将细胞计数进行外推，描绘到线性刻度(linear scale)上。该图显示一个代表性的实验。
图4.H460肺癌细胞在给予不同组合的微小RNA后的增殖百分数(％)。图中每个柱条下方的正号表示微小RNA存在于所给予的组合中。两个微小RNA的协同活性由柱条下方的字母“S”表示；两个微小RNA的加和活性由柱条下方的字母“A”表示。图中显示标准偏差。缩写Etopo，依托泊苷；NC，阴性对照miRNA。
图5.用hsa-let-7b或用阴性对照(NC)miRNA治疗的、带有A549肺癌细胞异种移植物的小鼠中的平均肿瘤体积。图中显示标准偏差。P值＜0.05的数据点由星号表示。

具体实施例方式 本发明涉及与基因和生物途径的鉴定和表征有关的组合物和方法，所述生物途径与由所指定基因的表达显示与这些基因相关，以及与这些基因和生物途径有关的miRNA用于治疗性、预后性和诊断性应用的用途，本发明特别涉及与评估和/或鉴定与let-7表达或其异常表达直接或间接相关的病理状况有关的那些方法和组合物。
在某些方面，本发明涉及评估、分析和/或治疗这样的细胞或受治疗者的方法，所述细胞或受治疗者中某些基因，因为let-7家族成员(7a-1、7a-2、7a-3、7b、7c、7d、7e、7f-1、7f-2、7g和/或7i)的任何一个或组合的表达提高或降低，其表达减低(相对于正常值)，和/或因为let-7家族成员(7a-1、7a-2、7a-3、7b、7c、7d、7e、7f-1、7f-2、7g和/或7i)的一个或组合的表达提高或降低，其表达提高(相对于正常值)。表达谱和/或对let-7表达的反应或缺乏表达，指示出具有病理状况如癌症的个体。
可用表征所列举的miRNA或所列举的标记(包括代表它们的核酸)的任何一个或组合的预后测定来评估患者，以确定什么治疗方案(如果有的话)是证明合理的。就上述诊断测定来说，定义低表达的绝对值，要取决于用来测量miRNA(一个或多个)的平台。描述的用于诊断测定的方法同样可用于预后测定。
I.治疗方法 本发明的实施方案涉及当被导入到细胞中时，能发挥内源miRNA的活性或者抑制内源miRNA的核酸。在某些方面，核酸是合成的或非合成的miRNA。各种序列特异性的miRNA抑制剂，可用来依次地或组合地抑制细胞中一个或多个内源miRNA的活性，以及受内源miRNA调节的那些基因和相关途径。
在一些实施方案中，本发明涉及在细胞中作为miRNA或作为miRNA的抑制剂起作用的短核酸分子。术语“短”指15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、100或150个核苷酸或更少个核苷酸的单一多核苷酸的长度，包括这些数字之间可得出的所有整数或范围。核酸分子通常是合成的。术语“合成”指经分离的而不是细胞中自然产生的核酸分子。在某些方面，序列(整个序列)和/或化学结构偏离天然核酸分子，如内源前体miRNA或miRNA分子或它们的互补序列。虽然在一些实施方案中，本发明的核酸分子不具有与天然核酸的序列相同或互补的整个序列，但这种分子可涵盖天然序列或其互补序列的全部或部分。然而考虑到，给予细胞的合成核酸分子可随后在细胞中被修饰或改变，使得其结构或序列与非合成的或天然的核酸如成熟miRNA序列相同。例如，合成核酸可具有与前体miRNA的序列不同的序列，但该序列一旦在细胞中可被改变，而与内源的加工的miRNA或其抑制剂相同。术语“(经)分离(的)”指本发明的核酸分子最初从不同类的(就序列或结构而言)和不需要的核酸分子分离，使得分离核酸的群体相对于其他多核苷酸分子而言，具有少约90％同源性，且可以是至少约95、96、97、98、99或100％同源性。在本发明的许多实施方案中，核酸之所以是分离的，是由于它是在体外合成而来，而与细胞中的内源核酸分开。然而应理解到，各分离核酸随后可混合(mix)或集合(pool)在一起。在某些方面，本发明的合成miRNA是RNA或RNA类似物。miRNA抑制剂可以是DNA或RNA或它们的类似物。本发明的miRNA和miRNA抑制剂统称“合成核酸”。
在一些实施方案中，miRNA或合成miRNA其长度在17-130个残基之间。本发明涉及其长度为、至少或至多为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、140、145、150、160、170、180、190、200个或更多个残基的miRNA或合成miRNA分子，包括这些数字之间的任何整数或任何范围。
在某些实施方案中，合成miRNA具有(a)“miRNA区域”，其从5’到3’的序列或结合区域与成熟miRNA序列的全部或某个片段相同或互补，和(b)“互补区域”，其从5’到3’的序列与(a)的miRNA序列具有60％-100％的互补性。在某些实施方案中，这些合成miRNA也如上所述是分离的。术语“miRNA区域”指合成miRNA上的与成熟、天然miRNA序列的整个序列或其互补序列有至少75、80、85、90、95或100％同一性的区域，包括这些数字之间的所有整数。在某些实施方案中，miRNA区域与天然miRNA的序列或其互补序列有或者至少有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％同一性。
术语“互补区域”或“互补序列”指核酸、模拟物或合成miRNA的与成熟、天然miRNA序列有或者至少有60％互补性的区域。互补区域有或者至少有60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％的互补性，或者这些数字当中可得出的任何范围。对于单一多核苷酸序列，可能会因为miRNA区域和互补区域之间的化学键合而存在发夹环结构。在其他的实施方案中，互补区域在不同于miRNA区域的核酸分子上，在这种情况下，互补区域在互补链上，miRNA区域在活性链上。
在本发明的其他实施方案中，有的miRNA抑制剂是合成核酸。miRNA抑制剂其长度在约17-25个核苷酸之间，包含与成熟miRNA的5’-3’序列有至少90％互补性的5’-3’序列。在某些实施方案中，miRNA抑制剂分子其长度为17、18，、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，或者这些数字当中可得出的任何范围。此外，miRNA抑制剂可具有与成熟miRNA特别是成熟、天然miRNA的5’-3’序列有或者至少有70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％互补性的序列(从5’到3’)，或者这些数字当中可得出的任何范围。本领域技术人员可使用与成熟miRNA的序列互补的miRNA序列的部分，作为miRNA抑制剂的序列。此外，核酸或探针序列的该部分可加以改变，但使得它仍包含与成熟miRNA的序列的适当百分比的互补性。
在本发明的一些实施方案中，合成miRNA或抑制剂含有一个或多个设计元件(design element)。这些设计元件包括但不限于(i)互补区域5’末端处的核苷酸的磷酸根或羟基的取代基团；(ii)互补区域的开头或最后1-6个残基中的一个或多个糖修饰；或者(iii)互补区域3’末端处最后1-5个残基中的一个或多个核苷酸与miRNA区域的相应核苷酸之间的非互补性。有多种设计修饰是本领域公知的，见下文。
在某些实施方案中，合成miRNA在其互补区域5’末端处具有这样的核苷酸，该核苷酸中的磷酸根和/或羟基已用另一化学基团取代(称为“取代设计”)。在一些情况中，磷酸根被取代，而在其他情况中，羟基被取代。在具体的实施方案中，取代基团是生物素、胺基、低碳烷基胺、乙酰基、2’O-Me(2’氧甲基)、DMTO(带氧4，4’-二甲氧三苯甲基(4，4’-dimethoxytrityl with oxygen))、荧光素、硫醇或吖啶，不过其他的取代基团也是本领域技术人员熟知的，也可使用。这些设计元件还可用在miRNA抑制剂上。
另外的实施方案涉及在互补区域的开头或最后1-6个残基中具有一个或多个糖修饰的合成miRNA(称为“糖取代设计”)。在某些情况中，在互补区域的开头1、2、3、4、5、6个或更多个残基中，或者这些数字当中可得出的任何范围有一个或多个糖修饰。在另外的情况中，在互补区域的最后1、2、3、4、5、6个或更多个残基中，或者这些数字当中可得出的任何范围有一个或多个糖修饰。应理解到，术语“开头”和“最后”是相对于该区域的从5’末端到3’末端的残基的顺序而言。在具体的实施方案中，糖修饰是与6’位的碳连接的羧基上的2’O-Me修饰、2’F修饰、2’H修饰、2’氨基修饰、4’硫代核糖修饰或硫代磷酸酯修饰。在另外的实施方案中，在互补区域的开头或最后2-4个残基中，或者在互补区域的开头或最后4-6个残基中，有一个或多个糖修饰，这些设计元件还可用在miRNA抑制剂上。因此，miRNA抑制剂可如上所述在5’末端处的核苷酸上具有这个设计元件和/或取代基团。
在本发明的其他实施方案中有这样的合成miRNA或抑制剂，其中互补区域3’末端处最后1-5个残基中的一个或多个核苷酸不与miRNA区域的相应核苷酸互补(“非互补性”)(称为“非互补性设计”)。非互补性可在互补miRNA的最后1、2、3、4和/或5个残基中。在某些实施方案中，在互补区域中存在至少2个核苷酸的非互补性。
考虑到，本发明的合成miRNA具有一个或多个取代设计、糖修饰设计或非互补性设计。在某些情况中，合成RNA分子具有这三种设计中的两种，而在其他情况中，这些分子适当地具有所有这三种设计。
miRNA区域和互补区域可以在同一多核苷酸上，或者在分别的多核苷酸上。在它们被包含在同一多核苷酸之上或之中的情况中，miRNA分子将被认为是单一多核苷酸。在不同的区域处在分别的多核苷酸上的实施方案中，合成miRNA将被认为是由两个多核苷酸组成。
当RNA分子是单一多核苷酸时，在miRNA区域和互补区域之间可以有接头区域。在一些实施方案中，单一多核苷酸因为miRNA区域和互补区域之间的键合，能够形成发夹环结构。接头构成发夹环。考虑到在一些实施方案中，接头区域其长度是、是至少或者是至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个残基，或者这些数字当中可得出的任何范围。在某些实施方案中，接头的长度在3-30个残基之间(包括3个和30个)。
除了具有miRNA或抑制剂区域和互补区域外，在区域的5’末端或3’末端处还可具有侧翼序列。在一些实施方案中，在这些区域的一侧或两侧侧接有或者至少侧接有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸，或者这些数字当中可得出的任何范围。
本发明的方法包括减少或消除细胞中的一个或多个miRNA的活性，所述方法包括向细胞中导入miRNA抑制剂(在本文中可统称为miRNA，因此有关miRNA的描述在适当的情况中也将指miRNA抑制剂)；或者补充或增强细胞中一个或多个miRNA的活性。本发明还涉及通过给细胞提供特定的核酸，如特定的合成miRNA分子或合成miRNA抑制剂分子，来诱导某些细胞特性。但是，在本发明的方法中，miRNA分子或miRNA抑制剂不必需是合成的。它们可具有与天然miRNA相同的序列，或者它们可不具有任何设计修饰。在某些实施方案中，miRNA分子和/或miRNA抑制剂如上所述是合成的。
给细胞提供的特定核酸分子应理解为对应于细胞中的特定miRNA，因此细胞中的miRNA称为“相应miRNA”。在指定的miRNA分子被导入到细胞中的情况中，相应miRNA应理解为被诱导或被抑制的miRNA或者被诱导或被抑制的miRNA功能。然而考虑到，被导入到细胞中的miRNA分子不是成熟miRNA，但能够在适当的生理条件下变成成熟miRNA，或者起到成熟miRNA的作用。在特定的相应miRNA被miRNA抑制剂抑制的情况中，特定的miRNA将被称为“被靶向的miRNA”。考虑到可能有多个相应miRNA被涉及到。在具体的实施方案中，超过一个miRNA分子被导入到细胞中。此外，在其他实施方案中，超过一个miRNA抑制剂被导入到细胞中。此外，可将miRNA分子(一种或多种)和miRNA抑制剂(一种或多种)的组合导入到细胞中。本发明人考虑到，miRNA的组合可在表型异常的细胞的各细胞途径中的一个或多个位置处起作用，且这种组合可对靶细胞增加功效，而又不会不利地影响正常细胞。因此，miRNA的组合可对受治疗者或患者具有最小的不利影响，同时又能提供足够的治疗作用，如病症的改善、细胞的生长抑制、被靶向的细胞的死亡、细胞表型或生理的改变、细胞生长的减慢、对第二疗法的敏感化、对特定疗法的敏感化等等。
本发明方法包括鉴定有需要诱导这些细胞特性的细胞或患者。同样要理解到，提供给细胞或生物的合成核酸的量是“有效量”，这个有效量是指为达到期望的目标如诱导特定的细胞特性所需要的量(或者足够的量)。
本发明方法的某些实施方案包括将对应于细胞中的成熟miRNA的核酸分子，以能有效达到期望的生理结果的量提供给或导入到细胞。
此外，本发明方法可涉及提供合成的或非合成的miRNA分子。考虑到在这些实施方案中，本发明方法可限于或不限于提供仅仅一个或多个合成miRNA分子或者仅仅一个或多个非合成miRNA分子。因此在某些实施方案中，本发明方法可涉及同时提供合成的和非合成的miRNA分子。在这个情况中，一个或多个细胞很可能被提供对应于特定miRNA的合成miRNA分子和对应于另一不同miRNA的非合成miRNA分子。此外，任何采用马库什群语言(Markush grouplanguage)用一系列miRNA来描述的方法，也可不用马库什群语言而是用离散性的词(disjunctive article)(即“或”)来描述，反之亦然。
在一些实施方案中，有减少或抑制细胞增殖的方法，所述方法包括向细胞导入或提供有效量的(i)miRNA抑制剂分子或(ii)对应于miRNA序列的合成或非合成miRNA分子。在某些实施方案中，所述方法涉及向细胞中导入有效量的(i)具有与一个或多个成熟miRNA的5’-3’序列有至少90％互补性的5’-3’序列的miRNA抑制剂分子。
本发明的某些实施方案包括治疗病理状况特别是癌症例如肺癌或肝癌的方法。在一个方面，所述方法包括使靶标细胞与一个或多个包含至少一个具有miRNA序列的全部或一部分的核酸片段的核酸、合成miRNA或者miRNA相接触。该片段可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸或核苷酸类似物，包括这些数字之间的所有整数。本发明的一个方面包括调节靶标细胞如癌细胞当中的基因表达、miRNA表达或功能或者mRNA表达或功能。
通常，在细胞中调节内源基因、miRNA或mRNA。在具体的实施方案中，核酸序列包含至少一个在核酸序列上与一个或多个miRNA或基因序列有至少70、75、80、85、90、95或100％同一性的片段。对内源基因、miRNA或mRNA的表达或加工的调节，可通过对mRNA的加工的调节来进行，所述加工包括在细胞中的转录、运输和/或翻译。调节还可通过抑制或增强细胞、组织或器官中的miRNA活性来实现。所述加工可影响被编码产物的表达或mRNA的稳定性。在其他的实施方案中，核酸序列可包含经修饰的核酸序列。在某些方面，一个或多个miRNA序列可包括或包含经修饰的核碱基或核酸序列。
应理解到，在本发明的方法中，可通过将一旦在细胞内就能起到相应miRNA的作用的核酸分子，给予细胞或生物体，，来给该细胞或其他生物物质(biologicalmatter)如生物体(包括患者)提供对应于特定miRNA的miRNA或miRNA分子。提供给细胞的分子的形式可以不是一旦在细胞内就能充当miRNA的形式。因此考虑到在一些实施方案中，提供的合成miRNA或非合成miRNA是，如一旦进入到细胞的miRNA加工机器(processing machinery)就会被加工成成熟有活性miRNA的合成miRNA或非合成miRNA。在某些实施方案中特别考虑到，提供给生物物质的miRNA分子不是成熟的miRNA分子，而是一旦进入到miRNA加工机器就会被加工成成熟miRNA的核酸分子。术语“非合成(的)”在miRNA的情形中是指miRNA不是如本文所定义的“合成(的)”。此外还考虑到，在本发明的涉及使用合成miRNA的实施方案中，相应的非合成miRNA的使用也被认为是本发明的一个方面，反之亦然。应理解到，“提供”某药剂这个术语是用来包括将该药剂“给予”患者。
在某些实施方案中，本发明方法还包括在细胞或生物体中靶向要调节的miRNA。术语“靶向要调节的miRNA”意思是要用本发明的核酸来调节选定的miRNA。在一些实施方案中，调节是用对应于被靶向的miRNA的合成或非合成miRNA来实现，该合成或非合成miRNA能有效地将被靶向的miRNA提供到细胞或生物体(正调节)。在其他实施方案中，调节是用miRNA抑制剂来实现，该抑制剂能有效抑制细胞或生物体中的被靶向miRNA(负调节)。
在一些实施方案中，被靶向以进行调节的miRNA是能影响疾病、病症或途径的miRNA。在某些实施方案中，对miRNA进行靶向是因为可通过对被靶向miRNA的负调节来提供治疗。在其他实施方案中，对miRNA进行靶向是因为可通过对被靶向miRNA或其靶标的正调节来提供治疗。
在本发明的某些方法中，还有将选定的miRNA调节物给予这样的细胞、组织、器官或生物体(统称“生物物质”)的步骤，所述生物物质需要涉及对被靶向miRNA进行调节的治疗，或者需要本文所讨论的生理或生物结果(例如就特定细胞途径或结果而言，如细胞活力的下降)。因此，在本发明的一些实施方案中，有对需要可通过miRNA调节物提供的治疗的患者进行鉴定的一个步骤。考虑到在一些实施方案中可给予有效量的miRNA调节物。在具体的实施方案中，生物物质获得治疗益处，其中“治疗益处”是指一个或多个与疾病或病症有关的情况或症状的改善，或者与该疾病有关的预后、持续时间或状态的改善。考虑到，治疗益处包括但不限于疼痛的减少、发病率的降低和症状的减轻。例如就癌症而言考虑到，治疗益处可以是肿瘤生长的抑制、阻止转移、转移数量的减少、癌细胞增殖的抑制、癌细胞中细胞死亡的诱导、癌细胞附近的血管发生的抑制、癌细胞凋亡的诱导、疼痛的减轻、复发的危险的降低、癌细胞中化学敏感性或辐射敏感性的诱导、生命的延长和/或与癌症直接或间接有关的死亡的延迟。
而且还考虑到，可将miRNA组合物作为疗法的一部分，与传统疗法或预防药剂一起给予患者。此外还考虑到，在疗法的情形中讨论到的任何方法可作为预防方法应用，特别是在经鉴定潜在需要该疗法或者有发展需要治疗的病症或疾病的危险的患者中。
另外，本发明的方法涉及采用一个或多个对应于miRNA的核酸和治疗药物。该核酸可增强该药物的作用或功效，减少任何副作用或毒性、改变它的生物利用度和/或降低所需的剂量或用药频率。在某些实施方案中，该治疗药物是癌症治疗药。因此，在一些实施方案中有治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括给予该患者癌症治疗药和有效量的至少一个能改进癌症治疗药的功效或者保护非癌细胞的miRNA分子。癌症疗法还包括多个与基于化学的治疗和基于放射的治疗组合的疗法。组合化学疗法包括但不限于例如5-氟尿嘧啶、阿仑单抗、氨柔比星、贝伐单抗、博来霉素、硼替佐米、白消安、喜树碱、卡培他滨、顺铂(CDDP)、卡铂、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、EGFR抑制剂(吉非替尼和西妥昔单抗)、丙卡巴肼、氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺、喜树碱、COX-2抑制剂(例如塞来考昔)、环磷酰胺、阿糖胞苷)、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲(nitrosurea)、放线菌素、达沙替尼(dasatinib)、柔红霉素、地塞米松、多西他赛、阿霉素、EGFR抑制剂(吉非替尼和西妥昔单抗)、埃洛替尼、雌激素受体结合剂、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、依维莫司、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫衫酚(taxol)、多烯紫杉醇、吉西他滨、诺维本、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、替伊莫单抗、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、larotaxel、拉帕替尼(lapatinib)、洛那法尼、氮芥、美法仑、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨喋呤、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲(nitrosurea)、诺考达唑、奥沙利铂、紫杉醇(paclitaxel)、plicomycin、丙卡巴肼、雷洛昔芬、利妥昔单抗、西罗莫司、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、他莫昔芬、紫衫酚(taxol)、多烯紫杉醇、西罗莫司脂化物、替吡法尼、托西莫单抗、反铂、曲妥珠单抗、长春碱、长春新碱或长春瑞滨，或者前述药剂的任何类似物或衍生变体。
