抗原结合构建体的制作方法

专利名称：抗原结合构建体的制作方法
抗原结合构建体背景抗体在治疗应用方面的用途众所周知。抗体为包含至少两条重链和两条轻链的异多聚体糖蛋白。除IgM外，完整抗体通 常是大约150Kda的异四聚体糖蛋白，其由两条同样的轻(L)链和两条同样的重链(H)链组 成。通常每一条轻链由一个共价二硫键与重链连接，同时不同免疫球蛋白同种型重链之间 的二硫键的数目不同。每一条重链和轻链也具有链间二硫键桥。每一重链在一端有可变结 构域(VH)，接着是多个恒定区。每一轻链有可变结构域(VL)并在其另一端有恒定区；轻链 恒定区与重链第一恒定区并排，轻链可变结构域与重链可变结构域并排。基于恒定区氨基 酸序列，将来自大部分脊椎动物物种的抗体轻链指定为称为κ和λ的两类中的一种。根据 其重链恒定区的氨基酸序列，可将人抗体指定为5种不同类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。 可将IgG和IgA进一步再分为亚类:IgGU IgG2、IgG3和IgG4 ；和IgAl和IgA2。在小鼠和 大鼠中具有至少IgG2a、IgG2b的物种间变体。抗体可变结构域因抗体含有显示特定变化性 的称为互补决定区(CDR)的某些区域而提供结合特异性。可变区更保守的部分被称为构架 区(FR)。完整重链和轻链可变结构域各自包含由三个CDR连接的四个FR。各链中的CDR 通过FR区紧密接近保持在一起，并与来自其它链的CDR促成抗体的抗原结合位点的形成。 恒定区不直接参与抗体抗原间结合，但呈现各种效应器功能，例如参与以下功能抗体依赖 性细胞介导细胞毒性(ADCC)、经由结合Fc γ受体的吞噬作用、经由新生Fc受体(FcRn)的 半衰期/清除率和经由补体级联的Clq组分的补体依赖性细胞毒性。IgG抗体结构的特性是有两个抗原结合位点，其中两个都特异性针对同一表位。因 此，它们为单特异性。双特异性抗体是对至少两种不同的表位有结合特异性的抗体。制备所述抗体的 方法为本领域所知。传统上，双特异性抗体的重组制备是基于两个免疫球蛋白H链-L链 配对的共表达，其中两个H链具有不同的结合特异性，参见=Millstein等，Nature 305 537-539(1983) ；W093/08829 ；和 Traunecker 等 ΕΜΒ0，10，1991，3655-3659。因为 H 链和 L 链随机分配，产生了十种不同的抗体结构的潜在混合物，其中仅一种具有所需的结合特异 性。备选方法涉及让具有所需结合性特异的可变结构域与重链恒定区融合，所述重链恒定 区包含至少部分铰链区、CH2和CH3区。优选使含轻链结合所需位点的CHl区存在于融合体 中的至少之一中。将编码这些融合体以及需要时的L链的DNA插入到单独的表达载体中， 然后共转染到合适的宿主生物体。然而可将两条或所有三条链的编码序列插入到一个表达 载体。在一种方法中，双特异性抗体由在一条臂上具有第一结合特异性的H链和在另一条 臂上提供第二结合特异性的H-L链对组成，参见W094/04690。也参见Suresh等Methods in Enzymology 121，210，1986。其它方法包括包含单结构域结合位点的抗体分子，其由 W02007/095338 提出。发明概述本发明涉及抗原结合构建体，所述构建体包含连接一个或多个表位结合结构域的 蛋白质骨架，其中所述抗原结合构建体具有至少两个抗原结合位点，其中至少之一来自表
5位结合结构域，并且其中至少之一来自配对的VH/VL结构域。本发明进一步涉及抗原结合构建体，所述构建体包含至少一个包含两个或多个式 I结构的同型二聚体
(R7)m (R8)m
II
(R6)m(R3)m
II
轻链恒定结构域……·重链恒定结构域1
II
(R5)m (R2)m
II
(R4)m X I
(R1)n
