专利名称：一种基于群感效应机制增加微生物洛伐他汀产量的方法
技术领域：
本发明属医药原料发酵工业领域，具体涉及一种增加微生物洛伐他汀产量的方法。
背景技术：
洛伐他汀是一种能抑制细胞内胆固醇合成的化合物，具有降低胆固醇和甘油三酯的作用，是一种常用的降脂药物，也是其他他汀类药物的前体。洛伐他汀作为药物或药物原料，主要由土曲霉液体深层发酵生产，而作为保健食品功能成分是将红曲霉接种在蒸煮后的大米中，经固态发酵而获得。现有提高洛伐他汀产量的方法主要有菌株选育、培养基组分优化、发酵工艺参数优化调整等，经过长期广泛的实验研究及生产实践探索，以上方法近年来在提高洛伐他汀产量方面已没有明显成效。
发明内容
为了克服现有技术中微生物发酵过程中洛伐他汀产量增加不显著的问题，本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种在微生物发酵过程中提高洛伐他汀产量的方法。本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现
一种增加微生物洛伐他汀产量的方法，其方法为在用于发酵的培养基中添加不饱和脂肪酸；其中所述的微生物为土曲霉(Aspergi Ilus terreus)或红曲霉iMonascuspurpureus, Monascus rubber， Monascus fuliginoscus)。作为一种优选方案，在用于发酵的培养基中添加植物油或植物油脂肪酶酶解产物或二者的混合。作为一种优选方案，所述的植物油脂肪酶酶解产物是通过如下方法制备得到在植物油中加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl缓冲液)和适量的脂肪酶，280C 35°C搅拌反应O. 5 2. O小时。作为一种优选方案，所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的用量是植物油体积的4倍，所述三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的PH为7. 5^8. O。作为一种优选方案，所述的植物油为花生油、菜籽油、大豆油、葵瓜子油、玉米胚芽油、橄榄油、棉籽油和棕榈油中的一种或二种以上的混合。作为一种优选方案，所述的微生物发酵其发酵方式为液体深层发酵或固态发酵。作为一种优选方案，所述的不饱和脂肪酸的添加量为培养基总重量的O. 3^5. 0%。作为一种最优选方案，所述的不饱和脂肪酸的添加量为培养基总重量的
O.4^4. 0%。作为一种优选方案，所述的植物油或植物油脂肪酶酶解产物的添加量为培养基体积或重量的O. 5% 5· 0%。
作为一种优选方案，所述的植物油或植物油脂肪酶酶解产物添加的时间为发酵开始至发酵结束前2天的任何时间。作为一种优选方案，所述的植物油或植物油脂肪酶酶解产物为一次性添加或分多次添加。植物油及其脂肪酶酶解产物中的不饱和脂肪酸经微生物代谢产生氧脂素，氧脂素作为真菌(如土曲霉、红曲霉)群感效应的信号分子，调控洛伐他汀生物合成。与现有技术相比本发明的有益效果为利用本发明所述的方法，可以使微生物在发酵过程中的洛伐他汀产量显著提高；其中土曲霉液体深层发酵洛伐他汀产量可增加15°/Γ20%，红曲霉固态发酵洛伐他汀产量可增加18 25%。
具体实施例方式以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明不做任何形式的限定。以下对比例及实施例中使用的基础培养基与培养条件为
(1)土曲霉斜面培养基(8/1):蔗糖 30g，NaNO3 3g，K2HP04 lg，MgSO4 · 7H20 O. 5g, KCl
0.5g，FeSO4 · 7H20 0. Olg，琼脂 15g。(2) 土曲霉种子培养基(g/L):葡萄糖50g,酵母膏IOg,蛋白胨20g, NaCl lg, pH7.2-7. 5。28°C培养 50 小时。(3) 土曲霉液体发酵培养基(g/L):葡萄糖80g,大豆粉25g,蛋白胨15g,NaCl lg,pH自然。土曲霉液态发酵培养使用500mL三角瓶，接种量10%，装液量10%，摇床转速 180rpm，28°C培养 12 天。(4)红曲霉斜面培养基(g/L) :20%马铃薯滤液，葡萄糖20g，琼脂粉15g。(5)红曲霉种子培养基(g/L) :20%马铃薯滤液，葡萄糖50g。28°C培养50小时
(6)红曲霉米饭培养基大米50g，水50ml，灭菌，冷却。红曲霉固态发酵红曲霉接种
到米饭培养基中，28°C恒温培养12天。培养基变干时适量补水。对比例I
(1)菌种活化将土曲霉(CICC2453)接种到土曲霉斜面培养基，28°C培养3天，活化菌
种；
(2)种子液制备将活化好的菌种接种到土曲霉种子培养基28°C、180rpm培养50小时，获得种子液；
(3)液体深层发酵500mL三角瓶装土曲霉液体发酵培养基50ml，接种5mL，28°C、180rpm培养12天；
(4)高效液相色谱法测定发酵液中洛伐他汀含量Waters2695 /2996液相色谱仪，Dikma Diamonsil C18 色谱柱(4. 6 mmX 250mm, 5 μ m),柱温 30°C,检测波长 238 nm,进样体积20yL，甲醇-18 mmol/L磷酸水溶液(体积比80 20)为流动相，流速为1.0 mL/min。取发酵液5mL,加入5mL甲醇,25°C、150rpm振荡3h, IOOOOrpm离心IOmin,上清液用高效液相色谱法(外标法)测定洛伐他汀含量；
(5)本对比例发酵液中洛伐他汀含量为685mg/L。实施例I(O菌种活化同对比例I中的步骤(I);种子液制备同对比例I中的步骤(2)；
(2)液体深层发酵500mL三角瓶装土曲霉液体发酵培养基50ml，添加花生油I.5 mL,接种 5mL, 28 °C、180rpm 培养 12 天；