通常，可给予miRNA的抑制剂以降低内源miRNA的活性。例如，可将能增加细胞增殖的miRNA分子的抑制剂提供给细胞以增加增殖，或者可将这种分子的抑制剂提供给细胞以降低细胞增殖。本发明涵盖在用本文所公开的不同miRNA分子和miRNA抑制剂所观察到的不同生理作用情形下的这些实施方案。这些包括但不限于以下生理作用增加或减少细胞增殖、增加或减少细胞凋亡、增加转化、增加或减少细胞活力、激活或抑制激酶(例如Erk)ERK、激活/诱导或抑制hTert，抑制对促生长途径(例如Stat 3信号转导)的刺激，减少或增加活细胞数目和增加或减少细胞周期特定阶段的细胞数目。本发明的方法一般考虑到包括提供或导入一个或多个对应于一个或多个不同的miRNA分子的不同核酸分子。考虑到可提供或导入以下、至少以下或者至多以下数目的不同核酸或miRNA分子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100，或者这些数字当中可得出的任何范围。这也适用于可提供或导入到细胞中的不同miRNA分子的数目。
II.药物制剂和递送 本发明的方法包括递送有效量的miRNA或编码它的表达构建物。药物组合物的“有效量”通常定义为足以可检测地和重复性地实现规定的期望结果的量，例如足以改善、减少、最小化或限制疾病或其症状的程度的量。其他更为严格的定义也适用，包括疾病的消除、根除或治愈。
A.给药 在某些实施方案中，期望能杀死细胞，抑制细胞生长，抑制转移，减少肿瘤或组织大小，和/或逆转或减少细胞的恶性或疾病表型。给药途径当然要随所要靶向的病灶或部位的位置和性质而变，包括例如真皮内、皮下、区域(regional)、胃肠外、静脉内、肌肉内、鼻内、全身(systemic)和口服给予和制剂。对于分散的、实体易接近的肿瘤或者其他易接近的靶区域，特地考虑到直接注射、肿瘤内注射或者向肿瘤脉管系统中的注射。局部的、区域的或全身的给药也可以是适当的。对于＞4cm的肿瘤，所要给予的体积将为约4-10ml(优选10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，将使用约1-3ml(优选3ml)的体积。
作为单剂量递送的多次注射包含约0.1全约0.5ml体积。本发明的组合物可以以多次注射给予肿瘤或被靶向的位点。在某些方面，各次注释可间隔大约1em的距离。
在外科手术介入的情况中，本发明可在手术前使用，以使不宜动手术的肿瘤被切除。或者，本发明可在手术时和/或手术之后使用，以治疗残余疾病或转移性疾病。例如，可给切除后的瘤床注射或输注包含miRNA或其组合的制剂。可例如通过将导管植入在手术部位，在切除术后继续进行给药。也预想到定期进行的手术后治疗。还考虑到连续输注表达构建物或病毒构建物。
在适当的情况中，例如在肿瘤或其他不期望的受影响区域被切除和瘤床或被靶向的部位被治疗以消除残余的微小疾病(residual，microscopic disease)的情况中，连续给药也可适用。考虑到通过注射器或导管插入术进行的递送。这种连续输注可在治疗开始后进行约1-2小时、到约2-6小时、到约6-12小时、到约12-24小时、到约1-2天、到约1-2个星期的时间或更长的时间。通常，通过连续输注给予的治疗组合物的剂量，要相当于单次或多次注射所给予的剂量，其在进行输注期间会随时间调整。
治疗方案也可变化，往往取决于肿瘤类型、肿瘤位置、免疫状况、靶标部位、疾病进展及患者的健康和年龄。某些肿瘤类型会要求更为积极的治疗。临床医师最适合根据治疗制剂的已知功效和毒性(如果有的话)，来做出这种决定。
在某些实施方案中，被治疗的肿瘤或患病区域可能不是最初可能不是可切除的。用本发明组合物进行的治疗，因为肿瘤边缘处的收缩或者通过消除特别具有侵入性的部分，可增加肿瘤的可切除性。治疗后，切除变得可能。在切除术后进行的额外治疗可有助于消除肿瘤或被靶向部位处的微小残余疾病。
治疗可包括多个“单位剂量”。单位剂量定义为含有预定量的治疗组合物。所要给予的数量及具体的途径和剂型，是临床领域技术人员技能范围内的事情。单位剂量不需要作为单次注射来给予，而是可包括在规定时间内进行的连续输注。就本发明的病毒成分而言，单位剂量可适宜用μg或mg miRNA或miRNA模拟物来描述。或者，所指定的量可以是作为平均日剂量、平均周剂量或平均月剂量来给予的量。
miRNA可以以约或者至少约0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000μg或mg的剂量，或者更高的剂量，或者这些数字当中可得出的任何范围的剂量，来给予患者。或者，所指定的量可以是作为平均日剂量、平均周剂量或平均月剂量来给予的量，或者它可以用mg/kg来表示，其中kg指患者的体重，mg如上所指定。在其他的实施方案中，所指定的量是以上所述的任何数字，但以mg/m2(关于肿瘤大小或患者表面积)表示。
B.可注射组合物和制剂 在一些实施方案中，据以递送miRNA或编码其的表达构建物或它们的组合的方法，是通过全身给药来进行。但是，本文公开的药物组合物还可如5,543,158号、5,641,515号和5,399,363号美国专利(每个专利都通过引用其全文并入本文)中所述，进行胃肠外给予、皮下给予、直接给予(directly)、气管内给予、静脉内给予、真皮内给予、肌肉内给予乃至腹膜内给予。
核酸的注射可通过注射器或者任何其他用于注射溶液的方法来递送，只要核酸和任何相关的成分能通过注射所需的特定径号的针头。供用于基因疗法、能够在任何深度精确地多次注射预定量的溶液的注射器系统，也已有描述(5,846,225号美国专利)。
游离碱或药理学上可接受盐的形式的活性化合物的溶液剂，可在水中与表面活性剂如羟丙基纤维素进行适当混合来制备。还可在甘油、液体聚乙二醇、它们的混合物中，和在油类中，制备分散剂。在通常的储存和使用条件下，这些制品含有防腐剂以防止微生物的生长。适合可注射用的药物形式，包括无菌水溶液剂或分散剂，和供临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末(5,466,468号美国专利，通过引用其全文并入本文)。在所有的情况中，该剂型必须是无菌的，且流动性必须达到可容易注射的程度。它必须在制造和储存的条件下稳定，必须免受微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣剂(coating)如卵磷脂，通过在分散剂的情况中维持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，来实现微生物作用的防止。在许多情况下，优选的是包括等渗剂，例如糖类或氯化钠。可通过在该组合物中使用能延迟吸收的物质，如单硬脂酸铝和明胶，来达到可注射组合物的长久吸收。
在某些制剂中应用的是水基制剂，而其他制剂可以是脂基制剂。在本发明的具体实施方案中，包含肿瘤抑制蛋白或编码其的核酸的组合物是水基制剂。在其他的实施方案中，制剂是基于脂质的。
例如对于以水溶液剂进行的胃肠外给予，溶液如有需要应当进行适当缓冲，且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等渗。这些具体的水溶液剂特别适合于静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内、病灶内和腹膜内给予。就此而论，本领域技术人员根据本公开内容，将会知道可以采用的无菌含水介质。例如，可将一个剂量溶解于1ml的等渗NaCl溶液中，然后加入到1000ml的皮下输液用流体中，或者在所计划的输注部位处进行注射(参见例如″Remington′sPharmaceutical Sciences″15th Edition，1035-1038页和1570-1580页)。取决于所治疗的受治疗者的情况，在剂量上必定会出现一些变动。负责给药的人员在任何情况下，都要确定对该受治疗者个体适当的剂量。此外，对于人类给药，制品应当符合FDA生物制剂标准办公室(FDA Office of Biologics standards)关于无菌性、致热性、一般安全性和纯度的标准。
本文所用的“载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质(dispersion media)、运载体(vehicle)、包衣剂、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。这些介质(media)和物剂(agent)用于药物活性物质是本领域公知的。考虑到任何常规介质或物剂都可在治疗组合物中使用，除非它与活性成分不相容。还可向组合物中掺入辅助性活性成分。
词语“药学上可接受的”指当给予人时不会产生过敏性反应或类似的不适当反应的分子实体和组合物。
核酸以与剂型相容的方式给予，和以会在治疗上有效的量给予。所要给予的数量取决于所要治疗的受治疗者，包括例如疾病或癌症的侵袭程度、任何肿瘤或病灶的大小、之前的或其他的治疗进程。要求给予的活性成分的精确量依赖于给药医师的判断。初次给药和随后给药的合适方案也是可变的，但代表性做法是初次给药后进行其他的给药。这种给药可以是全身给药，作为单剂量给药，横跨10、20、30、40、50、60分钟和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或更多小时和/或1、2、3、4、5、6、7天或更多天的时间连续给药。此外，给药可以通过按制剂和/或给药方式执行的定时释放或缓释机制进行。
C.组合治疗 在某些实施方案中，本发明的组合物和方法涉及miRNA或编码它的表达构建物。这些miRNA组合物可与第二疗法组合使用，以增强miRNA疗法的效果或者提高所采用的另一疗法的治疗作用。这些组合物将以能有效达到期望的效果的组合量(combined amount)来提供，所述期望的效果例如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖。这个方法可涉及使细胞与miRNA或第二疗法同时或在不同时间进行接触。这可通过如下两种方式来实现使细胞与一个或多个包括一个或多个所述药剂的组合物或药理学制剂进行接触，或者使细胞与两个或更多个不同的组合物或制剂进行接触，其中一个组合物提供(1)miRNA；和/或(2)第二疗法。可给予第二组合物或方法，其包括化学疗法、放射疗法、手术疗法、免疫疗法或基因疗法。
考虑到，可给患者提供miRNA疗法和第二疗法，这两种疗法之间相隔在约12-24小时内，更优选两种疗法之间相隔在约6-12小时内。但是，在一些情况中，将治疗时间显著延长可能是合乎需要的，在各次给药之间相隔几天(2、3、4、5、6或7天)到几个星期(1、2、3、4、5、6、7或8个星期)。
在某些实施方案，治疗进程将持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90天或更多天。考虑到，可在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和/或90天、它们的任何组合给予一个药剂，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和/或90天、或它们的任何组合给予另一药剂在单独一天(24小时时间)当中，可对患者单次给予或多次给予药剂。此外，考虑到在某个疗程后有不给予治疗的一段时间。这个时间段可持续1、2、3、4、5、6、7天和/或1、2、3、4、5个星期和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间，取决于患者的情况，如他们的预后、力量、健康等。
可采用各种组合，例如miRNA疗法为“A”，第二疗法为“B”A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A//A/AA/B/A/AA/A/B/A 本发明的任何化合物或疗法向患者的给予，要依照有关这些化合物的给予的一般方案进行，要考虑到载体或任何蛋白质或其他药剂的毒性，如果有毒性的话。因此，在一些实施方案中，有监测可归因于组合疗法的毒性的步骤。预期到，会按需重复进行治疗周期。还考虑到，各种标准的疗法以及手术介入可与所描述的疗法组合应用。
在具体的方面，考虑到将第二疗法如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法或其他基因疗法与本文所述的miRNA疗法组合应用。
1.化学疗法 有多种化学治疗剂可按照本发明进行使用。术语“化学疗法”指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用来表示在癌症的治疗中给予的化合物或组合物。这些药剂或药物按它们在细胞当中的活性方式归类，例如它们是否会影响细胞周期，和它们在什么阶段影响细胞周期。或者，药剂可根据其直接交联DNA、插入到DNA中或者通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。大多数化学治疗剂落入以下类别烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲。
a.烷基化剂 烷基化剂是与基因组DNA直接发生相互作用从而防止癌细胞增殖的药物。这个类别的化学治疗药物代表着影响细胞周期的所有阶段的药剂，也就是说它们不是阶段特异性的(phase-specific)。烷基化剂可应用来治疗慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤以及乳腺、肺和卵巢的特定癌症。它们包括白消安、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(环磷氮芥)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、氮芥(mustargen)和美法仑。曲格列酮(troglitazaone)可用于与这些烷基化剂中的任何一个或多个联合治疗癌症。
b.抗代谢物 抗代谢物能破坏DNA和RNA合成。与烷基化剂不同的是，它们专门影响细胞周期的S期。它们除了已被用来对付乳腺、卵巢和胃肠道的肿瘤外，还已被用来对付慢性白血病。抗代谢物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟达拉滨、吉西他滨和甲氨喋呤。
5-氟尿嘧啶(5-FU)的化学名为5-氟-2，4(1H，3H)-密啶二酮。它的作用机制据认为是通过阻断脱氧尿苷酸向胸苷酸的甲基化反应起作用。因此，5-FU会干扰脱氧核糖核酸(DNA)的合成，和在较小程度上抑制核糖核酸(RNA)的形成。由于DNA和RNA对于细胞分裂和增殖是必需的，因此认为5-FU的作用是造成胸苷缺乏从而导致细胞死亡。因此，5-FU的作用存在于快速分裂的细胞中，快速分裂是转移性癌的特征。
c.抗肿瘤抗生素 抗肿瘤抗生素同时具有抗微生物活性和细胞毒性活性。这些药物还通过在化学上抑制酶类和有丝分裂或者改变细胞膜来干扰DNA。这些药剂不是阶段特异性的，因此它们在细胞周期的所有阶段都起作用。因此，它们被广泛用于多种癌症。抗肿瘤抗生素的实例包括博来霉素、放线菌素、柔红霉素、阿霉素和伊达比星，其中一些在下文有更详细讨论。在临床环境中广泛用来治疗肿瘤的这些化合物，是通过静脉内弹丸注射给予，剂量从阿霉素的21天时间间隔的25-75mg/m2到依托泊苷的静脉内或口服给予35-100mg/m2。
d.有丝分裂抑制剂 有丝分裂抑制剂包括植物生物碱，和其他能抑制细胞分裂或有丝分裂所需的蛋白质合成的天然物质。它们在细胞周期的特定时期起作用。有丝分裂抑制剂包括多西他赛、依托泊苷(VP16)、紫杉醇(paclitaxel)、紫衫酚(taxol)、多烯紫杉醇(taxotere)、长春碱、长春新碱和长春瑞滨。
e.亚硝基脲 亚硝基脲和烷基化剂一样能抑制DNA修复蛋白。它们除了用来治疗脑肿瘤外，还用来治疗非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和恶性黑素瘤。实例包括卡莫司汀和洛莫司汀。
2.放射疗法 放射疗法也称放射治疗，是用电离辐射来治疗癌症和其他疾病。电离辐射会沉积能量，该能量通过损害被治疗区域的细胞的遗传材料而损伤或破坏这些细胞，使得这些细胞不可能继续生长。虽然辐射会同时损害癌细胞和正常细胞，但后者能够自我修复而正确发挥作用。放射疗法可用来治疗局部性实体瘤，如皮肤、舌、喉、脑、乳腺或子宫颈的癌症。它可还用来治疗白血病和淋巴瘤(分别为造血细胞和淋巴系统的癌症)。
按照本发明使用的放射疗法，可包括但不限于γ射线、X射线的使用和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也考虑到了其他形式的DNA损害因素，如微波、质子束辐射(5,760,395号和4,870,287号美国专利)和紫外辐射。很可能的是，所有这些因素对DNA、对DNA前体、对DNA的复制和修复和对染色体的装配和维持，都产生大范围的损害。X射线的剂量范围从持续长时间(3-4星期)的50-200伦琴的每日剂量，到2000-6000伦琴的单剂量。取决于同位素的半寿期、所发射的辐射的强度和类型及肿瘤细胞的吸收情况，放射疗法的剂量范围相差甚大。放射疗法可包括使用放射标记的抗体来将辐射剂量直接递送到癌症部位(放射免疫疗法)。抗体一旦注射到身体中，就积极地搜寻癌细胞，从而癌细胞受到辐射的杀细胞作用(细胞毒性)的破坏。这个方法能使对健康细胞的辐射损害的危险减至最低。
用于大脑和其他肿瘤的立体定向放射外科手术(伽玛刀)不是使用手术刀，而是使用来自几百个不同角度的非常精确靶向的伽玛放射疗法射线束。只需要一期(one sessioin)放射疗法，花费约四五个小时。为进行这个治疗，将特别制作的金属框架贴附到头上。然后，执行几次扫描和X射线，找到需要治疗的精确区域。在脑肿瘤的放射疗法过程中，患者躺卧，头放在大头盔中，头盔中有几百个孔让放射疗法射线束通过。相关的方法允许进行定位(positioning)以治疗身体其他区域的肿瘤。