(I)其中X代表包含重链恒定结构域2和重链恒定结构域3的抗体恒定区；R1、R4、R7和R8代表独立选自表位结合结构域的结构域；R2代表选自重链恒定结构域1和表位结合结构域的结构域；R3代表选自配对的VH和表位结合结构域的结构域；R5代表选自轻链恒定结构域和表位结合结构域的结构域；R6代表选自配对的VL和表位结合结构域的结构域；η代表独立选自以下的整数0、1、2、3和4 ；m代表独立选自以下的整数0和1 ；其中重链恒定结构域1和轻链恒定结构域相连接(associate)；其中存在至少一个表位结合结构域；并且当R3代表配对的VH结构域时，R6代表配对的VL结构域，由此两个结构域一 起能够结合抗原。本发明涉及基于IgG的结构和制备所述构建体的方法及其用途，尤其是在治疗中 的用途，所述基于IgG的结构包括单克隆抗体或连接一个或多个结构域抗体的片段。本发明还提供编码本文所述任一种抗原结合构建体的重链的多核苷酸序列和编 码本文所述任一种抗原结合构建体轻链的多核苷酸。所述多核苷酸表示对应于等同多肽序 列的编码序列，然而，应该理解，可将所述多核苷酸序列连同起始密码子、合适的信号序列 和终止密码子一起克隆到表达载体中。本发明还提供重组转化的或转染的宿主细胞，所述宿主细胞包含一种或多种编码
6任一种本文所述抗原结合构建体的重链和轻链的多核苷酸。本发明进一步提供用于制备任一种本文所述抗原结合构建体的方法，所述方法包 括在无血清培养基中培养包含第一和第二载体的宿主细胞的步骤，所述第一载体包含编码 任一种本文所述抗原结合构建体的重链的多核苷酸，所述第二载体包含编码任一种本文所 述抗原结合构建体的轻链的多核苷酸。本发明进一步提供药用组合物，所述药用组合物包含本文所述抗原结合构建体及 可药用载体。本发明还提供包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示多肽序列的结构域抗体或由 其组成的结构域抗体。本发明一个方面提供从SEQID N0:60或SEQ ID NO :61所示的多核 苷酸序列表达的蛋白质。定义本文所用术语“蛋白质骨架”包括但不限于免疫球蛋白(Ig)骨架(例如IgG骨 架)，其可为四链抗体或两链抗体，或其可仅包含抗体的Fc区，或其可包含来自抗体的一个 或多个恒定区，所述恒定区可为人源或灵长类源，或其可为人和灵长类恒定区的人造嵌合 体。所述蛋白质骨架除一个或多个恒定区外还可包含抗原结合位点，例如所述蛋白质骨架 包含全IgG。所述蛋白质骨架能够连接其它蛋白质结构域，例如具有抗原结合位点的蛋白质 结构域，例如表位结合结构域或ScFv结构域。“结构域”是折叠的蛋白质结构，其具有不依赖蛋白质其余部分的三级结构。结构 域通常负责蛋白质不相关联的功能特性，在很多情况下可将其添加、除掉或转移到其它蛋 白质而不丢失所述蛋白质其余部分和/或结构域的功能。“单一抗体可变结构域”是折叠的 多肽结构域，其包含抗体可变结构域的序列特点。因此，其包括完整的抗体可变结构域和经 修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环已被不具有抗体可变结构域特性的序列取代 的可变结构域，或已被截短的或包含N-或C-末端突出端的抗体可变结构域，以及保留至少 全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。短语“免疫球蛋白单一可变结构域”指抗体可变结构域(Vh、Vhh、\)，所述抗体可变 结构域独立于不同V区或结构域地特异性结合抗原或表位。免疫球蛋白单一可变结构域可 以以某种形式(例如同多聚体或异多聚体)与其它不同可变区或可变结构域存在，其中所 述其它区或结构域对于通过单一免疫球蛋白可变结构域结合抗原不是必需的(即其中免 疫球蛋白单一可变结构域不依赖另外的可变结构域结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与 如本文所用术语“免疫球蛋白单一可变结构域” 一样，能够结合抗原。免疫球蛋白单一可变 结构域可为人抗体可变结构域，但也包括来自以下其它物种的单一抗体可变结构域例如 啮齿动物(例如如WO 00/29004所公开)、铰口鲨和骆驼(Camelid)VHHdAb。骆驼Vhh为源自 以下物种的免疫球蛋白单一可变结构域多肽包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和骆马，它 们都产生天然缺乏轻链的重链抗体。所述Vhh结构域可根据本领域能获得的标准技术人源 化，认为所述结构域仍为本发明“结构域抗体”。本文所用Vh包括骆驼Vra结构域。