专利名称：一种微小rna实时定量pcr检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种微小RNA (MicroRNAs)实时定量PCR (聚合酶链式反应)检测的方法及其应用。
背景技术：
MicroRNAs (miRNAs)是进化上高度保守的长度约为22个核苷酸的小RNA，能以序列特异方式下调转录后的基因表达。多数miRNAs基因在核内先由RNA多聚酶II转录成pri-microRNA转录本；然后prinicroRNA在核内被核糖核酸酶Drosha和DGCR8加工处理，而最终成为长度约为70个核苷酸的莖环RNA (pre-microRNA) ；pre-microRNA随后被核输出蛋白exportin 5转运入胞质,接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21 25nt的RNA 二聚体，其中一条5’端有未配对碱基的RNA链为成熟miRNA，另一条RNA链则被降解。成熟miRNA可以结合RISC成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,miRISC)，miRISC与靶标mRNA互补配对，从而调控mRNA靶基因的表达。由于miCToRNAs在众多程序的调控，诸如生物发育、细胞增殖和凋亡以及近来被证明与肿瘤发生相关等领域发挥作用，因此miCToRNAs的定性和定量研究成为迅速发展的一大研究领域。目前用于microRNAs检测的方法主要有以下几种(I) Northernblotting,主要用于对克隆或生物信息学分析得到的microRNAs进行验证和确认，其主要缺点是灵敏度低且不能进行高通量检测；(2)定性RT-PCR，一般定性RT-PCR主要用于mi croRNA前体的检测,但是由于microRNAs分子序列较小,仅20nt左右,一般定性RT-PCR很难获得理想的实验结果；(3)基因芯片技术，可以同时对多个microRNAs分子进行高通量分析，但是其突出的弱点是其信息质量的稳定性和可重复性较差；(4)定量RT-PCR，既可以用于microRNA前体的检测，也可用于成熟microRNA的检测，可以用于对基因芯片识别的差异表达microRNAs进行验证和确认。已知的microRNA定量RT-PCR检测方法按照设计原理的不同又可以分为以下几类①长引物延伸RT-PCR :该方法的主要特点是设计长引物进行逆转录反应。其主要缺点是特异性较差；②加Poly(A)尾RT-PCR :该方法需要先通过poly (A)聚合酶在microRNA3’端加上poly (A)尾,然后通过oligo dT偶联引物进行逆转录反应，其缺点主要是增加了加Poly(A)尾反应步骤，实验可能受到的干扰因素相应增加，此外，由于其使用SYBR Green染料结合方法进行定量，因此需要严格进行条件优化，避免非特异性扩增造成的非特异性；(D stem-loop引物(茎环引物)定量RT-PCR :该方法的基本原理是先用茎环引物进行逆转录反应，而后应用microRNA特异的引物进行传统的TaqMan定量PCR反应，根据标准曲线对待测标本的目标microRNA进行定量。其主要特点是茎环引物设计，大大提高了方法学的特异性。其弱点是合成茎环引物的价格较高。
发明内容
本发明为了克服现有技术的缺陷和不足创造性地发明了一种微小RNA(MicroRNAs)实时定量PCR检测方法。该检测方法在高、中、低三个不同模板RNA浓度水平的批内、批间重复性较好，而且检测方法灵敏。为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现
一种微小RNA实时定量PCR检测方法，包括如下步骤
(1)设计与革EmicroRNA3’端互补的引物,进行逆转录反应,得到cDNA ；
(2)设计第一正向引物与CDNA5’端部分序列进行杂交，进行OverlapPCR反应，得到5’端延长有外源DNA序列的双链DNA产物；
(3)设计第二正向引物、特异的探针和反向引物，进行荧光定量PCR反应；
其中步骤(2)中所述第一正向引物长40 50bp，其3’端前15 20个碱基序列与靶microRNA5’ 端互补；