3.免疫疗法 在癌症治疗的情形中，免疫治疗剂通常依靠使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。曲妥珠单抗(赫赛汀TM)是这样一个实例。免疫效应物可以例如是对肿瘤细胞表面上的某一标记有特异性的抗体。抗体可单独充当治疗的效应物，或者它可募集其他细胞来实际影响细胞杀灭。抗体还可与药物或毒素(化疗治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合而仅充当靶向剂。或者，效应物可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子能与肿瘤细胞靶标直接或间接发生相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。各治疗方式(therapeutic modalities)组合也即直接细胞毒性活性与ErbB2的抑制或减少的组合，会在过量表达ErbB2的癌症的治疗中提供治疗益处。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤或疾病细胞必须荷有某一易受靶向的标记，即在大多数其他细胞上不存在的标记。存在着许多肿瘤标记，这些标记中的任何一个在本发明的情形中都可适合靶向。通常的肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿系统肿瘤相关抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的另外一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。也存在着免疫刺激分子，它们包括细胞因子如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子如MIP-1、MCP-1、IL-8，和生长因子如FLT3配体。将免疫刺激分子——作为蛋白质或者使用基因递送——与肿瘤抑制物如MDA-7相结合，已证实能增强抗肿瘤作用(Ju等人，2000)。此外，抗任何这些化合物的抗体可用来靶向本文讨论的抗癌药剂。
目前在研究或在使用的免疫疗法的实例有免疫佐剂，如牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(5,801,005号和5,739,169号美国专利；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；细胞因子疗法，如干扰素α、β和γ，IL-1、GM-CSF和TNF (Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)基因疗法，如TNF、IL-1、IL-2、p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；5,830,880号和5,846,945号美国专利)和单克隆抗体如抗神经节苷脂GM2、抗HER-2、抗p185；Pietras等人，1998；Hanibuchi等人，1998；5,824,311号美国专利)。赫赛汀(曲妥珠单抗)是嵌合(小鼠-人)单克隆抗体，它能阻断HER2-neu受体。它具有抗肿瘤活性，已被批准用于治疗恶性肿瘤(Dillman，1999)。几种已知的抗癌免疫治疗剂及其靶标的非限制性名单包括(通用名(靶标))西妥昔单抗(EGFR)、帕尼单抗(EGFR)、曲妥珠单抗(erbB2受体)、贝伐单抗(VEGF)、阿仑单抗(CD52)、吉妥珠单抗奥唑米星(CD33)、利妥昔单抗(CD20)、托西莫单抗(CD20)、马妥珠单抗(EGFR)、替伊莫单抗(CD20)、托西莫单抗(CD20)、HuPAM4(MUC1)、MORAb-009(间皮素)、G250(碳酸酐酶IX)、mAb 8H9(8H9抗原)、M195(CD33)、Ipilimumab(CTLA4)、HuLuc63(CS1)、阿仑单抗(CD53)、依帕珠单抗(CD22)、BC8(CD45)、HuJ591(前列腺特异性膜抗原)、hA20(CD20)、来沙木单抗(TRAIL受体-2)、帕妥珠单抗(HER-2受体)、Mik-β-1(IL-2R)、RAV12(RAAG12)、SGN-30(CD30)、AME-133v(CD20)、HeFi-1(CD30)、BMS-663513(CD137)、Volociximab(抗α5β1整联蛋白)、GC1008(TGFβ)、HCD122(CD40)、希普利珠单抗(CD2)、MORAb-003(叶酸受体α)、CNTO 328(IL-6)、MDX-060(CD30)、Ofatumumab(CD20)或SGN-33(CD33)。考虑到，这些疗法中的一个或多个可与本文描述的miRNA疗法一起应用。
癌症的被动免疫疗法存在着多种不同的途径。它们可主要分成以下几类单独注射抗体；注射与毒素或化学治疗剂偶联的抗体；注射与放射性同位素偶联的抗体；注射抗独特型抗体；最后是清除骨髓中的肿瘤细胞。
4.基因疗法 在还另一个实施方案中，组合治疗涉及基因疗法，其中在给予一个或多个治疗性miRNA之前、之后或同时给予治疗性多核苷酸。治疗性多肽或编码核酸与miRNA的联合递送，可对靶标组织具有组合的治疗作用。有多种蛋白质被涵盖在本发明范围内，其中一些在下文描述。与本发明组合的各种可被靶向以进行某种形式的基因疗法的基因，包括但不限于细胞增殖的诱导物、细胞增殖的抑制物、程序性细胞死亡的调节物、细胞因子和其他治疗性核酸或编码治疗性蛋白质的核酸。
肿瘤抑制癌基因起到抑制过度的细胞增殖的作用。这些基因的失活会破坏它们的抑制活性，从而导致不受调节的增殖。可采用肿瘤抑制物(例如治疗性多肽)p53、FHIT、p16和C-CAM。
除p53外，细胞增殖的另一抑制物是p16。真核生物细胞周期的主要转变是由细胞周期蛋白依赖性激酶或者说CDK引发的。有一种CDK，即细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)，能调节通过G1的进程。这个酶的活性可能是在G1晚期使Rb磷酸化。CDK4的活性受激活性亚单位D型细胞周期蛋白和抑制性亚单位的控制。p16INK4已在生物化学上被表征为能特异性结合和抑制CDK4的蛋白质，因此可调节Rb磷酸化(Serrano等人，1993；Serrano等人，1995)。由于p16INK4蛋白是CDK4抑制剂(Serrano，1993)，这个基因的缺失会提高CDK4的活性，从而导致Rb蛋白的超磷酸化。p16已知还能调节CDK6的功能。
p16INK4属于新近描述的一类CDK抑制蛋白，这类抑制蛋白还包括p16B、p19、p21WAF1和p27KIP1。p16INK4基因定位于(map to)9p21，后者是在许多肿瘤类型中常常被缺失的染色体区域。p16INK4基因的纯合缺失和突变，在人肿瘤细胞系中是时常发生的。这个证据提示p16INK4基因是肿瘤抑制基因。但是，这个解释已受到如下观察结果的挑战，即p16INK4基因改变的频率，在原发性未培养的肿瘤中比在经培养的细胞系中低得多(Caldas等人，1994；Cheng等人，1994；Hussussian等人，1994；Kamb等人，1994；Mori 等人，1994；Okamoto等人，1994；Nobori等人，1995；Orlow等人，1994；Arap等人，1995)。通过用质粒表达载体进行转染恢复野生型p16INK4功能，结果减少了一些人癌细胞系的集落形成(Okamoto，1994；Arap，1995)。
其他可按照本发明应用的基因，包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合体、p21/p27融合体、抗血栓基因(例如COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、参与血管发生的基因(例如VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF或者它们的受体)和MCC。
5.手术 大约有60％的癌症患者将进行某种类型的手术，包括预防性手术、诊断性手术或分期手术(staging surgery)、治疗性手术和姑息性手术。治疗性手术是一种可与其他疗法联用的癌症治疗法，所述其他疗法例如本发明的治疗法、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或交替疗法(alternative therapy)。
治疗性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理去除、切离和/或破坏。肿瘤切除术指肿瘤的至少一部分的物理去除。除了肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微控制手术(Mohs手术)。还考虑到，本发明可与浅表癌、初癌或附带数量的(incidental amounts of)正常组织的去除联合使用。
在切除部分或全部的癌性细胞、组织或肿瘤后，身体中可能形成一个空穴。可通过用另外的抗癌疗法输注、直接注射或局部涂敷该区域，来完成治疗。这种治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5个星期，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复进行。这些治疗所用的剂量也可不同。
6.其他药剂 应该考虑到，其他药剂可与本发明组合使用，以提高治疗的疗效。这些另外的药剂包括免疫调节物、影响细胞表面受体和间隙连接(GAP junction)的上调的药剂、细胞抑制剂(cytostatic agent)和分化剂、细胞黏着的抑制剂、增加高增殖性细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。免疫调节物包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或者MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。还应该考虑到，细胞表面受体或其配体如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL(Apo-2配体)的上调，会通过建立对高增殖性细胞的自分泌或旁分泌作用，加强本发明的凋亡诱导能力。通过提高间隙连接的数目来增加细胞间信号转导，会增加对邻近的高增殖性细胞群体的抗高增殖作用。在其他的实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可与本发明组合使用，以提高治疗的抗高增殖作用。考虑用细胞黏着的抑制剂来改进本发明的功效。细胞黏着抑制剂的实例有黏着斑激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他汀。还考虑到，增加高增殖性细胞对凋亡的敏感性的其他药剂如抗体c225，可与本发明组合使用来提高治疗功效。
Apo2配体(Apo2L，也称TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)细胞因子家族的成员。TRAIL能在多种类型的癌细胞中激活快速凋亡，但对正常细胞无毒。TRAILmRNA出现在多种组织中。大多数正常细胞似乎对TRAIL的细胞毒性作用具有抗性，这提示存在着能抗TRAIL的凋亡诱导的机制。描述的TRAIL的第一个受体称为死亡受体4(DR4)，它含有细胞质“死亡结构域”；DR4能传送TRAIL所携带的凋亡信号。已鉴定出另外的能结合TRAIL的受体。有一种受体称为DR5，它与DR4非常相似，含有细胞质死亡结构域并能转导凋亡信号。DR4和DR5 mRNA在许多正常组织和肿瘤细胞系中表达。最近，已鉴定出诱杀型受体如DcR1和DcR2，它们能防止TRAIL通过DR4和DR5诱导凋亡。这些诱杀型受体因此代表着直接在细胞表面处调节对促凋亡细胞因子的敏感性的新机制。这些抑制性受体在正常组织中的优先表达提示，TRAIL可用作诱导癌细胞的凋亡的抗癌剂，同时不伤害正常细胞。(Marsters等人，1999)。
在引进了细胞毒性化疗药物后，在癌症的治疗上已有许多进展。但是，化学疗法的后果之一，是抗药表型的发展/获得和多重药物抗性的发展。药物抗性的发展仍是这种肿瘤的治疗中的主要障碍，因此对另类途径如基因疗法显然有需求。
与化学疗法、放射疗法或生物疗法联用的另一形式的疗法包括高热，这是一种使患者组织暴露于高温的方法(最高达106°F)。外部或内部加热装置可涉及到施加局部的、区域性的或全身的高热。局部高热涉及到将热量施加到小区域如肿瘤。热量可由来自身体外装置的高频波靶向肿瘤外部产生。内部热量可涉及无菌探头，包括细加热丝或充入温水的中空管、植入的微波天线或者射频电极。
加热患者的器官或肢体以进行区域性治疗，这是用能产生高能量的装置如磁体来实现。或者，可移出患者的一些血液进行加热，然后输注到要进行内部加热的区域。在癌症已扩散到整个身体的情况中，也可执行全身加热。为此目的，可使用温水毯子、热蜡、感应线圈和热箱(thermal chamber)。
激素疗法也可与本发明联用或者与之前描述的任何其他癌症疗法组合使用。激素可用来治疗某些癌症，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌，以降低某些激素如睾酮或雌激素的水平或阻断它们的作用。这个治疗往往与至少一种其他癌症疗法组合使用，作为治疗选项或者减少转移危险。
本申请将2006年2月8日提交的美国申请系列号11/349,727通过引用其全文并入本文，该申请要求了2005年2月8日提交的美国申请系列号60/650,807的优先权。
III.miRNA分子 微小RNA分子(“miRNA”)通常长度在21-22个核苷酸，不过19个和最多23个核苷酸的长度也有报道。这些miRNA各自是从更长的前体RNA分子(“前体miRNA”)加工而来。前体miRNA从非编码蛋白质的基因转录而来。前体miRNA具有两个互补性区域，使得它们能够形成茎-环结构或者折回样(fold-back-like)结构，该结构在动物中由称为切酶(Dicer)的核糖核酸酶III样核酸酶切割。被加工的miRNA通常是茎的一部分。
加工的miRNA(也称“成熟miRNA”)变成大复合体的一部分，以下调特定的靶标基因或其基因产物。动物miRNA的实例包括与靶标不完全碱基配对而使翻译停止的那些miRNA(Olsen等人，1999；Seggerson等人，2002)。siRNA也由切酶加工从长的双链RNA分子加工。siRNA不在动物细胞中天然存在，但它们能指导通过RNA诱导沉默复合体(RISC)的序列特异性切割mRNA靶标(Denli等人，2003)。
A.阵列制备 本发明的某些实施方案涉及到使用和制备mRNA或核酸阵列、miRNA或核酸阵列和/或miRNA或核酸探针阵列，这些阵列是核酸分子(探针)的大阵列或微阵列，所述核酸分子(探针)完全或几乎与来自受let-7 miRNA调节的各种基因和基因途径的多种核酸、mRNA或miRNA分子、前体miRNA分子、或者核酸互补(在探针的整个长度上)或者相同(在探针的整个长度上)，且以空间上分隔的布局布置在载体或载体材料上。大阵列通常是其上点缀着探针的硝酸纤维素或尼龙片。微阵列将核酸探针布置得更加紧密，使得最多10,000个核酸分子能容纳在通常1-4平方厘米的区域中。微阵列可通过将核酸分子如基因、寡核苷酸等点缀到基材上来制作，或者通过在基材上原位制作寡核苷酸序列来制作。点缀或制作的核酸分子，可以以多达约30个非相同核酸分子每平方厘米或更多，例如多达约100个乃至1000个每平方厘米的高密度矩阵模式来施加。与滤器阵列(filter array)的基于硝酸纤维素的材料不同，微阵列通常使用包被的玻璃作为固相载体。通过获得标记RNA和/或miRNA互补的核酸样品的有序阵列，每个样品的位置可进行跟踪并与原始样品相关联。
有多种不同的阵列装置是本领域技术人员熟知的，在这些阵列装置中众多不同的核酸探针与固相载体的表面稳定结合。有用的阵列基材包括尼龙、玻璃、金属、塑料、乳胶和硅。这些阵列可在许多不同方面有差异，包括平均探针长度、探针的序列或类型、探针和阵列表面之间的键合性质，例如共价键合或非共价键合，等等。除了探针检测miRNA或基因或代表基因的核酸外，本发明的标记和筛选方法及阵列就其任何参数而言在应用上不受限制；因此，各方法和组合物可在多种不同类型的核酸阵列上使用。
制备微阵列的代表性方法和装置已有描述，例如在以下美国专利中5,143,854；5,202,231；5,242,974；5,288,644；5,324,633；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,432,049；5,436,327；5,445,934；5,468,613；5,470,710；5,472,672；5,492,806；5,525,464；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,527,681；5,529,756；5,532,128；5,545,531；5,547,839；5,554,501；5,556,752；5,561,071；5,571,639；5,580,726；5,580,732；5,593,839；5,599,695；5,599,672；5,610,287；5,624,711；5,631,134；5,639,603；5,654,413；5,658,734；5,661,028；5,665,547；5,667,972；5,695,940；5,700,637；5,744,305；5,800,992；5,807,522；5,830,645；5,837,196；5,871,928；5,847,219；5,876,932；5,919,626；6,004,755；6,087,102；6,368,799；6,383,749；6,617,112；6,638,717；6,720,138，以及WO93/17126；WO 95/11995；WO 95/21265；WO 95/21944；WO 95/35505；WO96/31622；WO 97/10365；WO 97/27317；WO 99/35505；WO 09923256；WO09936760；WO0138580；WO 0168255；WO 03020898；WO 03040410；WO03053586；WO 03087297；WO 03091426；WO03100012；WO 04020085；WO04027093；EP 373 203；EP 785 280；EP 799 897和UK 8 803 000，这些专利的公开内容全都通过引用并入本文。
考虑到，阵列可以是高密度阵列，使得它们含有2、20、25、50、80、100个或更多个不同的探针。考虑到，它们可含有1000、16,000、65,000、250,000或1,000,000个或更多个不同的探针。各探针可靶向一个或多个不同生物或细胞类型中的mRNA和/或miRNA靶标。寡核苷酸探针在一些实施方案中其长度在5-50个、5-45个、10-40个、9-34个或15-40个核苷酸之间。在某些实施方案中，寡核苷酸探针的长度为从5、10、15、20到20、25、30、35、40个核苷酸，包括这些数字之间的所有整数和范围。
每个不同的探针序列在阵列中的位置和序列通常是已知的。此外，大量的不同探针可占据相对较小的区域，从而提供探针密度通常大于约60、100、600、1000、5,000、10,000、40,000、100,000或400,000个不同寡核苷酸探针/cm2的高密度阵列。阵列的表面积可以是约或小于约1、1.6、2、3、4、5、6、7、8、9或10cm2。
此外，本领域普通技术人员能容易地分析阵列产生的数据。这种方案在上文公开，且包括见于WO 9743450；WO 03023058；WO 03022421；WO 03029485；WO 03067217；WO 03066906；WO 03076928；WO 03093810；WO 03100448A1中的信息，所有这些专利通过引用明确并入本文。
B.样品制备 考虑到，众多样品的RNA和/或miRNA可用本发明的阵列、探针索引(indexofprobes)或阵列技术进行分析。虽然考虑的是将内源miRNA用在本发明的组合物和方法上，但重组miRNA——包括与内源miRNA或前体miRNA有互补性或同一性的核酸——也可按本文所述进行处理和分析。样品可以是生物样品，在这种情况中，它们可以来自活组织检查、细针吸取物、剥落物、血液、组织、器官、精液、唾液、泪液、其他体液、毛囊、皮肤或者任何含有或构成生物细胞特别是癌细胞或高增殖性细胞的样品。在某些实施方案中，样品可以是但不限于活检物或者从活检物或者其他体液或组织纯化或富集到一定程度的细胞。或者，样品可以不是生物样品，而是化学混合物，如无细胞的反应混合物(其可含有一种或多种生物酶)。
C.杂交 在制备了阵列或一组探针后，和/或在样品中核酸或探针进行了标记后，将靶标核酸群体与该阵列或探针在杂交条件下进行接触，其中所述条件可按需调整，以提供对所进行的特定测定而言最佳的特异性水平。合适的杂交条件是本领域技术人员熟知的，在Sambrook等人(2001)和WO 95/21944中有综述。在许多实施方案中特别注意的是在杂交过程中使用严格条件。严格条件是本领域技术人员熟知的。
