专利名称：一种检测dna之间微小结构差别的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物分子检测方法，特别是关于一种检测DNA之间微小结构差 别的方法。
背景技术：
DNA作为遗传信息的载体，包含了生命系统的遗传密码,控制着生物体的生长、 发育、繁殖、遗传和变异，是细胞中最重要的成分之一。人类生物基因组中含有大 量的DNA序列，而DNA序列信息决定了个体的多种特征。许多病变的根源在于DNA
序列变异所致。
目前，传统的生物DNA结构检测方法在测定完整的基因序列时，需将其切成重 叠的片段并测序，然后将重叠的DNA序列装配成完整的基因，该过程耗时且效率低。 而拉曼光谱技术通过对物质的拉曼光谱分析，可以从分子结构水平上了解物质的构 成、特性及变化规律。拉曼光谱技术具有结构信息量大，测量速度快，操作方便等 优点，对研究DNA结构是非常直接、有效的。通过对DNA分子的拉曼光谱研究，可 以反映DNA序列的不同。但由于DNA分子的提取量少，测得的拉曼信号强度弱，而 且还受荧光的干扰，因此很难得到高质量的DNA分子拉曼光谱图，拉曼技术应用遇 到了困难。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种检测DNA之间微小结构差别的方法， 该方法能够将序列相近的DNA分子间微小结构差别快速、准确有效地检测出来。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案 一种检测DNA之间微小结构差别 的方法，它包括以下步骤l)制备多个粗糙银片；2)利用LB膜方法制备0DA LB 膜，并将0DA单分子置于步骤1)的粗糙银片表面上，得到多个0DA LB膜/粗糙银 片；3)将步骤2)中的ODA LB膜/粗糙银片分别放入多个待检测的DNA溶液中浸泡， 得到DNA/0DA LB膜；4)在步骤3)中的每一DNA/0DA LB膜/粗糙银片上铺设一层 喿纳米颗粒，以得到银纳米颗粒/DNA/ODA LB膜/粗糙银片的SERS增强"三明治" 体系；5)利用SERS方法检测步骤4)中的每一 "三明治"体系上的DNA，如果检 测到的SERS图谱中出现的DNA特征峰不同，则待检测DNA的结构存有差别。
在所述步骤l)中，将纯度为99.99%的银片依次放入丙酮、去离子水中，分别 在超声仪中超声清洗5 10min，自然晾干，浸泡在2. 5mo1/1的稀硝酸溶液中10 15min，得到清洁并具有一定粗糙度的银片。在所述步骤3)中，ODA LB膜/粗糙银片放入多个待检测DNA溶液中浸泡的时 间均为4h。
在所述步骤4)中使用的银纳米颗粒的粒径范围为100 140 nm。 在所述步骤5)中所用仪器为RENISHAW RM2000型激光显微拉曼光谱仪。 本发明具有以下技术优点1、本发明方法由于采用了 SERS (Surface Enhanced Raman Scattering,表面增强拉曼散射)方法检测DNA分子，有效避开了荧光干扰， 因此本发明方法不仅反映的DNA分子结构准确性高，灵敏度高，而且检测速度快。 2、由于本发明方法中采用了 LB膜技术，因此检测更为有效，增强效果更好。3、 本发明方法基于SERS增强原理在DNA/0DA (n-octadecy lamine，十八胺)LB (Langmuir-Blodgett)膜/粗糙银片表面上覆盖了一层银纳米颗粒，得到银纳米颗 粒/DNA/ODALB膜/粗糙银片的"三明治"体系，因此进一步提高了检测灵敏度。本 发明方法不仅可以用于检测DNA分子，还可以广泛用于检测其它物质的痕量检测。
图1是本发明方法中的"三明治"结构体系 图2是本发明方法中测得的两种不同序列DNA的SERS光谱
具体实施例方式
下面结合附图和实施例，对本发明方法进行详细描述。 如图1所示，本发明方法包括以下步骤
1) 制备粗糙银片将多个纯度为99.99%的银片依次放入丙酮、去离子水中， 分别在超声仪中超声清洗5 10min，取出待自然干燥后，浸泡在2. 5mo1/1的稀硝 酸溶液中10 15min，即可得到清洁的粗糙银片1。
2) 制备0DALB膜首先，将带有亲水和疏水基团的链状的ODA分子溶于挥发 性的氯仿溶液中，配制0DA/氯仿溶液，其浓度为lmg/ml。然后，在LB拉膜机的 Langmuir槽中，以去离子水为亚相，利用微量注射器将上述ODA/氯仿溶液铺展在 亚相的表面上，待氯仿充分挥发20 30min后，形成ODA单分子薄膜。最后，将步 骤1)中的粗糙银片1固定在LB拉膜机的提拉结构上，用垂直提拉法将ODA单分子 薄膜转移到步骤1)制备得到的各粗糙银片表面上，在粗糙银片表面形成ODA LB膜。 本实施例中，LB拉膜机为NIMA 1232D1D2型LB拉膜机，但不限于此。
3) 制备DNA/ODALB膜将步骤2)中二沉积有ODA LB膜的粗糙银片分别放入 二待检测的DNA溶液中浸泡，浸泡时间均为4h，得到二DNA/0DALB膜2。上述DNA 溶液所采用的溶剂均为去离子水。