步骤(3)中设计的特异的探针序列位于革E microRNA经逆转录得到的cDNA与外源DNA序列连接部位。在优选实施例中，步骤(I)中所述逆转录引物长22 28bp，其3’端前6 8个碱基序列与靶microRNA3’端互补。在优选实施例中，步骤(I)中所述逆转录引物与步骤(3)中设计的用于荧光定量PCR反应的反向引物序列相同。在优选实施例中，步骤(2)中所述第一正向引物长45bp，其3’端前15个碱基序列与革E microRNA5’端互补。在优选实施例中，步骤(3)中所述第二正向引物长18 25bp。在优选实施例中，步骤(3)中所述特异的探针标记有荧光基团。 在优选实施例中，步骤(3)中所述特异的探针为特异的TaqMan MGB探针。与现有技术相比，本发明提供的一种微小RNA实时定量PCR检测新方法，具有如下有益效果
(I)方法的线性范围和敏感性以miR499定量为例，合成的miR499标准品在I. 0x10 4amol/μ I (相当于 6. O x IO1 copies /f 反应) I. 0xl06amol/ μ I (相当于6. OXlO11 copies/反应)浓度范围内呈现良好的线性关系(见图2 A)。标准曲线的斜率(Slope)为-3. 69，R2 =0. 999 (见图 2 B)。(2)方法的重复性以miR499定量为例，在高、中、低三个不同浓度水平的批内、批间重复性试验中，批内CV不超过3. 0%，批间CV不超过3. 5% (见表I)。表明该方法具有较好的重复性。
权利要求
1.一种微小RNA实时定量PCR检测方法，包括如下步骤 (1)设计与革EmicroRNA3’端互补的引物,进行逆转录反应,得到cDNA ； (2)设计第一正向引物与CDNA5’端部分序列进行杂交，进行OverlapPCR反应，得到5’端延长有外源DNA序列的双链DNA产物； (3)设计第二正向引物、特异的探针和反向引物，进行荧光定量PCR反应； 其中步骤(2)中所述第一正向引物长40 50bp，其3’端前15 20个碱基序列与靶microRNA5’ 端互补； 步骤(3)中设计的特异的探针序列位于革E microRNA经逆转录得到的cDNA与外源DNA序列连接部位。
2.如权利要求I所述一种微小RNA实时定量PCR检测方法，其特征在于步骤(I)中所述逆转录引物长22 28bp,其3’端前6 8个碱基序列与祀microRNA3’端互补。
3.如权利要求I所述一种微小RNA实时定量PCR检测方法，其特征在于步骤(I)中所述逆转录引物与步骤(3)中设计的用于荧光定量PCR反应的反向引物序列相同。
4.如权利要求I所述一种微小RNA实时定量PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中所述第一正向引物长45bp,其3’端前15个碱基序列与祀microRNA5’端互补。
5.如权利要求I所述一种微小RNA实时定量PCR检测方法，其特征在于步骤(3)中所述第二正向引物长18 25bp。
6.如权利要求I所述一种微小RNA实时定量PCR检测方法，其特征在于步骤(2)所述overlap PCR和步骤(3)所述Real-time PCR可以在同一反应中进行。
7.如权利要求I所述一种微小RNA实时定量PCR检测方法，其特征在于步骤(3)中所述特异的探针为特异的TaqMan MGB探针。
全文摘要
本发明公开了一种微小RNA实时定量PCR检测方法及其应用。本发明通过设计与靶miRNA3’端序列互补的逆转录引物进行逆转录反应得到cDNA序列，然后设计第一正向引物进行overlapPCR反应，cDNA序列被延伸；最后，延伸的逆转录产物通过传统的TaqManPCR进行扩增、定量。该检测方法在低、中、高三个不同模板RNA浓度水平的批内、批间重复性较好，而且检测方法灵敏。
文档编号C12Q1/68GK102925577SQ201210456209
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者郑卫东, 邸玉玮, 刘英红, 黄革, 郑有为, 张洋, 方伟 申请人:广东省人民医院