特地考虑到，可将单个阵列或探针组与多个样品进行接触。样品可用不同的标记进行标记以区分各样品。例如，可将单一阵列与用Cy3标记的肿瘤组织样品和用Cy5标记的正常组织样品进行接触。对于与阵列上的探针对应的特定miRNA，可以很容易地确定和定量样品之间的差异。
阵列的小表面积能使杂交条件如温度调节和盐含量一致。此外，由于高密度阵列占据的面积小，杂交可在极小的流体体积中进行(例如约250μl或更小，包括约或小于约5、10、25、50、60、70、80、90、100μl或者这些数字当中可得出的任何范围)。在小体积中，杂交可进行得非常快。
D.差异表达分析 本发明的阵列可用来检测两个样品之间的差异。具体考虑的应用包括鉴定和/或定量正常组织与不正常组织之间miRNA或基因表达的差异、疾病或病症与不显示这种疾病或病症的细胞之间的差异，或者两个经不同处理的样品之间的差异。还有，可在据认为易感特定疾病或病症的样品和据认为不易感或能抵抗该疾病或病症的样品之间，比较miRNA或基因表达。不正常的样品是显示疾病或病症的表型特性或基因型特性的样品，或者据认为就该疾病或病症而言不正常的样品。它可与就该疾病或病症而言正常的细胞进行比较。表型特性包括疾病或病症的症状或者对疾病或病症的易感性，其中所述疾病或病症的某构成因素是或者可以是或者可以不是遗传的，或者由高增殖性或肿瘤性细胞引起。
阵列包含具有核酸探针的固相载体，所述核酸探针结合于载体。阵列通常包含众多不同的核酸探针，它们连接到基材表面不同的、确知的位置。这些阵列也称“微阵列”或者俗称“芯片”，在本领域中普遍有描述，例如5,143,854号、5,445,934号、5,744,305号、5,677,195号、6,040,193号、5,424,186号美国专利和Fodor等人，(1991)，每个专利和文献都为了所有目的通过引用其全文并入本文。用机械合成方法合成这些阵列的技术描述于例如5,384,261号美国专利，该专利为了所有目的通过引用其全文并入本文。虽然在某些方面，使用的是平面阵列表面，但是阵列可制作在几乎任何形状的表面上乃至多个表面上。阵列可以是在珠粒、凝胶、聚合物表面、纤维如光纤、玻璃或任何其他适当的基材上的核酸，参见5,770,358号、5,789,162号、5,708,153号、6,040,193号和5,800,992号美国专利，这些专利为了所有目的整体并入本文。阵列可以以便于全包括式装置(all inclusive device)的诊断或其他操作的方式进行包装，参见例如5,856,174号和5,922,591号美国专利，这两个专利为了所有目的通过引用其全文并入本文。有关阵列及它们的制造和特性的更多信息，另参见2000年4月7日提交的美国专利申请系列号09/545,207，这个专利中请为了所有目的通过引用其全文并入本文。
具体的说，阵列可用来就病理状况如癌症和相关病症对样品评估。具体考虑到，本发明可用来评估疾病的各阶段或亚类(sub-classification)之间的差异，如良性的、癌性的和转移的组织或肿瘤之间的差异。
要评估的表型特性包括诸如以下的特征寿命、发病率、预期存活期、对特定药物或医疗性治疗的易感性或感受性(药物功效)，和药物毒性的危险。在这些表型特性方面有差异的样品，还可用所描述的组合物和方法进行评估。
在某些实施方案中，可产生miRNA和/或表达谱，以评价这些表达谱并将它们与药代动力学或疗法相关联。例如，可在患者进行治疗之前或者在治疗过程中，产生患者肿瘤和血液样品的这些表达谱并进行评估，以确定是否有其表达与患者的治疗结果相关的miRNA或基因。对差异的miRNA或基因的鉴定，可得出用以评估肿瘤和/或血液样品的诊断性测定法，以确定应给患者提供什么药物方案。另外，它可用来鉴定或选择适合特定临床试验的患者。如果表达谱经确定与药物功效或药物毒性相关，则该表达谱关系到该患者是否是接受药物、接受药物组合或者接受该药物特定剂量的适合患者。
除了上述预后性测定外，还可对患有各种疾病的患者的样品进行评估，以确定是否可基于miRNA和/或相关基因表达水平鉴定不同的疾病。可基于表达谱建立诊断性测定法，医生们可用来鉴定患有疾病的个体或者鉴定谁有发展疾病的危险。或者，可基于miRNA谱图(profiling)设计治疗方案。这种方法和组合物的实例，描述于David Brown，Lance Ford，Angie Cheng和Rich Jarvis名下的、2005年5月23日提交的、题为“Methods and Compositions Involving miRNA andmiRNA Inhibitor Molecules”(涉及miRNA和miRNA抑制剂分子的方法和组合物)的美国临时专利申请，该临时申请通过引用其全文并入本文。
E.其他测定法 除了使用阵列和微阵列外，还考虑到可采用多种不同的测定法来分析miRNA或相关基因、它们的活性和它们的作用。这些测定法包括但不限于核酸扩增、聚合酶链反应、定量PCR、RT-PCR、原位杂交、Northern杂交、杂交保护测定(HPA)(GenProbe)、分支DNA(bDNA)测定(Chiron)、滚环式扩增(RCA)、单分子杂交检测(US Genomics)、侵染测定(ThirdWave Technologies)和/或桥连测定(Bridge Litigation Assay)(Genaco)。
IV.核酸 本发明涉及核酸、经修饰的核酸或模拟核酸、miRNA、mRNA、基因及其代表性片段，它们可进行标记，用于阵列分析，或者在诊断性、治疗性或预后性应用中采用，特别是与病理状况如癌症相关的应用中。这些分子可以是已由细胞内源产生，或者已通过化学法或重组法合成或产生。它们可进行分离和/或纯化。每个miRNA在本文中都有描述，包括它们相应的SEQ ID NO和登录号。miRNA的名称往往缩写，提到时不加“hsa-”前缀，但取决于上下文而定要理解为加有“hsa-”前缀。除非另有指明，本说明书中提到的miRNA是标示为miR-X或let-X的人序列，其中X为数字和/或字母。
在某些方面，可使用由后缀“5P”或“3P”标示的miRNA探针。如sanger.ac.uk网站上所述，“5P”表示成熟miRNA衍自前体的5’末端，相应的“3P”表示它衍自前体的3’末端。此外，在一些实施方案中，使用不对应于已知的人miRNA的miRNA探针。考虑到这些非人miRNA探针可在本发明的实施方案中使用，或者考虑到可存在着与非人miRNA同源的人miRNA。在其他的实施方案中，可采用任何哺乳动物细胞、生物样品或其制品。
在本发明的一些实施方案中，涉及到miRNA的方法和组合物可涉及miRNA、标记(例如mRNA)和/或其他核酸。核酸的长度可以是、至少是或者至多是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个核苷酸，或者这些数字当中可得出的任何范围。这些长度覆盖加工的miRNA、miRNA探针、前体miRNA、含miRNA的载体、mRNA、mRNA探针、对照核酸及其他探针和引物的长度。
在许多实施方案中，miRNA的长度为19-24个核苷酸，而miRNA探针的长度为19-35个核苷酸，取决于加工的miRNA和任何加入的侧翼区的长度。人类中的miRNA前体通常在62-110个核苷酸之间。
本发明的核酸可具有与另一核酸有同一性或互补性的区域。考虑到互补性或同一性的区域可以是至少5个毗连残基，不过具体考虑到该区域是、至少是或者至多是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个毗连核苷酸。还要理解的是，前体miRNA或其他核酸当中的互补性长度，或者miRNA探针与miRNA或miRNA基因之间的互补性长度，是这些长度。此外，互补性可以百分数表示，意思是探针与其靶标之间的互补性在探针的整个长度上为90％或更高。在一些实施方案中，互补性是或者至少为90％、95％或100％。具体的说，这些长度可适用于任何包含任何本文所述SEQ ID No、登录号所标示的核酸序列，或者本文所公开的任何其他序列。通常，给出miRNA的常用名称(前缀表示其鉴定来源，例如“hsa”指人序列)和加工的miRNA序列。除非另有指明，不带前缀的miRNA应理解为指人miRNA。此外，miRNA名称中的小写字母可以是或可以不是小写字母；例如hsa-mir-130b也可称为miR-130B。术语“miRNA探针”指可鉴定特定的miRNA或结构上相关miRNA的核酸探针。
应理解到，一些核酸衍自基因组序列或基因。在这点上，术语“基因”是为了简便起见，用来指编码给定miRNA或基因的前体核酸或miRNA的基因组序列。但是，本发明的实施方案可涉及miRNA的、参与其表达的基因组序列，如启动子或其他调节序列。
可使用术语“重组”，这通常指已在体外进行过操作的分子，或者是这种分子的复制或表达产物。
术语“核酸”是本领域公知的。本文所用的“核酸”通常是指包含核碱基的DNA、RNA或者它们的衍生物或类似物的分子(一条或多条链)。核碱基包括例如存在于DNA(例如腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或者RNA(例如A、G、尿嘧啶“U”或C)中的天然嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”涵盖术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，它们各自都是术语“核酸”的亚属。
术语“miRNA”一般指单链分子，但在具体的实施方案中，在本发明中实施的分子还会涵盖这样的区域或者另外链，它部分上(在整个链长度上有10-50％互补性)、基本上(在整个链长度上有大于50％但小于100％互补性)或者完全地与同一单链分子的另一区域或者与另一核酸互补。因此，miRNA核酸可涵盖这样的分子，它包含特定序列的一个或多个互补的或自身互补的链或“互补序列(complement)”。例如，前体miRNA可具有自身互补区域，互补性最大达100％。本发明的miRNA探针或核酸可包括、可以是或者可以至少是与其靶标有60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％的互补性。
应理解到，本发明的“合成核酸”意思是该核酸不具有天然核酸的全部或部分化学结构或序列。因此，应理解到，术语“合成miRNA”指在细胞中或在生理条件下起到天然miRNA的作用的“合成核酸”。
虽然本发明的实施方案可涉及合成miRNA或合成核酸，但在本发明的一些实施方案中，核酸分子不必是“合成的”。在一些实施方案中，在本发明方法和组合物中采用的非合成核酸或miRNA，可具有天然mRNA或miRNA前体或者成熟mRNA或miRNA的整个序列和结构。例如，在本发明方法和组合物中使用的非合成miRNA，可不具有一个或多个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物。在这些实施方案中，非合成miRNA可以是或者不是重组产生的。在特定的实施方案中，本发明方法和/或组合物中的核酸专门是合成miRNA而不是非合成miRNA(非合成miRNA也即不是所谓的“合成”miRNA)；然而在其他实施方案中，本发明专门涉及非合成miRNA而不是合成miRNA。任何针对合成miRNA的使用所讨论的实施方案，都可适用于非合成miRNA，反之亦然。
应理解到，术语“天然”指没有任何人类干预下的生物中存在的东西；它可指天然的野生型分子或突变分子。在一些实施方案中，合成miRNA分子不具有天然miRNA分子的序列。在其他实施方案中，合成miRNA分子可具有天然miRNA分子的序列，但该分子的化学结构，特别是与精确序列具体不相关的部分中的化学结构(非序列化学结构)，与具有该序列的天然miRNA分子的化学结构不同。在一些情况中，合成miRNA具有在天然miRNA中不存在的序列化学结构和非序列化学结构。此外，合成分子的序列将确定哪个miRNA得到有效提供或抑制；内源miRNA将被称为“相应miRNA”。可在本发明情形中使用的相应miRNA序列，包括但不限于本文提供的各SEQ ID中的那些序列的全部或一部分，以及任何其他miRNA序列、miRNA前体序列或者它们的任何互补序列。在一些实施方案中，序列是或来源于或含有本文所鉴别的序列的全部或一部分，以靶向可与所述序列一起使用的特定miRNA(或miRNA组)。可选定任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260个或者这些数字当中的任何数字或范围的序列以排除所有非选定序列。
本文所用的“杂交”、“与...杂交”或者“能够杂交”，应理解为意指双链或三链分子或者具有部分双链或三链性质的分子的形成。本文所用的术语“退火”与“杂交”同义。术语“杂交”、“与...杂交”或者“能够杂交”涵盖术语“严格条件”或“高严格性”和术语“低严格性”或“低严格条件”。
本文所用的“严格条件”或“高严格性”是这样的条件，它们能让一个或多个含有互补序列的核酸链之间或内发生杂交，但排除随机序列的杂交。严格条件能容忍核酸和靶标链之间极少的错配，如果有错配的话。这种条件是本领域普通技术人员公知的，优选用于要求高选择性的应用中。非限制性的应用包括分离核酸如基因或其核酸片段，或者检测至少一个特异性mRNA转录物或其核酸片段，等等。
严格条件可包括低盐和/或高温条件，如由约42℃至约70℃的温.度下的约0.02M至约0.5M NaCl提供的条件。应理解到，期望严格性的温度和离子强度部分上由以下因素决定特定核酸的长度、靶标序列的长度和核碱基含量、核酸的电荷组成，杂交混合物中甲酰胺、四甲基氯化铵或其他溶剂的存在或浓度。
还应理解到，对杂交而言的这些范围、组成和条件，仅是以非限制性实例的方式提及，特定杂交反应的期望严格性，往往是通过与一个或多个阳性对照或阴性对照进行比较来经验确定。视预期的应用而定，优选的是采用不同的杂交条件，来达到核酸对靶标序列的不同程度的选择性。在非限制性实例中，可通过在低温和/或高离子强度下杂交，实现对在严格条件下不与核酸杂交的相关靶标核酸的鉴定或分离。这种条件称为“低严格性”或“低严格性条件”，低严格性的非限制性实例包括在约20℃至约50℃温度范围的约0.15M至约0.9MNaCl下进行的杂交。当然，本领域技术人员有能力进一步修正低严格性或高严格性条件，以适合特定的应用。
A.核碱基、核苷、核苷酸和经修饰的核苷酸 本文所用的“核碱基”指杂环碱基，例如在至少一种天然核酸(即DNA和RNA)中存在的天然核碱基(即A、T、G、C或U)，和这种核碱基的天然或非天然衍生物和类似物。核碱基通常可与至少一个天然核碱基，以可替代天然核碱基配对(例如A和T、G和C及A和U之间的氢键键合)的方式，形成一个或多个氢键(“退火”或“杂交”)。
“嘌呤”和/或“嘧啶”核碱基涵盖天然嘌呤和/或嘧啶核碱基，还有它们的衍生物和类似物，包括但不限于被烷基、羧基烷基、氨基、羟基、卤素(即氟、氯、溴或碘)、硫醇或烷硫基部分(moiety)中的一个或多个取代的那些嘌呤或嘧啶。优选的烷基(例如烷基、羧基烷基等)部分包含约1、约2、约3、约4、约5至约6个碳原子。嘌呤或嘧啶的其他非限制性实例包括脱氮嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、溴胸腺嘧啶、8-氨基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫代鸟嘌呤、氮杂鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-乙基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、硫代尿嘧啶、2-甲基腺嘌呤、甲基硫代腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、氮杂腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫代嘌呤、4-(6-氨基己基/胞嘧啶)等。其他实例是本领域技术人员公知的。
本文所用的“核苷”指包含与核碱基连接部分(linker moiety)共价连接的核碱基的单独化学单位。“核碱基连接部分”的非限制性实例是包含5个碳原子的糖(即“5碳糖”)，包括但不限于脱氧核糖、核糖、阿拉伯糖或者5碳糖的衍生物或类似物。5碳糖的衍生物或类似物的非限制性实例，包括2′-氟-2′-脱氧核糖或者其中糖环中的一个氧原子被碳取代的碳环糖。核碱基与核碱基连接部分的不同类型的共价连接，是本领域公知的(Kornberg和Baker，1992)。
本文所用的“核苷酸”指进一步包含“骨架部分”的核苷。骨架部分通常将核苷酸与另一包含核苷酸的分子共价连接，或者与另一核苷酸连接以形成核酸。天然核苷酸中的“骨架部分”通常包括与5碳糖共价连接的磷部分。骨架部分的连接通常出现在5碳糖的3′-或5′-位置。但是，其他类型的连接也是本领域公知的，特别是当核苷酸包含天然5碳糖或磷部分的衍生物或类似物时。
核酸可包含可在天然核酸中存在的核碱基、核碱基连接部分和/或骨架部分的衍生物或类似物，或者完全由这种衍生物或类似物组成。具有核酸类似物的RNA也可按本发明方法进行标记。本文所用的“衍生物”指天然分子的经化学修饰或改变的形式，而术语“模拟物”或“类似物”指这样的分子，它在结构上可能与或不与天然分子或部分类似，但具有相似的功能。本文所用的“部分(moiety)”一般指较大化学或分子结构中的较小化学或分子成分。核碱基、核苷和核苷酸类似物或衍生物为本领域公知，已有描述(参见例如Scheit，1980，通过引用并入本文)。
核苷、核苷酸或核酸的另外的非限制性实例，包括以下各号美国专利中的那些实例5,681,947、5,652,099、5,763,167、5,614,617、5,670,663、5,872,232、5,859,221、5,446,137、5,886,165、5,714,606、5,672,697、5,466,786、5,792,847、5,223,618、5,470,967、5,378,825、5,777,092、5,623,070、5,610,289、5,602,240、5,858,988、5,214,136、5,700,922、5,708,154、5,728,525、5,637,683、6,251,666、5,480,980和5,728,525，每个专利都通过引用其全文并入本文。
本发明的标记方法和试剂盒特地考虑到使用这样的核苷酸，它们一方面经修饰以连接标记，另一方面能掺入到miRNA分子中。这种核苷酸包括可用包括荧光染料的染料或者用诸如生物素的分子进行标记的那些核苷酸。经标记的核苷酸是容易获得的；它们可从商业途径获得，或者可通过本领域技术人员公知的反应合成得到。
供用于本发明的经修饰的核苷酸不是天然核苷酸，而是指在其上具有反应性部分的经制备的核苷酸。具体的值得关注的反应性官能团包括氨基、巯基、亚砜氧基、氨基巯基、叠氮基、环氧化物、异硫氰酸根、异氰酸根、酸酐、一氯三嗪、二氯三嗪、一卤素或二卤素取代的吡啶、一或二取代的二嗪、马来酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、磺酰卤、酰基卤、烷基卤、芳基卤、烷基磺酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、亚胺酯、肼、叠氮基硝基苯基、叠氮化物、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺、乙二醛、醛、碘代乙酰基、氰基甲酯、对硝基苯酯、邻硝基苯酯、羟基吡啶酯、羰基咪唑和其他这类化学基团。在一些实施方案中，反应性官能团可直接与核苷酸键合，或者它可通过连接基团与核苷酸键合。官能部分和任何接头基本上不能削弱核苷酸被加到miRNA或被标记的能力。代表性的连接基团包括通常约2-18个碳原子、往往约2-8个碳原子的含碳连接基团，其中含碳连接基团可以包括或不包括一个或多个杂原子，例如S、O、N等，和可以包括或不包括一个或多个不饱和位点。在许多实施方案中特别值得关注的是烷基连接基团，通常是1-16个碳原子、往往1-4个碳原子的低碳烷基连接基团，其中该连接基团可包括一个或多个不饱和位点。用于上述官能化靶标产生方法的官能化核苷酸(或引物)，可用已知的方案制备，或者可从商家购买，例如Sigma、Roche、Ambion、Biosearch Technologies和NEN。官能团可按本领域技术人员公知的方法制备，这些方法包括4,404,289号、4,405,711号、4,337,063号和5,268,486号美国专利和1,529,202号英国专利中的代表性信息，这些专利通过引用并入本文。