4) 为了进一步提高检测灵敏度，制备"三明治"结构体系在步骤3)制备的二 DNA/0DA LB膜/粗糙银片上铺设一层银纳米颗粒3，得到银纳米颗粒/DNA/ODA LB 膜/粗糙银片的SERS增强"三明治"体系。银纳米颗粒3的粒径范围为100 140 nm。
5)利用SERS方法检测步骤4)中获取的二银纳米颗粒/DNA/ODALB膜/粗糙银 片上的DNA，得到二DNA分子SERS光谱图(如图2所示)，对测得的SERS光谱图进 行比较分析，如果测得到SERS图谱中出现的二DNA分子的特征峰不同，则待检测 的二DNA分子结构存有差别。本实施例中，所用仪器为RENISHAW RM2000型激光显 微拉曼光谱仪。
下面通过一具体实施例对本发明方法进行描述。
如图2所示，DNA样品一和样品二是序列相近的两种DNA分子，利用SERS方法 检测到的DNA样品一和样品二在上述两种"三明治"体系中的SERS光谱分别为a 和b。其中，a为样品一对应的"三明治"体系的SERS光谱；b为样品二对应的"三 明治"体系的SERS光谱；从图2中可以看出，a与b中出现的峰均非常明显，且表 现出来的特征峰大多相同，但有一些峰的强度和形状明显不同。这表明DNA样品一 和样品二分子结构大致相同，仅存在微小差别，然而，这些微小的差别在SERS光 谱的1250 cnf1 1500 cm—'波数区域内明显地反映出来，得以鉴别两种微小差别DNA 的异同。
上述各实施例中，本发明方法不仅限于检测不同序列的DNA结构的异同，还可 以用于检测其它多种物质的痕量检测。
权利要求
1、一种检测DNA之间微小结构差别的方法，它包括以下步骤1)制备多个粗糙银片；2)利用LB膜方法制备ODA LB膜，并将ODA单分子置于步骤1)的粗糙银片表面上，得到多个ODA LB膜/粗糙银片；3)将步骤2)中的ODA LB膜/粗糙银片分别放入多个待检测的DNA溶液中浸泡，得到DNA/ODA LB膜；4)在步骤3)中的每一DNA/ODA LB膜/粗糙银片上铺设一层银纳米颗粒，以得到银纳米颗粒/DNA/ODA LB膜/粗糙银片的SERS增强“三明治”体系；5)利用SERS方法检测步骤4)中的每一“三明治”体系上的DNA，如果检测到的SERS图谱中出现的DNA特征峰不同，则待检测DNA的结构存有差别。
2、 如权利要求1所述的一种检测DNA之间微小结构差别的方法，其特征在于在所述步骤l)中，将纯度为99.99%的银片依次放入丙酮、去离子水中，分别在超声仪中超声清洗5 10min，自然晾干，浸泡在2.5mo1/1的稀硝酸溶液中10 15min，得到清洁并具有一定粗糙度的银片。
3、 如权利要求1或2所述的一种检测DNA之间微小结构差别的方法，其特征在于在所述步骤3)中，ODA LB膜/粗糙银片放入多个待检测DNA溶液中浸泡的时间均为4h。
4、 如权利要求1或2所述的一种检测DNA之间微小结构差别的方法，其特征在于在所述步骤4)中使用的银纳米颗粒的粒径范围为100 140 nm。
5、 如权利要求3所述的一种检测DNA之间微小结构差别的方法，其特征在于:在所述步骤4)中使用的银纳米颗粒的粒径范围为100 140 nm。
6、 如权利要求1或2或5所述的一种检测DNA之间微小结构差别的方法，其特征在于在所述步骤5)中所用仪器为RENISHAWRM2000型激光显微拉曼光谱仪。
7、 如权利要求3所述的一种检测DNA之间微小结构差别的方法，其特征在于:在所述步骤5)中所用仪器为RENISHAW RM2000型激光显微拉曼光谱。
8、 如权利要求4所述的一种检测DNA之间微小结构差别的方法，其特征在于:在所述步骤5)中所用仪器为RENISHAW RM2000型激光显微拉曼光谱仪。
全文摘要
本发明涉及一种检测DNA之间微小结构差别的方法，它包括以下步骤1)制备多个粗糙银片；2)利用LB膜方法制备ODA LB膜，并将ODA单分子置于步骤1)的粗糙银片表面上，得到多个ODA LB膜/粗糙银片；3)将步骤2)中的ODA LB膜/粗糙银片分别放入多个待检测的DNA溶液中浸泡，得到DNA/ODA LB膜；4)在步骤3)中的每一DNA/ODA LB膜/粗糙银片上铺设一层银纳米颗粒，以得到银纳米颗粒/DNA/ODA LB膜/粗糙银片的SERS增强“三明治”体系；5)利用SERS方法检测步骤4)中的每一“三明治”体系上的DNA，如果检测到的SERS图谱中出现的DNA特征峰不同，则待检测DNA的结构存有差别。本发明简单快捷、准确，不仅可以有效地将序列相近的DNA分子间微小结构差别准确有效地检测出来，还可以广泛用于检测并区分其它物质。
文档编号G01N21/65GK101629908SQ20091009131
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月17日 优先权日2009年8月17日
发明者炎 方, 杨秀玲, 杨芳芳 申请人:首都师范大学