(3)高效液相色谱法测定发酵液中洛伐他汀含量同对比例I中的步骤(4)；
(4)本实施例发酵液中洛伐他汀含量为795mg/L。实施例2
Cl)菌种活化同对比例I中的步骤(I);种子液制备同对比例I中的步骤(2)；
(2)液体深层发酵500mL三角瓶装土曲霉液体发酵培养基50ml，接种5mL，28V、ISOrpm培养12天；并于发酵的第3天、第6天和第9天，在培养液中添加玉米胚芽油各O. 8mL ；
(3)高效液相色谱法测定发酵液中洛伐他汀含量同对比例I中的步骤(4)；
(4)本实施例发酵液中洛伐他汀含量为820mg/L。对比例2
(1)菌种活化将红曲霉(CICC5031)接种到红曲霉斜面培养基，28°C培养3天，活化菌
种；
(2)种子液制备将活化好的菌种接种到红曲霉种子培养基28°C、180rpm培养50小时，获得种子液；
(3)红曲霉固态发酵红曲霉种子液IOmL接种到100克米饭培养基中，28°C恒温培养12天，发酵结束，60°C真空干燥得红曲米；
(4)高效液相色谱法测定洛伐他汀含量Waters2695 /2996液相色谱仪，DikmaDiamonsil C18 色谱柱(4. 6 _X 250mm, 5 μ m),柱温 3CTC,检测波长 238 nm,进样体积20 μ L，甲醇-18 mmol/L磷酸水溶液(体积比80 20)为流动相，流速为I. O mL/min。红曲米研磨粉碎，取O. 5g,加甲醇5. OmL,浸泡3h,然后于IOOOOrpm离心IOmin,上清液用高效液相色谱法(外标法)测定洛伐他汀含量；
(5)本对比例红曲米洛伐他汀含量为9.lmg/g。实施例3
(1)菌种活化同对比例2中的步骤(I);种子液制备同对比例2中的步骤(2)；
(2)大豆油酶解10mL大豆油加入 40mL Tris-HCl (60mmol/L CaCl2,ρΗ7· 5_8· O)缓冲液和1000U脂肪酶，35°C搅拌反应I小时，获得大豆油酶解液；
(3)红曲霉固态发酵100克米饭培养基接种红曲霉种子液IOmL，在发酵第8天加5mL大豆油酶解液，28°C恒温培养12天；发酵结束，60°C真空干燥得红曲米；
(4)高效液相色谱法测定红曲米洛伐他汀含量同对比例2中的步骤(4)；
(5)本实施例红曲米洛伐他汀含量为11.4mg/g。实施例4
Cl)菌种活化同对比例2中的步骤(I);种子液制备同对比例2中的步骤(2)；
(2)菜籽油酶解10mL大豆油加入 40mL Tris-HCl (60mmol/L CaCl2, ρΗ7· 5_8· O)缓冲液和1000U脂肪酶，35°C搅拌反应I小时，获得菜籽油酶解液；
(3)红曲霉固态发酵100克米饭培养基接种红曲霉种子液10mL，28°C恒温培养12天，在发酵第4天、第7天和第10天各加ImL菜籽油酶解液；发酵结束，60°C真空干燥得红曲米；
(4)高效液相色谱法测定红曲米洛伐他汀含量同对比例2中的步骤(4)；本实施例红曲米洛伐他汀含量为10. 9mg/g。
权利要求
1.一种增加微生物洛伐他汀产量的方法，其特征在于，在用于发酵的培养基中添加不饱和脂肪酸；其中所述的微生物为土曲霉或红曲霉。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，在用于发酵的培养基中添加植物油或植物油脂肪酶酶解产物或二者的混合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的植物油脂肪酶酶解产物是通过如下方法制备得到在植物油中加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液和脂肪酶，28°C 35°C搅拌反应O. 5 2. O小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的用量是植物油体积的4倍，所述三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的PH为7. 5^8. O。
5.根据权利要求2 4任一项所述的方法，其特征在于，所述的植物油为花生油、菜籽油、大豆油、葵瓜子油、玉米胚芽油、橄榄油、棉籽油和棕榈油中的一种或二种以上的混合。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的微生物发酵其发酵方式为液体深层发酵或固态发酵。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的不饱和脂肪酸的添加量为培养基总重量的O. 3 5. 0%。
8.根据权利要求2 4或6所述的方法，其特征在于所述的植物油或植物油脂肪酶酶解产物的添加量为培养基体积或重量的O. 59Γ5. 0%。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的植物油或植物油脂肪酶酶解产物添加的时间为发酵开始至发酵结束前2天的任何时间。
10.根据权利要求2或9所述的方法，其特征在于所述的植物油或植物油脂肪酶酶解产物为一次性添加或分多次添加。
全文摘要
本发明公开了一种基于群感效应机制增加微生物洛伐他汀产量的方法。其方法为在用于发酵的培养基中添加不饱和脂肪酸；其中所述的微生物为土曲霉或红曲霉。利用本发明所述的方法，可以使微生物在发酵过程中的洛伐他汀产量显著提高；其中土曲霉液体深层发酵洛伐他汀产量可增加15%~20%，红曲霉固态发酵洛伐他汀产量可增加18~25%。
文档编号C12R1/66GK102925509SQ20121045620
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者李浩明 申请人:广东药学院