经胺修饰的单核苷酸在本发明的几个实施方案中使用。经胺修饰的核苷酸是具有连接标记的活性胺基团的核苷酸。考虑到任何核糖核苷酸(G、A、U或C)或脱氧核糖核苷酸(G、A、T或C)都可进行修饰以便标记。实例包括但不限于以下经修饰的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸5-(3-氨基烯丙基)-UTP；8-[(4-氨基)丁基]-氨基-ATP和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-ATP；N6-(4-氨基)丁基-ATP；N6-(6-氨基)丁基-ATP，N4-[2，2-氧基-双(乙胺)]-CTP；N6-(6-氨基)己基-ATP；8-[(6-氨基)己基]-氨基-ATP；5-炔丙基氨基-CTP；5-炔丙基氨基-UTP；5-(3-氨基烯丙基)-dUTP；8-[(4-氨基)丁基]-氨基-dATP和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-dATP；N6-(4-氨基)丁基-dATP；N6-(6-氨基)丁基-dATP，N4-[2，2-氧基-双(乙胺)]-dCTP；N6-(6-氨基)己基-dATP；8-[(6-氨基)己基]-氨基-dATP；5-炔丙基氨基-dCTP和5-炔丙基氨基-dUTP。这种核苷酸可按照本领域技术人员公知的方法制备。此外，本领域技术人员可用相同的胺修饰如5-(3-氨基烯丙基)-CTP、GTP、ATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP取代5-(3-氨基烯丙基)-UTP，来制备其他的核苷酸实体。
B.核酸的制备 核酸可通过本领域普通技术人员公知的任何技术制备，例如化学合成、酶促生产或生物生产。特地考虑到，本发明的miRNA探针是化学合成的。
在本发明的一些实施方案中，从生物样品回收或分离miRNA。miRNA可以是重组的，或者它可以是细胞的天然或内源miRNA(从细胞基因组产生)。考虑到，可对生物样品进行处理，以增强小RNA分子如miRNA的回收。美国专利申请系列号10/667,126描述了这种方法，该专利申请通过引用特地结合到本文中。一般来说，这些方法涉及到用具有胍盐和去污剂的溶液裂解细胞。
或者，可按标准的方法进行核酸合成。参见例如Itakura和Riggs(1980)及4,704,362号、5,221,619号和5,583,013号美国专利，每个文献和专利都通过引用并入本文。合成核酸(例如合成寡核苷酸)的非限制性实例，包括通过如下方式进行体外化学合成制备的核酸使用磷酸三酯、亚磷酸盐或亚磷酰胺化学法，和例如描述于EP 266,032的固相技术(通过引用并入本文)，或者通过如Froehler等人，1986和5,705,629号美国专利(各自通过引用并入本文)所描述的脱氧核苷H-膦酸酯中间体。寡核苷酸合成的各种不同机制已在例如以下各号美国专利中公开4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244，每个专利都通过引用并入本文。
酶促产生的核酸的非限制性实例，包括通过酶在扩增反应如PCRTM(参见例如4,683,202号和4,682,195号美国专利，每个专利通过引用并入本文)中，或者5,645,897号美国专利(通过引用并入本文)描述的寡核苷酸的合成中产生的核酸。另参见Sambrook等人，2001(通过引用并入本文)。
寡核苷酸合成是本领域技术人员公知的。寡核苷酸合成的各种不同机制已在例如以下各号美国专利中公开4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244，每个专利都通过引用并入本文。
在细胞中产生核酸的重组方法是本领域技术人员公知的。这些方法包括使用载体(病毒载体和非病毒载体)、质粒、黏粒和其他介质来将核酸递送到细胞，细胞可以是靶标细胞(例如癌细胞)，或者仅仅是宿主细胞(以产生大量的期望RNA分子)。或者，这种介质可在无细胞的系统的情形中使用，只要存在用以产生RNA分子的试剂。这种方法包括Sambrook，2003、Sambrook，2001和Sambrook，1989中描述的方法，这三个文献通过引用并入本文。
C.核酸的分离 核酸可用本领域技术人员公知的技术分离，不过在特定的实施方案中，可采用分离小核酸分子和/或分离RNA分子的方法。色谱法是一种常用来将核酸与蛋白质或者与其他核酸分开或分离的方法。这种方法可涉及用凝胶基质进行的电泳、过滤柱、醇沉淀和/或其他色谱法。如果细胞的miRNA要进行使用或者要进行评估，方法通常涉及用离液剂(例如异硫氰酸胍)和/或去污剂(例如N-月桂酰基肌氨酸)裂解细胞，然后执行分离特定RNA群体的过程。
在特定的将miRNA与其他核酸分离的方法中，用聚丙烯酰胺制备凝胶基质，不过也可使用琼脂糖。凝胶可以是有浓度梯度的，或者它们可以是均匀的。可以使用板材或管材保持凝胶基质以进行电泳。核酸的分离通常采用一维电泳。板材用来制备板式凝胶，而管材(通常为玻璃或橡胶)可用来制备管式凝胶。词语“管式电泳”指使用管子或管材而不是板材来形成凝胶。进行管式电泳的材料可容易地由本领域技术人员制备，或者可从例如C.B.S.Scientific Co.，Inc.或Scie-Plas购得。
方法涉及使用有机溶剂和/或醇来分离核酸，特别是用于本发明方法和组合物的miRNA。一些实施方案在美国专利申请系列号10/667,126中描述，该专利申请通过引用并入本文。大体上说，这个公开内容提供了从细胞有效分离小RNA分子的方法，所述方法包括向细胞裂解物加入醇溶液，将醇/裂解物混合物施加到固相载体，然后将RNA分子从同相载体上洗脱下来。在一些实施方案中，加到细胞裂解物的醇的量实现约55％-60％的醇浓度。乙醇非常适用，不过也可采用别的醇。固相载体可以为任何结构，它包括珠粒、滤器和柱子，其可包含带有电负性基团的矿物质或聚合物载体。玻璃纤维滤器或柱子对于这种分离方法特别适用。
在具体的实施方案中，miRNA分离过程包括a)用包含胍盐的裂解溶液裂解样品中的细胞，其中产生出胍盐浓度为至少约1M的裂解物；b)用包含苯酚的提取溶液从裂解物提取miRNA分子；c)向裂解物加入醇溶液以形成裂解物/醇混合物，其中混合物中醇的浓度在约35％至约70％之间；d)将裂解物/醇混合物施加到固相载体；e)用离子溶液将miRNA分子从固相载体上洗脱下来；和f)捕获miRNA分子。通常，将样品干燥，并重悬在适合后续操作的液体和体积中。
V.标记和标记技术 在一些实施方案中，本发明涉及经标记的miRNA。考虑到miRNA可在进行标记之前先进行分离和/或纯化。与其中miRNA在进行标记之前没有进行分离或纯化的样品中的其他RNA相比，这可实现能更有效地标记miRNA的反应。在本发明的许多实施方案中，标记是非放射性标记。通常，可通过加入经标记的核苷酸(一步法)，或者加入核苷酸并标记所加入的核苷酸(两步法)，来对核酸进行标记。
A.标记技术 在一些实施方案中，通过以催化方式向核酸加入已经标记的(一个或多个)核苷酸，来对核酸进行标记。可将一个或多个经标记的核苷酸加到miRNA分子。参见6,723,509号美国专利，其通过引用并入本文。
在其他的实施方案中，将未经标记的(一个或多个)核苷酸以催化方式加到miRNA，未经标记的核苷酸是用可使它随后能够被标记的化学部分进行修饰。在本发明的实施方案中，化学部分是活性胺，使得核苷酸是经胺修饰的核苷酸。经胺修饰的核苷酸的实例是本领域技术人员公知的，有许多可例如从Ambion、Sigma、Jena Bioscience和TriLink市售获得。
与cDNA合成过程中对其进行标记相反的是，对miRNA进行标记的问题在于如何标记已经存在的分子。本发明涉及使用能够利用三磷酸核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸作为底物，将其加到miRNA的酶。此外，在具体的实施方案中，本发明涉及使用经修饰的二磷酸或三磷酸核糖核苷酸，它被加到miRNA的3’末端。能够加入这种核苷酸的酶包括但不限于poly(A)聚合酶、末端转移酶和多核苷酸磷酸化酶。在本发明的具体实施方案中，考虑到用来加入标记的酶不是连接酶，相反，采用的是非连接酶。末端转移酶能催化核苷酸加入到核酸的3′末端。多核苷酸磷酸化酶能不需要引物就使二磷酸核苷酸发生聚合。
B.标记 miRNA或miRNA探针上的标记可以是比色(包括可见光谱和紫外光谱，包括荧光)标记、发光标记、酶促标记或正电子发射标记(包括放射性标记)。标记可直接或间接进行检测。放射性标记包括125I、32P、33P和35S。酶促标记的实例包括碱性磷酸酶、萤光素酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶。标记也可以是具有发光性质的蛋白质，例如绿色荧光蛋白和藻红蛋白。
考虑用作缀合物的比色标记和荧光标记包括但不限于Alexa Fluor染料；BODIPY染料，如BODIPY FL；Cascade Blue；Cascade YelloW；香豆素及其衍生物，如7-氨基-4-甲基香豆素、氨基香豆素和羟基香豆素；花青染料，如Cy3和Cy5；曙红和赤藓红；荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素；镧系离子的大环螯合物，如Quantum DyeTM；Marina Blue；Oregon Green；罗丹明染料，如罗丹明红，四甲基罗丹明和罗丹明6G；Texas Red；荧光能量转移染料，如噻唑橙乙锭异型二聚体；和TOTAB。
染料的具体实例包括但不限于以上所述的染料和以下染料Alexa Fluor350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、AlexaFluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750；胺反应性BODIPY染料，如BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/655、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR和BODIPY-TR；Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、OregonGreen 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂、ROX、SYPRO、TAMRA、2′，4′，5′，7′-四溴砜荧光素和TET。
荧光标记的核糖核苷酸的具体实例可从Molecular Probes获得，它们包括Alexa Fluor 488-5-UTP、荧光素-12-UTP、BODIPY FL-14-UTP、BODIPYTMR-14-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、Alexa Fluor 546-14-UTP、Texas Red-5-UTP和BODIPY TR-14-UTP。其他的荧光核糖核苷酸可从Amersham Biosciences获得，例如Cy3-UTP和Cy5-UTP。
荧光标记的脱氧核糖核苷酸的实例包括二硝基苯基(DNP)-11-dUTP、Cascade Blue-7-dUTP、Alexa Fluor 488-5-dUTP、荧光素-12-dUTP、Oregon Green488-5-dUTP、BODIPY FL-14-dUTP、罗丹明绿-5-dUTP、Alexa Fluor 532-5-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、Alexa Fluor 546-14-dUTP、AlexaFluor 568-5-dUTP、Texas Red-12-dUTP、Texas Red-5-dUTP、BODIPYTR-14-dUTP、Alexa Fluor 594-5-dUTP、BODIPY 630/650-14-dUTP、BODIPY650/665-14-dUTP、Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor546-16-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor647-12-OBEA-dCTP。
考虑到核酸可用两种不同的标记进行标记。此外，在本发明的方法中可采用荧光共振能量转移技术(FRET)(例如Klostermeier等人，2002；Emptage，2001；Didenko，2001，每个文献通过引用并入本文)。
或者，标记可以本身不是可检测的，但可以是间接可检测的，或者能使靶标核酸得以分离或分开。例如，标记可以是生物素、地高辛、多价阳离子、螯合基团和其他配体，包括抗体的配体。
C.显示技术 有多种用以显示或检测经标记的核酸的技术是现成可用的。这些技术包括显微镜检术、阵列、荧光测定术、光循环仪(Light cycler)或其他实时PCR仪；FACS分析、闪烁计数器、磷光影像分析仪、盖格计数器、MRI、CAT、基于抗体的检测方法(蛋白质印迹、免疫荧光、免疫组织化学)、组织化学技术、HPLC(Griffey等人，1997)、光谱法、毛细管凝胶电泳(Cummins等人，1996)、光谱法、质谱、放射技术和质量平衡技术(mass balance technique)。
当采用两个或多个差异着色的标记时，可采用荧光共振能量转移技术(FRET)来表征一个或多个核苷酸的缔合。此外，本领域普通技术人员熟知显示、鉴定和表征经标记的核酸的方法，因此这些方案可作为本发明的一部分使用。可使用的工具的实例还包括荧光显微镜术、BioAnalyzer、读板器、Storm(MolecularDynamics)、阵列扫描仪、FACS(荧光激活细胞分选仪)或者任何具有激发和检测荧光分子的能力的仪器。
VI.试剂盒 本文描述的任何组合可包含在试剂盒中。在非限制性的实例中，试剂盒可包括用以采用阵列、核酸扩增和/或杂交来分离miRNA、标记miRNA和/或评估miRNA群体的试剂，以及用以从血液样品制备样品的试剂。试剂盒还可包括用以产生或合成miRNA探针的试剂。试剂盒因此将在合适的容器器具中，包含用以通过掺入经标记的核苷酸或者随后被标记的未经标记的核苷酸来标记miRNA的酶。在某些方面，试剂盒可包括扩增试剂。在其他方面，试剂盒可包括各种载体，如玻璃、尼龙、聚合珠粒等，和/或用以偶联任何探针和/或靶标核酸的试剂。它还可包括一种或多种缓冲液，如反应缓冲液、标记缓冲液、洗涤缓冲液或杂交缓冲液、用以制备miRNA探针的化合物和用以分离miRNA的成分。本发明的其他试剂盒可包括用以制备包含miRNA的核酸阵列的成分，因此可包括例如固相载体。
特地考虑到用以执行本文所述的本发明方法的试剂盒。在一些实施方案中，有用以制备用于多重标记的miRNA的试剂盒，和用以制备miRNA探针和/或miRNA阵列的试剂盒。在这些实施方案中，试剂盒在合适的容器器具中包含以下成分中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个(1)poly(A)聚合酶；(2)未经修饰的核苷酸(G、A、T、C和/或U)；(3)经修饰的核苷酸(经标记的或未经标记的)；(4)poly(A)聚合酶缓冲液；(5)至少一个微过滤器；(6)可与核苷酸连接的标记；(7)至少一个miRNA探针；(8)反应缓冲液；(9)miRNA阵列或用以制作这种阵列的成分；(10)乙酸；(11)醇；(12)用以制备、分离、富集和纯化miRNA或miRNA探针或阵列的溶液。其他的试剂包括通常用于操纵RNA的试剂，如甲酰胺、荷载染料、核糖核酸酶抑制剂和DNA酶。
在具体的实施方案中，本发明的试剂盒包括含有本申请中所述的miRNA探针的阵列。阵列可具有对应于生物的或者特定条件下特定组织或器官的所有已知miRNA的探针，或者这些探针的子集(subset)。本发明阵列上的探针子集，可以是或者包括经鉴定为与特定诊断性、治疗性或预后性应用相关的那些探针。例如，阵列可含有一个或多个指示或暗示以下方面的探针(1)疾病或病症(急性髓性白血病)；(2)对特定药物或治疗的易感性或抗性；(3)对来自药物或物质的毒性的易感性；(4)疾病或病症的发展阶段或严重性(预后)；和(5)对疾病或病症的遗传易感性。
对于任何试剂盒实施方案，包括阵列，可以有含有或者可用来扩增这样的序列的核酸分子，该序列是本文描述的任何SEQ ID的全部或部分的变体，或者与本文描述的任何SEQ ID的全部或部分有同一性或互补性。在某些实施方案中，本发明的试剂盒或阵列可含有一个或多个由本文所述SEQ ID所表示的miRNA的探针。任何上文讨论的核酸都可作为试剂盒的一部分执行。
试剂盒的各成分可包装在含水介质中，或者可以以冻干形式包装。试剂盒的容器器具通常会包括至少一个其中装入某个成分、该成分优选经适当等分的小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器器具。在试剂盒中有超过一个成分(标记试剂和标记可包装在一起)的情况中，试剂盒通常还会含有其中可单独装入另外的成分的第二、第三个或其他另外容器。但是，各成分的各种组合可包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还会包括用来装核酸的器具，和任何其他严密密封以供商业销售的试剂容器。这种容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，期望的小瓶保持在所述容器中。
当试剂盒的各成分是在一个和/或多个液体溶液中提供时，液体溶液是水溶液，特别优选的是无菌水溶液。
但是，试剂盒的各成分可作为干燥粉末提供。当各试剂和/或成分作为干燥粉末提供时，粉末可通过加入合适的溶剂进行重构。预想到，还可在另一容器器具中提供溶剂。在一些实施方案中，标记染料作为干燥粉末提供。考虑到，在本发明的试剂盒中提供10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μg或至少或至多这些数量的干燥染料。接着染料可重悬在任何合适的溶剂如DMSO中。
这种试剂盒还可包括有助于分离经标记的miRNA的成分。它还可包括能保藏或维持miRNA或者能使miRNA免遭降解的成分。这种成分可以是无RNA酶的，或者是受保护免遭RNA酶的影响。这种试剂盒通常会以合适的方式包含每单个试剂或溶液的不同容器。
试剂盒还会包括有关应用试剂盒各成分以及使用试剂盒中没有包括的任何其他试剂的说明书。说明书可包括可执行的各种变化方案。
本发明的试剂盒还可包括以下的一个或多个对照RNA；无核酸酶的水；无RNA酶的容器，如1.5ml管子；无RNA酶的洗脱管；PEG或葡聚糖；乙醇；乙酸；乙酸钠；乙酸铵；胍盐；去污剂；核酸大小标记；无RNA酶的管尖；和RNA酶或DNA酶抑制剂。
考虑到这些试剂是本领域试剂盒的各实施方案。但是，这种试剂盒并不局限于以上所述的具体项目，而是可包括任何用来操纵或表征miRNA的试剂。
实施例 给出以下实施例目的是说明本发明的各个实施方案，并不意在以任何方式限制本发明。本领域技术人员会容易理解到，本发明很适合于执行本文提到的目标和获得本文提到的目的和优点，以及实现本文暗含的那些目标、目的和优点。本发明的实施例连同本文描述的方法，目前代表着优选的实施方案，是示例性的，并不意在作为对本发明范围的限制。涵盖在由权利要求书的范围所限定的本发明精神内的变化方案和其他用途，本领域技术人员是会想到的。除另有指明外，目录号指代的是可按该号码从Ambion，Inc.