NARV是在 软骨鱼(包括铰口鲨)中鉴定的另一类免疫球蛋白单一可变结构域。这些结构域也被称为 新型抗原受体可变结构域(Novel Antigen Receptor variable region通常缩写为V(NAR) 或 NARV)。进一步的详细资料参见 Mol. Immunol. 44，656-665 (2006)和 US20050043519A。术语“表位结合结构域”指特异性结合独立于不同的V区或结构域地特异性结合抗原或表位的结构域，所述表位结合结构域可为结构域抗体(dAb)，例如人、骆驼或鲨鱼免 疫球蛋白单一可变结构域，或其可为选自以下的骨架衍生物结构域CTLA-4 (Evibody)；脂 质运载蛋白；来源于蛋白A的分子，例如蛋白A的Z-结构域(Affibody，SpA)、A-结构域 (Avimer/Maxibody)；热休克蛋白，例如GroEl和GroES ；转铁蛋白(trans-body)；锚蛋白重 复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连凝集素(Tetranectin)) ’人γ-晶体 蛋白和人泛素(affilin) ；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂蝎毒素kimitz型结构域；和纤连蛋 白(adnectin)；对它们进行过蛋白质工程改造，以便获得结合不同于天然配体的配体。CTLA_4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是在主要⑶4+T-细胞上表达的⑶28-家 族受体。其胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可被异源序列 取代，以提供不同的结合性质。经过工程改造具有不同结合特异性的CTLA-4分子也被称 为 Evibody。进一步的详细资料参见 Journal of Immunological Methods 248(1-2)， 31-45(2001)。脂质运载蛋白是胞外蛋白质家族，其转运小疏水分子如类固醇、胆汁三烯、类视黄 醇和脂质。它们具有在锥形结构开放末端处具有多个环的刚性折叠二级结构，可以 经过工程改造以结合不同靶抗原。Anticalin大小为160-180个氨基酸，源自脂质运载蛋 白。进一步的详细资料参见 Biochim Biophys Acta 1482 :337_350 (2000)，US7250297B1 和 US20070224633。Affibody为源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的骨架，可将 其工程改造以结合抗原。所述结构域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基 的随机化产生文库。进一步的详细资料参见Protein Eng. Des. Sel. 17，455-462 (2004)和 EP1641818A1。Avimer为源自A-结构域骨架家族的多结构域蛋白质。大约35个氨基酸的天然 结构域采用明确的二硫键合结构。通过对由A-结构域家族表现的天然变异进行改组来产 生多样性。进一步的详细资料参见 Nature Biotechnology 23 (12)，1556-1561 (2005)和 Expert Opinion onlnvestigational Drugs 16 (6), 909-917 (2007 年六月)。转铁蛋白为单体血清转运糖蛋白。可通过在允许的表面环中插入肽序列对转铁蛋 白进行工程改造以结合不同的靶抗原。工程改造的转铁蛋白骨架的实例包括Trans-body。 进一步的详细资料参见 J. Biol. Chem 274，24066-24073 (1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)源自锚蛋白(Ankyrin)，所述锚蛋白为介导内 膜蛋白与细胞骨架连接的蛋白质家族。单一锚蛋白重复序列为由两个α-螺旋和β-转 角组成的33个残基的基序。