The RNA Company获得的产品。
实施例1 miRNA转染后分析基因表达的方法 将合成的前体miR miRNA(Ambion)反转染到A549、HepG2或HL-60细胞的一式四份的样品中。A549和HepG2细胞用siPORT NeoFX(Ambion)，按照生产商的推荐使用以下参数进行转染6孔板中每孔200,000个细胞、5.0μl的NeoFX、2.5ml的30nM终浓度的miRNA。转染72小时后收获细胞。HL-60细胞用Gene Pulser Xcell System(Bio-Rad Laboratories，Inc.；Hercules，CA，USA)按照厂商说明书和以下参数进行转染每反应150μl体积的500,000个细胞，在2-mm电穿孔杯(electroporation cuvette)中，使用25msec的单方波脉冲。
总RNA用RNAqueous-4PCR(Ambion)按照生产商推荐的方案进行提取。mRNA阵列分析由Asuragen Services(Austin，TX)按照该公司的标准操作程序进行。使用MessageAmpTM II-96 aRNA Amplification Kit(Ambion，目录号1819)，将2μg的总RNA用于进行靶标制备和生物素标记。cRNA产量用AgilentBioanalyzer 2100毛细管电泳方案进行定量。采用生产商的推荐和以下参数，使经标记的靶标与Affymetrix mRNA阵列(Human HG-U133A 2.0阵列)阵列杂交。杂交是在Affymetrix Model 640杂交炉中45℃进行16小时。将阵列洗涤，在Affymetrix FS450流控台上染色，运行洗涤脚本Midi euk2v3 450。将阵列在Affymetrix GeneChip Scanner 3000上扫描。用Affymetrix统计算法MAS 5.0(GCOS v1.4)，产生有关图象信号数据、组平均值、带显著性标签的p值、对数比和阵列上每个基因的基因注释的概要。对于观察到的效应，用两个阴性对照微小RNA序列的平均值进行归一化，然后一起取平均值来表示。确定为被治疗改变的基因，是通过根据相对于两个对照转染的变化倍数对所有基因进行过滤来确定的。统计学显著性是在综合性F检验(omnibus F-test)证实显著后通过t检验来评估。
实施例2 A549、HEPG2和HL-60细胞用HSA-LET-7B转染后的基因表达分析 miRNA据认为主要在翻译水平上影响基因表达。但是，最近已报道，在一些情况中hsa-let-7(Bagga等人，2005)和其他miRNA(Lim等人，2005)可降低直接靶标的mRNA水平，且这种变化可在微阵列基因表达分析时观察到。
本文描述的实验能鉴定人肺癌(A549)细胞系、人肝癌细胞系(HepG2)和人急性髓性白血病细胞系(HL-60)中，其mRNA水平受hsa-let-7表达的影响的基因。A549、HepG2或HL-60细胞按实施例1的描述用前体miR hsa-let-7b(作为hsa-let-7miRNA家族的代表性成员)进行转染。微阵列基因表达分析的结果在表2、3和4中显示。
表2.用前体miR hsa-let-7b转染后A549细胞中mRNA表达水平发生改变的基因 表3.用前体miR hsa-let-7b转染后HepG2细胞中mRNA表达水平发生改变的基因 表4.用前体miR hsa-let-7b转染后HL-60细胞中mRNA表达水平发生改变的基因 表4中的负变化倍数表示与阴性对照所观察到的mRNA水平相比，给定基因的mRNA水平降低。
表2、3和4中的负变化倍数表示与阴性对照所观察到的mRNA水平相比，给定基因的mRNA水平降低。
结果证明，let-7表达改变了A549细胞中的558个基因(217个下调，341个上调)、HepG2细胞中的1035个基因(531个下调，504个上调)和HL-60细胞中的721个基因(441个下调，280个上调)的表达水平达至少两倍。
实施例3 LET-7的预测基因靶标 hsa-let-7a、hsa-let-7b和hsa-let-7g的结合的基因靶标用专有算法miRNATargetTM(Asuragen)进行预测，在表5中显示，所有数据库提交(databasesubmission)的内容通过引用其全文并入本文，如同在本申请的提交日提出。
表5.hsa-let-7a、hsa-let-7b和hsa-let-7g的靶标基因 下表6显示用前体miR hsa-let-7b转染后，在HepG2和A549细胞中显示出mRNA表达水平发生改变的预测基因靶标。
表6.用前体miR hsa-let-7b转染72小时后，在HepG2和A549细胞中显示出mRNA表达水平发生改变的预测hsa-let-7靶标


数据表明，hsa-let-7的这些预测靶标在hsa-let-7b转染到A549或HepG2细胞中72小时内，显示出mRNA表达水平发生改变。在这些实验条件下，有26个预测基因靶标在两种细胞类型中发生mRNA水平改变，另外37个预测基因靶标仅在HepG2细胞中发生mRNA水平改变，还有另外20个基因靶标仅在A549细胞中发生mRNA水平改变。
实施例4 A549和HEPG2细胞中受let-7误调节的基因的功能鉴定 hsa-let-7在A549和HepG2细胞中的过量表达，会导致众多与细胞分裂、细胞增殖和细胞周期相关的基因的误调节。这些基因、它们的基因产物和相关蛋白质功能的一览表在表7中显示。
表7.应答过量hsa-let-7的细胞周期基因、细胞分裂基因、细胞增殖基因和DNA合成/复制基因、基因产物和基因功能。




这些数据表明hsa-let-7是细胞周期进展的关键调节物。许多hsa-let-7应答基因是已知的癌基因，或者在肿瘤中过量表达。很可能的是，在hsa-let-7缺失或者hsa-let-7表达减低的癌细胞中，许多这些基因会被上调，这很可能会刺激细胞周期和DNA合成，从而刺激细胞分裂。
虽然大多数的经改变的细胞周期基因在应用bsa-let-7后显示出表达减低，但在相同条件下有少数的细胞周期基因被上调，这表明了hsa-let-7应用的第二种或第三种作用。这些基因(表7)包括编码CDK抑制剂2B(CDKN2B)、MAX相互作用蛋白1(MXI1，一种能拮抗MYC的转录调节物)和细胞周期蛋白G2(CCNG2，在甲状腺乳头状癌中被下调(Ito等人，2003)，这表明在肿瘤细胞中它具有充当肿瘤拮抗剂的倾向)的那些基因。在let-7缺陷型肿瘤细胞中，这三种基因很可能会被下调，而这极有可能会使它们的肿瘤抑制功能丧失。
Hsa-let-7的添加阻遏了多种已知的和推定的肿瘤抑制基因(表7)的表达，这些基因例如BRCA1、BRCA2、FANCD2、PLAGL1、E2F6、E2F8及细胞周期检验点基因CHEK1、BUB1、BUB1B、MAD2L1和CDC23。
实施例5 HSA-LET-7直接靶向的基因的鉴定 hsa-let-7直接靶向的基因，在hsa-let-7给予细胞后72小时前可显示出表达发生改变。因此，本发明人分析了在如实施例1所述进行hsa-let-7转染后第4、8、16、24、36、48、72和128小时收获的HepG2细胞中的基因表达。将AffymetrixU133加2GeneChips用于时间进程研究，并用Affymetrix MAS 5.0算法作为标度(scaling)(数值设定至500)和汇总方法(summarization method)(AffymetrixStatistical Algorithms Description Document Part Number 701137 Rev 3)进行处理。由于时间进程研究是非重复的(unreplicated)，因此采用在Affymetrix GCOS 1.4软件中执行的威氏符号秩检验(Wilcoxon Signed Rank test)(Wilcoxon，1945)，来确定那些相对于时间0来说差异表达的基因。弃去那些经计算在100％的时间点中都不存在的基因。
hsa-let-7转染36小时内，167个基因被下调，将它们称为早期受阻遏基因(表8)。早期受阻遏基因包括上表13中所列的那些细胞周期基因中的多个(例如CCNA2、CDC25A、CDK8、SKP2、AURKA/STK6)，以及另外的其表达水平早期受阻遏但到72小时为止就恢复到正常水平的基因(例如CDC16、CDK6)。在167个早期受阻遏的基因中，有125个基因在16小时时或16小时前开始显示被下调，32个基因在16-24小时之间开始显示被下调，还有10个基因在24-36小时之间开始显示被下调。除了E2F6之外，还有几个转录因子，包括ID2、CBFB、ZNF336、SMAD4、SOX9、NR1H4、ARID3A、PLAGL2、YAP1和GTF2I，也属早期受阻遏基因。很可能这些基因将let-7作用传播到它们的下游靶标。例如，MCM和RFC DNA合成复合物的多个成员仅在较后的时间点受阻遏，可能是这些转录因子的靶标。
表8.用hsa-let-7b转染HepG2细胞后的早期受阻遏基因





实施例6 具有LET-7互补位点的HSA-LET-7早期阻遏基因的鉴定 对let-7早期受阻遏基因和36小时后受阻遏的基因的3’非翻译区(3’UTRs)进行了检测，确定在经确认的let-7靶标基因中是否存在显示let-7互补位点(LCS)的特征的序列(Johnson等人，2005；Reinhart等人，2000；Grosshans等人，2005；Lin等人，2003；Slack等人，2000；Vella等人，2004a；Vella等人，2004b)。结果在下表9中显示。
表9.具有let-7互补位点(LCS)的Hsa-let-7阻遏的基因 至少有25个早期受阻遏基因在它们的3’UTR中含有LCS，很可能代表着直接let-7靶标。这一组包括细胞周期调节因子CDK6、CDC25A、AURKA/STK6、CDCA7，DNA合成调节因子RRM2和转录因子CBFB、PLAGL2、E2F6、SOX9、ZNF336、YAP1、GTF2I和ARID3A。另外，其他的在它们的3’UTR中具有LCS的细胞周期基因，在36小时后受到阻遏(E2F5、CDC34、CCNF、CCNJ)，这提示后期受阻遏基因也是直接let-7靶标。不含LCS的、在let-7添加时其表达发生改变的基因，很可能是受let-7表达间接影响的下游基因，或许是作为受let-7直接影响的转录因子的下游靶标。
实施例7 A549和HEPG2细胞中被HSA-LET-7表达改变的基因途径 miRNA可直接影响它们的靶标基因的mRNA水平，在结合靶标mRNA而发生翻译调节后也会直接影响蛋白质水平。翻译调节导致蛋白质表达的向上或向下变化可导致下游基因产物和基因的活性和表达的变化，进而这些基因产物和基因的活性和表达受这些蛋白质的调节。这些调节作用表现为总mRNA表达谱的变化。确定了受hsa-let-7表达所诱导的调节级联影响的细胞途径的类型(identity)和特性。细胞途径分析是用Ingenuity Pathways Analysis(Ingenuity

Systems，Redwood City，CA)进行。表10中显示了在A549和HepG2细胞中hsa-let7b过量表达后最显著受影响的途径。
表10.A549和HepG2细胞中hsa-let7b过量表达后显著受影响的功能细胞途径


用来自HepG2细胞的基因表达数据，通过将差异表达的基因按它们的生物功能进行归类，和使用基因本体(Gene Ontology)(GO)数据库(Ashburner等人，2000)，进行了另外的细胞途径分析。HepG2细胞中最显著受影响的基因本体类别，显示在表11(如实施例1所述在hsa-let-7过量表达72小时后)和在表12(如实施例5所述在hsa-let-7过量表达4-108小时后)中。鉴定了其表达水平受影响大于2倍、p值低于0.05的mRNA，并用基因本体类别进行了归类。P值用超几何检验(hypergeometric test)进行计算，以确定当与阵列上呈现的所有基因相比时，基因本体类别中受影响的基因是否有显著富集。
表11.HepG2细胞中hsa-let-7过量表达72小时后最显著受影响的基因本体类别 表12.HepG2细胞中let-7过量表达4小时至108小时后最显著受影响的基因本体类别 这些数据证明，hsa-let-7会直接或间接影响许多细胞周期相关基因的表达，因此主要影响与细胞后期、细胞分裂和DNA复制有关的细胞功能途径。这些细胞过程在各种癌症的发生和进展中都具有必不可少的作用(integral role)。
实施例8 被HSA-LET-7改变的基因代表着癌症治疗的治疗靶标 增殖和存活途径在肿瘤中常被改变(Hanahan和Weinberg，2000)。本发明人已证实，hsa-let-7表达直接或问接调节多个细胞增殖基因。hsa-let-7直接调节少数关键的细胞周期原癌基因，从而控制细胞增殖途径。这些数据有力地支持let-7是肿瘤抑制miRNA的这一断言。
对let-7调节的基因和相关途径的综述表明，将hsa-let-7或抗hsa-let-7(抗miR)导入到多种癌细胞类型中，可能会产牛治疗反应。表13中显示对于各种恶性肿瘤的治疗具有预后和/或治疗价值的Hsa-let-7靶标。
表13.对于各种恶性肿瘤的治疗具有预后或治疗价值的Hsa-let-7靶标




缩写AC，星细胞瘤；ALL，急性淋巴细胞性白血病；甲型地中海型贫血，甲型地中海型贫血；AML，急性髓性白血病；AS，血管肉瘤；BC，乳腺癌；BL，伯基特淋巴瘤；BldC，膀胱癌；CeC，子宫颈癌；CHN，头颈癌；CLL，慢性淋巴细胞性白血病；CML，慢性髓母细胞性白血病；CRC，结肠直肠癌；EC，子宫内膜癌FS，纤维肉瘤；G，神经胶质瘤；GB，成胶质细胞瘤；GBM，多形性成胶质细胞瘤；GC，胃癌；GI，胃泌素瘤；HB，肝母细胞瘤；HCC，肝细胞癌；HL，霍奇金淋巴瘤；KS，卡波济氏肉瘤；L，白血病LC，肺癌Lj，脂肪瘤；LM，平滑肌瘤；LMS，平滑肌肉瘤；LxC，喉癌；M，黑素瘤；MB，髓母细胞瘤；MFS，黏液纤维肉瘤；ML，髓性白血病；MM，多发性骨髓瘤；MT，间皮瘤；NB，成神经细胞瘤；NHL，非霍奇金淋巴瘤；NSCLC，非小细胞肺癌；OC，卵巢癌；OecP，食道癌OrpC，口咽癌；OS，骨肉瘤；PaC，胰腺癌；PapC，乳头状癌；PC，前列腺癌；PML，前髓细胞性白血病；RB，成视网膜细胞瘤；RCC，肾细胞癌；RMS，横纹肌肉瘤；SCCHN，头颈鳞状细胞癌；SGT，唾液腺肿瘤；SIC，小肠癌；SPRC，散发性乳头状肾癌；TC，甲状腺癌；TCL，T细胞白血病；UC，尿路上皮癌 这些靶标是血管发生、染色体稳定性、细胞黏附、侵入、细胞周期进展、转录、DNA复制和胞内信号转导的关键调节物。Hsa-let-7会在不同的层面(layer)影响胞内信号转导，和控制分泌蛋白、跨膜生长因子受体以及细胞质信号转导分子的表达。分泌蛋白有成纤维细胞生长因子结合蛋白(FGFBP1)、胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP1)和炎性趋化因子白细胞介素8(IL8)。FGFBP1是一种以无活性形式储藏在胞外基质中的硫酸肝素蛋白聚糖上的分泌蛋白(Tassi等人，2001；Abuharbeid等人，2006)。它对FGF-1和FGF-2具有高亲和力，作为伴侣蛋白(chaperone)起作用来调动局部储藏的FGF。因此，FGFBP1是FGF的正向调节物，可增强FGF信号转导和血管发生(Tassi等人2001)。FGFBP1表达是高度组织特异性的，在大多数正常的成人组织中不存在。然而，FGFBP1在包括乳腺、结肠和前列腺的癌症的各种类型的癌症中过量表达(Abuharbeid等人2006)。高的FGFBP1表达与肿瘤发育的早期阶段有关，有助于肿瘤血管发生。类似地，IL-8在各种癌症中往往被上调，与肿瘤血管形成、转移和不良预后相关(Sparmann等人，2004；Rosenkilde等人，2004)。
hsa-let-7调节的膜相关蛋白质有Met(MET)、转化生长因子-β受体3(TGFBR3)、ERBB3和Ras相关结构域家族蛋白2(RASSF2)。RASSF2是一种候选肿瘤抑制物，它在肺肿瘤细胞系中常常被下调(Vos等人，2003)。RASSF2能与K-Ras发生相互作用，促进细胞周期阻滞和凋亡。Met作为肝细胞生长因子(HGF)的受体起作用，已作为癌基因从化学转化的人细胞系分离出来(Cooper等人，1984；Dean等人，1985)。Met激活的突变存在于散发性乳头状肾癌、儿童肝细胞癌和胃癌(Danilkovitch-Miagkova等人，2002)。这些体细胞突变与各种癌的侵袭性提高和广泛转移有关。在几种其他的癌症类型中，自分泌和旁分泌机制会导致Met信号转导的激活。但是，最常见的Met激活机制，是出现在结肠直肠癌、肝细胞癌、胃泌素瘤以及胃、胰腺、前列腺、卵巢和乳腺的癌中的过量表达(Boccaccio等人，2006)。Met过量表达与转移性肿瘤表型和不良预后相关(Birchmeier等人，2003).ERBB3(也称HER-3)属于EGFR的蛋白质家族，是禽类v-Erb癌蛋白的同源物(Hynes等人，2005)。与EGFR相反，ERBB3仅当与其他EGFR成员如ERBB2复合成异型二聚体时才传输有丝分裂信号。各种癌症类型都显示出ERBB3水平提高，从而显示EGFR途径的激活(表13)。TGFBR-3是推定的肿瘤抑制物，响应TGF-β而传输信号。TGF-β的一般作用，是抑制多种细胞类型如上皮细胞、内皮细胞、造血细胞、神经细胞和间充质细胞的细胞生长。TGFBR-3也称β-聚糖，能以高亲和力结合所有三种TGF-β同种型。TGFBR-3能与TGFBR-2发生缔合，以向下游效应分子进行信号转导(Blobe等人，2001)。TGFBR-3在多种癌症类型中常被下调(Hishikawa等人，1999；Lin等人，2005)。PRKCA是一种胞质(cytosolic)信号转导分子，属于应答受体酪氨酸激酶所诱导的信号转导而被激活的丝氨酸-苏氨酸激酶的家族。功能研究提示，PKC在癌发生和恶性表型的维持中起到作用(Karakaidos等人，2004；Koivunen等人，2006)。PRKCA在子宫内膜、前列腺和恶性(high grade)泌尿膀胱癌(Koivunen等人2006)中过量表达。PRKCA活性与癌细胞迁移率和侵袭性的增加有关联，这种表型可通过PRKCA抑制来逆转(Koivunen等人，2004)。
hsa-let-7调节的另一类基因和它们的相应蛋白质，在细胞周期的进展中起作用。这些蛋白质中有一些在通过G1期和S期的转变中是关键的，如细胞周期蛋白A2和E2(CCNA2、CCNE2)、细胞周期蛋白依赖性激酶2和6(CDK2、CDK6)、CDK抑制剂CDKN2B、CDC25A和细胞分裂周期6(CDC6)。其他的蛋白质是通过G2/M纺锤体的检验点进展和在有丝分裂过程中姊妹染色单体正确分离以维持染色体稳定性所必需的。这些蛋白质包括Aurora激酶A和B(AURKA，亦称STK6；AURKB，亦称STK12)、乳腺癌1和2(BRCA1；BRCA2)、不受苯并咪唑抑制的出芽1(budding uninhibited by benzimidazoles 1)(BUB1)、不受苯并咪唑抑制的出芽1β(BUB1B)、polo样激酶1(PLK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1，亦称CDC2)、细胞周期蛋白B1和细胞分裂周期20和23(CDC20、CDC23，亦称后期促进复合物亚单位8)。大多数这些转录物受调节的方式提示，hsa-let-7会阻断细胞周期进程。所有这些靶标也在癌发生中具有明显的作用。例如，肿瘤抑制蛋白BRCA1和BRCA2以及促进生长的Aurora激酶A和B，在各种实体瘤中显示其表达被去调节，所述实体瘤例如乳腺、卵巢、甲状腺、肺、前列腺和结肠直肠的癌(Chieffi等人，2006；Keen等人，2004；Smith等人，2005；Ulisse等人，2006；Wooster等人，2003；Turner等人，2004)。Aurora激酶在药物工业中是优选的药物靶标。PLK1(也称丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶13；STPK13)，是一种调节有丝分裂纺锤体功能以保持染色体稳定性的蛋白激酶(Strebhardt等人，2006)。PLK1表达在细胞周期过程中受到严格调节，在M期达到高峰。PLK1本质上是致癌的，会直接抑制p53的肿瘤抑制功能(Ando等人，2004)。PLK1的过量表达会诱导多核表型(polynucleated phenotype)和NIH3T3细胞的细胞转化(Mundt等人，1997；Smith等人，1997)。同样，PLK1在包括乳腺、结肠、肺、胃和前列腺的癌的大多数实体瘤中，显示出表达水平提高(表13)。PLK1过量表达与疾病进展有关，当它耗竭时可诱导癌细胞的凋亡(Strebhardt等人2006；Liu等人，2003)。目前，PLK1正作为未来治疗干预用的各种小分子抑制剂的靶标试验(Strebhardt等人2006)。CDC6是响应促有丝分裂信号，通过涉及E2F蛋白的转录控制机制而受调节的，是哺乳动物细胞中DNA复制的起始所必需的。CDC6在各种人类癌症中过量表达，具有内在的致癌潜力(Karakaidos等人2004；Gonzalez等人，2006；Murphy等人，2005；Semple等人，2004)。细胞周期蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的辅因子(Malumbres等人，2001)。细胞周期蛋白的表达在细胞周期过程中受到严格控制，以调控各个CDK的活性。细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白E2在S期与CDK2发生缔合；细胞周期蛋白D1是G1期中CDK4/6的主要辅因子。由于大多数的细胞周期蛋白是细胞生长的促进物，细胞周期蛋白如细胞周期蛋白A2、B1或E2常常在各种肿瘤类型中高水平表达(Egloff等人，2006；Payton等人，2002；Payton等人，2002；Qian等人，2002)。CDK6能与包括D1、D2和D3的D型细胞周期蛋白形成活性复合物。CDK2和CDK6的主要功能是使成视网膜细胞瘤蛋白家族的各成员失活。CDK2和CDK6在多种癌症中过量表达，目前被作为潜在的癌症药物靶标进行研究(Malumbres等人2001；Cipriano等人，1998；Costello等人，1997；Hayette等人，2003；Lam等人，2000；Marone等人，1998；Mendrzyk等人，2005；Yamamoto等人，1998)。CDK1(CDC2)是被称为M期促进因子的蛋白激酶复合物的催化型亚单位，该因子能诱导向进入有丝分裂，在真核生物当中是普遍存在的。CDK1的激活需要与B细胞周期蛋白的结合和CDC25进行的去磷酸化。与其他CDK相似，CDK1在各种癌症中其表达水平提高(表13)。CDC25蛋白磷酸酶家族，在通过保守苏氨酸15和酪氨酸15抑制性磷酸化位点的去磷酸化来激活细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)中，起到关键的作用。虽然CDC25C主要负责激活CDK1以克服G2/M检验点和使得可以进入有丝分裂，但CDC25A的主要底物是CDK2和CDK6，该底物当有活性时能使得可以前进通过G1/S和S检验点内(Kristjansdottir等人，2004)。CDC25A在包括乳腺、肺、直肠和大脑的癌症的人类癌症中，常常被扩增和过量表达(Kristjansdottir等人2004)。其他间接控制细胞周期进展的受hsa-let-7调节的分子是SKP2和PDCD4(程序性细胞死亡4)。Skp2是多亚单位E3泛素连接酶复合物的一个成分，该复合物对蛋白质打上标志以进行蛋白酶体降解。一个得到很好表征的靶标是CDK抑制剂p27，它解释了Skp2的促细胞周期活性(Carrano等人，1999)。Skp2本质上是致癌的，在各种癌症类型中显示出升高的水平(Gstaiger等人，2001；Einama等人，2006；Kamata等人，2005；Saigusa等人，2005)。PDCD4是响应正常细胞中的凋亡而被诱导的肿瘤抑制物。PDCD4的生长抑制特性，是由PDCD4介导的c-Jun原癌蛋白的抑制、帽依赖性mRNA翻译的抑制和p21Waf1/Cip1 CDK抑制剂的激活所致(Bitomsky等人，2004；Goke等人，2004；Yang等人，2003)。PDCD4在例如神经胶质瘤、肝细胞癌、肺细胞癌和肾细胞癌的各种人类恶性肿瘤中，常常显示出表达减低或丧失(Gao等人，2007；Jansen等人，2004；Zhang等人，2006)。PDCD4的表达干扰小鼠模型中的皮肤癌发生，和抑制人结肠癌细胞的生长(Jansen等人，2005；Yang等人，2006)。PDCD4的损失还与肺肿瘤进展相关(Chen等人，2003)。
Hsa-let-7还调节波形蛋白(VIM)和脂肪酸合酶(FASN)。波形蛋白是间充质细胞的主要中间丝蛋白，调控着在附着、迁移和细胞信号转导方面重要的蛋白质。波形蛋白通过调节整联蛋白功能而在粘附方面具有关键作用。波形蛋白在人类恶性肿瘤中往往以高水平表达，这与侵袭和低存活率相关(Caselitz等人，1983；Churg 1985；Upton等人，1986；Gilles等人，1996；Islam等人，2000；Ngan等人，2007；Sommers等人，1992；Singh等人，2003)。RNA干扰下调波形蛋白表达抑制癌细胞迁移和黏附(Mclnroy等人，2007)。FASN常称为FAS，是人类基因组中能够从乙酰-CoA、丙二酰基-CoA和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)进行长链脂肪酸的还原性从头合成的唯一蛋白质(Kuhajda 2006)。FAS在各种癌细胞中水平升高和有活性。由于脂肪酸合成消耗能量，FAS表达可能赋予人类癌细胞一定的存活或生长益处。FAS表达与患有肺癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌和软组织肉瘤的患者的不良预后相关，能预示前列腺癌的复发(Kuhajda2006)。
总之，let-7可控制多种在疾病的发生或进展中起到关键作用的癌基因。这些靶标在人类癌症中常常被去调节。基于这一对受hsa-let-7调节的基因和相关途径的评述，将hsa-let-7或抑制性的抗hsa-let-7(抗miR)导入到多种癌细胞类型中，很可能会产生治疗反应。
实施例10 递送合成的HSA-LET-7能抑制肺癌细胞的增殖 本发明人之前证明，hsa-let-7参与到多种细胞活性的调节，这些细胞活性代表着癌症疗法和其他疾病和病患的疗法的干预点(2005年5月31日提交的美国专利申请系列号11/141,707和2005年11月14日提交的系列号11/273,640)。例如，视细胞类型而定，hsa-let-7的过量表达可增加或降低某些正常细胞系或癌性细胞系的增殖和/或活力，且let-7在细胞中的过量表达还可诱导细胞周期特定阶段的显著的转变或背离。
有效治疗方案的开发，需要能证明治疗剂在各种癌症模型和代表同一疾病的多个癌细胞系中的功效和效用的证据。本发明人通过用六个非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系测量细胞增殖，评估了hsa-let-7对肺癌的治疗作用，这六个细胞系包括衍自肺腺癌的细胞(A549、H838、Calu-3、HCC2935)、衍自肺鳞状细胞癌的细胞(H226)和衍自肺腺鳞状细胞癌的细胞(H596)。本发明人还测量了衍自肺大细胞癌的细胞(H460)的增殖。各癌细胞系是获自美国模式培养物保藏所(ATCC，Manassas，VA，USA)。合成的hsa-let-7b、hsa-let-7c或hsa-let-7g(前体miRTM-hsa-let-7，Ambion目录号AM17100)或者阴性对照(NC)miRNA(前体miRTM微小RNA前体分子-阴性对照#2；Ambion目录号AM17111)，通过基于脂质的转染递送到A549、H838、Calu-3、HCC293和H460细胞中，和通过电穿孔递送到H226细胞中。基于脂质的反转染是按照公布的方案(Ovcharenko等人，2005)和以下参数一式三份进行5000-12000个细胞/96孔；在20μl OptiMEM(Invitrogen)中的0.1-0.2μl脂质转染胺TM 2000(目录号11668-019，InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)；100μl的30nM终浓度的miRNA。转染后72小时收获A549、H838、H460、H596和HCC2935细胞，以评估细胞增殖；Calu-3细胞在转染后10天分析。增殖测定是用Alamar Blue(Invitrogen)按照生产商说明书进行。使用抗驱动蛋白11(也称Eg5)这个动力蛋白的siRNA，作为细胞增殖抑制的对照。Eg5对于大多数真核细胞的细胞存活是必需的，缺乏它的话会导致细胞增殖降低和细胞死亡(Weil等人，2002)。siEg5按应用于miRNA的相同实验参数用于基于脂质的转染中。本发明人还使用了终浓度为10μM和50μM的拓扑异构酶II抑制剂依托泊苷，作为miRNA的效价的内标。依托泊苷是经FDA批准的用于治疗肺癌的拓扑异构酶II抑制剂。已报道了各种肺癌细胞的IC50值，对于SCLC和NSCLC细胞，其范围在＜1-25μM之间(Ohsaki等人，1992；Tsai等人，1993)。将得自Alamar Blue测定的增殖百分数值(％)用从阴性对照miRNA(NC)处理的细胞得到的数值归一化。hsa-let-7处理的细胞相对于阴性对照miRNA处理的细胞(100％)的增殖百分数显示在下表14和图1中。
hsa-let-7b、hsa-let-7c或hsa-let7-g的递送能抑制肺癌细胞A549、H838、Calu-3、HCC2935、H596和H460的细胞增殖(表14和图1)。三个let-7成员即hsa-let-7b、hsa-let-7c和hsa-let-7g的抑制活性在所有受试的细胞系中相似，这提示这些miRNA的作用是冗余的。平均来说，hsa-let-7能抑制细胞增殖达26％(表14和图1)。Hsa-let-7b、hsa-let-7c和hsa-let-7g在H460细胞中具有最大抑制活性，分别降低增殖达68％、37％和43％。hsa-let-7的生长抑制活性与浓度＞10μM的依托泊苷的生长抑制活性相当。由于hsa-let-7在所有受试的肺癌细胞中能诱导治疗反应，hsa-let-7可对患有肺癌和其他恶性肿瘤的患者提供治疗益处。
本发明人通过将hsa-let-7b或阴性对照miRNA，以0pM-3000pM的递增浓度给予H460细胞，测定了hsa-let-7的灵敏性和特异性(表15和图2)。miRNA的递送和细胞增殖的评估是如上所述进行。将得自Alamar Blue测定的增殖数值用从模拟品转染的细胞获得的数值(0pM＝100％增殖)归一化。阴性对照miRNA(NC)数量的增加对H460细胞的细胞增殖没有影响(表15和图2)。相反，hsa-let-7b的生长抑制表型是剂量依赖性的，与hsa-let-7b数量的增加相关(表15和图2)。Hsa-let-7b在低至300pM的浓度下也能诱导特异性的治疗反应。

表15.hsa-let-7b对H460肺癌细胞系的细胞增殖的剂量依赖性抑制。各数值对从模拟品转染的细胞获得的数值(0pM miRNA)归一化。NC，阴性对照miRNA；％SD，标准偏差。

为评估在长时间里的hsa-let-7的抑制表型，本发明人用H226细胞进行了在hsa-let-7存在下长达21天的生长曲线实验。由于裸干扰RNA如合成的miRNA的体外转染在本质上是短暂的，且因不断进行的细胞分裂过程中寡核苷酸的稀释而受到削弱，因此在多个时间点通过电穿孔给予hsa-let-7b(Bartlett等人，2006，Bartlett等人，2007)。用1.6μM合成的hsa-let-7b(前体miRTM-hsa-let-7b，Ambion目录号AM17100)或阴性对照miRNA(前体miRTM微小RNA前体分子阴性对照#2；Ambion目录号AM17111)，使用Gene Pulser XcellTM电穿孔系统(BioRad Laboratories，Inc.；Hercules，CA，USA)(第0天)和以下设置对相等数量的H226细胞进行电穿孔200μl OptiMEM(Invitrogen)(1.6μM miRNA)中，5μghsa-let-7b，＞0-20×106个细胞，250V单方波脉冲5ms。将经电穿孔的细胞(106)在常规生长培养基中接种和繁殖。在第6、10和17天，重复收集、计数和用1.6μM hsa-let-7b或阴性对照miRNA电穿孔细胞。在第6天电穿孔后，所有细胞都再接种到培养皿上。在第10天和第17天，将实际细胞计数的50％(用hsa-let-7b处理的细胞)或25％(阴性对照miRNA处理的细胞)进行电穿孔并繁殖，以提供指数细胞生长。将这些电穿孔事件的细胞计数外推并绘制在线性刻度上。
如图3所示，在21天时间里，以4-7天时间间隔给予细胞四个等剂量的合成hsa-let-7b miRNA，相对于接受阴性对照miRNA的细胞，导致了H226细胞生长的大约85％抑制。数据提示，多次给予hsa-let-7b能增强let-7 miRNA的治疗作用，并支持之前的数据，这表明了hsa-let-7 miRNA的治疗潜力。
实施例11 HSA-LET-7与特异性人微小RNA组合能协同抑制肺癌细胞系的增殖 miRNA在多个控制多种细胞过程的途径中起作用。癌细胞常常在几个不同的途径中显示异常，这决定着它们的致癌特性。因此，将多个miRNA给予癌症患者，可产生出优于给予单个miRNA的治疗益处。本发明人将hsa-let-7b、hsa-let-7c或hsa-let-7g与hsa-miR-34a、hsa-miR-124a、hsa-miR-126或hsa-miR-147(前体miRTM miRNA，Ambion目录号AM17100)同时给予，评估了这些成对miRNA组合的功效。H460肺癌细胞一式三份用终浓度为300pM的每个miRNA进行短暂反转染，导致产生了600pM的总寡核苷酸。对于阴性对照，使用了600pM的前体miRTM微小RNA前体分子阴性对照#2(Ambion目录号AM17111)。为将各个组合的作用与单独的miRNA的作用关联起来，还将300pM的每个miRNA与300pM阴性对照miRNA进行组合。反转染使用以下参数7,000个细胞/96孔，20μl OptiMEM(Invitrogen)中0.15μl脂质转染胺TM 2000(Invitrogen)，100μl总转染体积。作为miRNA的效价的内对照，在转染后24小时，将依托泊苷以10μM和50μM加到模拟品转染的细胞保持48小时。在转染后72小时收获细胞，进行Alamar Blue测定(Invitrogen)。将得自Alamar Blue测定的增殖百分数值，对从用600pM阴性对照miRNA处理的细胞获得的增殖百分数值归一化。数据以相对于阴性对照miRNA处理的细胞的增殖百分数(％增殖)表示(表16)。
300pM hsa-let-7的转染能减少H460的增殖达30.57％(表16和图4)。成对组合(例如hsa-let-7加hsa-let-7g)的加和活性，定义为大于每个miRNA的单独活性的活性(例如，hsa-let-7b加hsa-miR-126的活性大于hsa-let-7b加NC所观察到的活性，且hsa-let-7b加hsa-miR-126的活性大于hsa-miR-126加NC所观察到的活性)。成对组合的协同活性，定义为大于每个miRNA的单独活性之和的活性(例如，hsa-let-7b加hsa-miR-34a的活性大于所观察到的hsa-let-7b加NC的活性与hsa-miR-34a加NC的活性的之和)。数据表明，hsa-let-7c或hsa-let-7g与hsa-miR-34a、hsa-miR-124a、hsa-miR-126、hsa-miR-147或hsa-let-7b进行组合，能导致协同活性(表16和图4)。因此，将hsa-let-7与其他miRNA的组合给予癌症患者，可在肺癌的治疗中引起较佳的治疗反应。miRNA的组合使用代表着癌症和其他疾病的潜在有用的疗法。
表16.H460肺癌细胞在成对的hsa-let-7miRNA组合存在下的细胞增殖。各数值对从用600pM阴性对照(NC)miRNA转染的细胞获得的数值归一化。SD，标准偏差；S，协同作用；A，加和作用。
实施例12 递送合成的HSA-LET-7能抑制小鼠中肺癌细胞的肿瘤生长 本发明人评估了hsa-let-7b在生长于免疫缺陷小鼠的人肺癌异种移植物中的生长抑制活性。Hsa-let-7b通过电穿孔递送到A549肺癌细胞中，使用的是GenePulser XcellTM(BioRad)，设置如下200μl OptiMEM中，5μg miRNA，15×106个细胞，150V单方波脉冲10ms。作为阴性对照，A549细胞如上所述用阴性对照(NC)miRNA(前体miRTM微小RNA前体分子阴性对照#2；Ambion目录号AM17111)进行电穿孔。为评估hsa-let-7b的抗癌活性，给一组4只动物注射A459。将经电穿孔的细胞(5×106)与BD MatrigelTM，(BD Biosciences；San Jose，CA，USA；目录号356237)以1∶1比例混合，皮下注射到NOD/SCID小鼠(Charles RiverLaboratories，Inc.；Wilmington，MA，USA)的胁腹(第0天)。将NC miRNA处理的细胞注射到同一动物对面胁腹，以监控动物间变异性。一旦肿瘤达到可测量的大小(第12天)，每天或每隔一天测定肿瘤的长度和宽度达18天。肿瘤体积用公式体积＝长度x宽度x宽度/2计算，其中长度大于宽度。将得自NC处理细胞和hsa-let-7b处理细胞的肿瘤体积取平均值并对时间作图(图5)。p值＜0.05(表示统计学显著性)的数据点用星号表示(第12-19天)。
将hsa-let-7b给予到A549肺癌异种移植物中，抑制了体内肿瘤生长(图5)。接受阴性对照miRNA的癌细胞，比hsa-let-7b处理的细胞更快地发展肿瘤。将hsa-let-7b给予到A549细胞中抑制和延迟了肿瘤生长的起始。
这些数据提示，hsa-let-7代表着肺癌和潜在的其他疾病的治疗中特别有用的候选者。
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安德里斯.G.巴德
弗兰克.J.斯莱克
大卫.布朗
德米特里.奥弗切兰柯
凯文.克尔纳尔
<120>LET-7微小RNA的功能和靶标
<130>ASUR020WO
<140>未知
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<151>2006-12-29
<150>60/869,295
<151>2006-12-08
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<170>Patentln version 3.3
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cuggcugagg uaguaguuug ugcuguuggu cggguuguga cauugcccgc uguggagaua60
acugcgcaag cuacugccuu gcua 8权利要求
1.一种调节细胞中的基因表达的方法，所述方法包括给予该细胞一定量的包含let-7核酸序列的分离核酸，所述let-7核酸序列的量足以调节受let-7miRNA家族成员调节的基因的表达。
2.权利要求1的方法，其中所述受调节的基因包含表2、3、4、5、6、7、8和9中所示的一个或多个基因。
3.权利要求2的方法，其中基因的表达被下调。
4.权利要求2的方法，其中基因的表达被上调。
5.权利要求2的方法，其中受调节的基因包含ATRX、AURKA/STK6、AURKB/STK12、BRCA1、BRCA2、BUB1、BUB1B、BZRP、CCNA2、CCNB1、CCNE2、CCNG2、CDC2、CDC20、CDC23、CDC25A、CDC6、CDCA7、CDK2、CDK6、CDKN2B、CDT1、CEBPD、CKS1B、CSF1、EIF4E、EPHB2、ERBB3、FASN、FGFBP1、FGFR4、FH、GMNN、IGFBP1、IL8、ITGA6、JUN、JUNB、LHFP、MCAM、MET、MVP、MXI1、MYBL1、MYBL2、NRAS、P8、PDCD4、PLK1、PRKCA、RASSF2、SIVA、SKP2、SMAD4、TACC3、TFDP1、TGFBR3、TNFSF10或VIM中的一个或多个。
6.权利要求5的方法，其中受调节的基因是ATRX、AURKA/STK6、AURKB/STK12、BRCA1、BRCA2、BUB1、BUB1B、BZRP、CCNA2、CCNB1、CCNE2、CCNG2、CDC2、CDC20、CDC23、CDC25A、CDC6、CDCA7、CDK2、CDK6、CDKN2B、CDT1、CEBPD、CKS1B、CSF1、EIF4E、EPHB2、ERBB3、FASN、FGFBP1、FGFR4、FH、GMNN、IGFBP1、IL8、ITGA6、JUN、JUNB、LHFP、MCAM、MET、MVP、MXI1、MYBL1、MYBL2、NRAS、P8、PDCD4、PLK1、PRKCA、RASSF2、SIVA、SKP2、SMAD4、TACC3、TFDP1、TGFBR3、TNFSF10和VIM。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞是在患有、怀疑患有以下疾病或者有发展以下疾病的危险的受治疗者中代谢性疾病、免疫疾病、感染性疾病、心血管疾病、消化疾病、内分泌疾病、眼睛疾病、泌尿生殖器疾病、血液疾病、肌肉骨骼疾病、神经系统疾病、先天性疾病、呼吸疾病、皮肤疾病或癌性疾病或病症。
8.权利要求7的方法，其中所述感染性疾病或病症是寄生虫感染、细菌感染、病毒感染或真菌感染。
9.权利要求7的方法，其中所述细胞是在患有、怀疑患有以下疾病或者有发展以下疾病的危险的受治疗者中急性淋巴细胞性白血病；急性髓性白血病；甲型地中海型贫血；血管肉瘤；星细胞瘤；乳腺癌；膀胱癌；伯基特淋巴瘤；子宫颈癌；头颈癌；慢性淋巴细胞性白血病；慢性髓母细胞性白血病；结肠直肠癌；子宫内膜癌；纤维肉瘤、神经胶质瘤；成胶质细胞瘤；多形性成胶质细胞瘤；胃癌；胃泌素瘤；肝母细胞瘤；肝细胞癌；霍奇金淋巴瘤；卡波济氏肉瘤；喉癌；白血病；肺癌；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；脂肪瘤；黑素瘤；髓母细胞瘤；髓性白血病；间皮瘤；黏液纤维肉瘤；多发性骨髓瘤；成神经细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；卵巢癌；食道癌；口咽癌；骨肉瘤；胰腺癌；乳头状癌；前列腺癌；前髓细胞性白血病；肾细胞癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；散发性乳头状肾癌；头颈鳞状细胞癌；唾液腺肿瘤；小肠癌；T细胞白血病；甲状腺癌或尿路上皮癌，其中对一个或多个基因的调节足以引起治疗反应。
10.权利要求9的方法，其中治疗反应是癌细胞活力降低、增殖减少或转移减少。
11.权利要求1的方法，其中所述let-7核酸包含以下至少一个hsa-let-7a-1、hsa-let-7a-2、hsa-let-7a-3、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f-1、hsa-let-7f-2、hsa-let-7g、hsa-let-7i或者它们的片段。
12.权利要求1的方法，其中所述let-7核酸是let-7功能的抑制剂。
13.权利要求1的方法，其中所述细胞是上皮细胞、基质细胞或黏膜细胞。
14.权利要求1的方法，其中所述细胞是脑细胞、神经元细胞、血液细胞、子宫颈细胞、食道细胞、肺细胞、心血管细胞、肝细胞、乳腺细胞、骨细胞、甲状腺细胞、腺细胞、肾上腺细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、肾细胞、膀胱细胞、前列腺细胞、子宫细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、脾细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、心肌细胞或横纹肌细胞。
15.权利要求1的方法，其中所述细胞是癌细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述癌细胞是神经元细胞、神经胶质细胞、肺细胞、肝细胞、脑细胞、乳腺细胞、膀胱细胞、血液细胞、白血病细胞、结肠细胞、子宫内膜细胞、胃细胞、皮肤细胞、卵巢细胞、脂肪细胞、骨细胞、子宫颈细胞、食道细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、肾细胞、子宫细胞、睾丸细胞、上皮细胞、肌肉细胞、口咽细胞、肾上腺细胞、胃肠细胞、间皮细胞、唾液腺细胞、小肠细胞或甲状腺细胞。
17.权利要求1的方法，其中所述分离的let-7核酸是重组核酸。
18.权利要求17的方法，其中所述重组核酸是RNA。
19.权利要求17的方法，其中所述重组核酸是DNA。
20.权利要求19的方法，其中所述重组核酸包含let-7表达盒。
21.权利要求20的方法，其中所述表达盒包含在病毒载体或质粒DNA载体中。
22.权利要求21的方法，其中所述病毒载体以1×105-1×1014个病毒颗粒/剂量的剂量给予，或者所述质粒DNA载体以100mg/患者-4000mg/患者的剂量给予。
23.权利要求1的方法，其中所述let-7核酸是合成核酸。
24.权利要求23的方法，其中所述核酸以0.01mg/kg体重-10mg/kg体重的剂量给予。
25.权利要求1的方法，其中所述let-7是hsa-let-7。
26.权利要求1的方法，其中所述核酸经肠给予或胃肠外给予。
27.权利要求26的方法，其中经肠给予是口服给予。
28.权利要求26的方法，其中胃肠外给予是血管内、颅内、胸膜内、肿瘤内、腹膜内、肌肉内、淋巴内、腺内、皮下、局部、支气管内、气管内、鼻内、吸入或滴注给予。
29.权利要求1的方法，其中所述核酸包含在药物制剂中。
30.权利要求29的方法，其中所述药物制剂是脂质组合物。
31.权利要求29的方法，其中所述药物制剂是纳米颗粒组合物。
32.权利要求29的方法，其中所述药物制剂由生物相容性和/或生物可降解分子组成。
33.一种调节细胞途径或生理途径的方法，所述方法包括给予细胞一定量的包含let-7核酸序列的分离核酸，所述let-7核酸序列的量足以调节这样的细胞途径或生理途径，该细胞途径或生理途径包括表2、3、4、5、6、7、8和9中所示的一个或多个基因或者与一个或多个基因相关的基因产物。
34.权利要求33的方法，其中所述受调节的基因包含ATRX、AURKA/STK6、AURKB/STK12、BRCA1、BRCA2、BUB1、BUB1B、BZRP、CCNA2、CCNB1、CCNE2、CCNG2、CDC2、CDC20、CDC23、CDC25A、CDC6、CDCA7、CDK2、CDK6、CDKN2B、CDT1、CEBPD、CKS1B、CSF1、EIF4E、EPHB2、ERBB3、FASN、FGFBP1、FGFR4、FH、GMNN、IGFBP、IL8、ITGA6、JUN、JUNB、LHFP、MCAM、MET、MVP、MXI1、MYBL1、MYBL2、NRAS、P8、PDCD4、PLK1、PRKCA、RASSF2、SIVA、SKP2、SMAD4、TACC3、TFDP1、TGFBR3、TNFSF10或VIM中的一个或多个。
35.权利要求33的方法，其中所述let-7核酸包含以下至少一个hsa-let-7a-1、hsa-let-7a-2、hsa-let-7a-3、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f-1、hsa-let-7f-2、hsa-let-7g、hsa-let-7i或者它们的片段。
36.权利要求33的方法，所述方法还包括给予2、3、4、5、6个或更多个miRNA。
37.权利要求36的方法，其中所述miRNA包含在单一组合物中。
38.权利要求33的方法，其中至少有两个细胞途径或生理途径受调节。
39.权利要求36的方法，其中至少有一个基因受到多个miRNA的调节。
40.权利要求33的方法，其中基因或基因产物的表达被下调。
41.权利要求33的方法，其中基因或基因产物的表达被上调。
42.权利要求33的方法，其中所述细胞是癌细胞。
43.权利要求42的方法，其中所述癌细胞是肺癌细胞或肝癌细胞或急性髓性白血病细胞。
44.权利要求42的方法，其中所述细胞的活力降低，所述细胞的增殖减少，所述细胞的转移减少或者所述细胞对疗法的敏感性提高。
45.权利要求42的方法，其中所述癌细胞是神经元细胞、神经胶质细胞、肺细胞、肝细胞、脑细胞、乳腺细胞、膀胱细胞、血液细胞、白血病细胞、结肠细胞、子宫内膜细胞、胃细胞、皮肤细胞、卵巢细胞、脂肪细胞、骨细胞、子宫颈细胞、食道细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、肾细胞、子宫细胞、睾丸细胞、上皮细胞、肌肉细胞、口咽细胞、肾上腺细胞、胃肠细胞、间皮细胞或甲状腺细胞。
46.权利要求33的方法，其中所述分离的let-7核酸是重组核酸。
47.权利要求46的方法，其中所述重组核酸是DNA。
48.权利要求47的方法，其中所述重组核酸是病毒载体或质粒DNA。
49.权利要求33的方法，其中所述核酸是RNA。
50.权利要求46的方法，其中所述重组核酸是合成核酸。
51.一种治疗经诊断患有或者怀疑患有或者怀疑会发展与受到miRNA调节的基因有关的病理状况或疾病的患者方法，所述方法包括以下步骤
(a)给予该患者一定量的包含let-7核酸序列的分离核酸，所述let-7核酸序列的量足以调节细胞途径或生理途径；和
(b)给予第二疗法，其中对细胞途径或生理途径的调节使得该患者对该第二疗法敏感。
52.权利要求51的方法，其中一个或多个细胞途径或生理途径包括表2、3、4、5、6、7、8和9中所示的一个或多个基因。
53.一种选择给予患有、怀疑患有病理状况或疾病或者具有发展病理状况或疾病的倾向的受治疗者的miRNA的方法，所述方法包括
(a)测定选自表2、3、4、5、6、7、8和9的一个或多个基因的表达谱；
(b)基于所述表达谱，评估所述受治疗者对miRNA疗法的敏感性；和
(c)基于评估的敏感性选择一个或多个miRNA。
54.权利要求53的方法，所述方法进一步包括用1、2、4、5、6、7、8、9、10个或更多个miRNA治疗所述受治疗者。
55.权利要求54的方法，其中每个miRNA是单独给予或者以一个或多个组合给予。
56.权利要求55的方法，其中所述miRNA在单一组合物中。
57.一种评估细胞、组织或受治疗者的方法，所述方法包括在至少一个样品中评估let-7的表达与评估来自表2、3、4、5、6、7或8的一个或多个基因的表达相组合。
58.一种评估样品中的let-7状态的方法，所述方法包括以下步骤
(a)评估样品中来自表2、3、4、5、6、7、8或9的一个或多个基因的表达；
和
(b)基于所述样品中的let-7表达水平确定let-7状态。
全文摘要
本发明涉及治疗与可受let-7调节的基因或遗传途径的异常表达有关的疾病的方法和组合物，或者评估所述治疗的方法和组合物。所述方法可包括对患者评估受let-7调节的基因或遗传途径，和/或使用表达谱来评估患者的状况，或者用适当的miRNA治疗该患者。
文档编号C12N15/113GK101675165SQ200780051107
公开日2010年3月17日 申请日期2007年12月10日 优先权日2006年12月8日
发明者查尔斯·D·约翰逊, 麦克·拜罗姆, 安德里斯·G·巴德, 弗兰克·J·斯莱克, 大卫·布朗, 德米特里·奥弗切兰柯, 凯文·克尔纳尔 申请人:奥斯瑞根公司, 耶鲁大学