可通过使每一重复序列的第一个α-螺旋和β-转角中的 残基随机化对其进行工程改造以结合不同靶抗原。可通过增加功能模件(module)的数 量来增大其结合界面(亲和力成熟方法)。进一步的详细资料参见J.Mol.Biol.332， 489-503(2003)、PNAS 100 (4)，1700-1705 (2003)和 J. Mol. Biol. 369，1015-1028 (2007)和 US20040132028A1。纤连蛋白是可对其进行工程改造以结合抗原的骨架。Adnectin由人纤连蛋白III 型(FN3)的15个重复单位的第10个结构域的天然氨基酸序列骨架组成。可对β-夹层 的一端的三个环进行工程改造以使Adnectin能特异性识别目的治疗靶标。进一步的详 细资料参见 ProteinEng. Des. Sel. 18，435-444(2005)、US20080139791、W02005056764 和
8US6818418B1。肽适体为由固定骨架蛋白组成的组合识别分子，其通常是含有插入到活性位点的 限制性可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步的详细资料参见Expert Opin. Biol. Ther. 5， 783-797(2005)。微体源自天然存在的长为25-50个氨基酸的含有3-4个半胱氨酸桥的微蛋白质， 微蛋白实例包括KalataBl和食鱼螺毒素和打结素(knottin)。微蛋白具有可工程改造以包 括至多25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠的环。工程改造的打结素结构域的进一步 的详细资料参见W02008098796。其它表位结合结构域包括用作骨架以工程改造不同靶抗原结合特性的蛋白质，包 括在 Handbook of Therapeutic Antibodies (2007，由 Stefan Dubel 主编)第 7章-非抗体 骨架和Protein Science 15:14-27(2006)中综述的人Y-晶体蛋白和人泛素(affilin)、 人蛋白酶抑制剂kimitz型结构域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律布德 蝎毒素(charybdotoxin) )、C_型凝集素结构域(四连凝集素)。本发明表位结合结构域可 源自这些备选蛋白质结构域中的任一种。本文所用术语“配对的VH结构域”、“配对的VL结构域”和“配对的VH/VL结构域” 指仅当与其配偶体(partner)可变结构域配对时特异性结合抗原的抗体可变结构域。在任 何配对中总是有一个VH和一个VL，术语“配对的VH结构域”指VH配偶体，术语“配对的VL 结构域”指VL配偶体，术语“配对的VH/VL结构域”指两个结构域一起。在本发明一个实施方案中，抗原结合位点以以下Kd结合抗原至少ImM的Kd，例 如10ηΜ、1ηΜ、500ρΜ、200ρΜ、IOOpM的Kd，对每一抗原如Biacore 所测量，例如在方法4或5 中所述的Biacore 方法。本文所用术语“抗原结合位点”指构建体上能够特异性结合抗原的位点，其可为单 一结构域，例如表位结合结构域，或其可为如能在标准抗体上发现的配对的VH/VL结构域。 在本发明某些方面，单链Fv(ScFv)结构域可提供抗原结合位点。本文所用术语“mAb/dAb”和“dAb/mAb”指本发明抗原结合构建体。这两个术语可 互换使用，意欲具有如本文所用相同的意义。本文所用术语“重链恒定结构域1”指免疫球蛋白重链的CHl结构域。本文所用术语“轻链恒定结构域”指免疫球蛋白轻链的恒定结构域。发明详述本发明涉及包含蛋白质骨架的抗原结合构建体，所述骨架连接一个或多个表位结 合结构域，其中所述抗原结合构建体具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个来自表位 结合结构域，其中至少一个来自配对的VH/VL结构域。所述抗原结合构建体包含蛋白质骨架，例如Ig骨架(例如IgG)，例如单克隆抗体， 所述骨架连接一个或多个表位结合结构域，例如结构域抗体，其中所述结合构建体具有至 少两个抗原结合位点，其中至少一个来自表位结合结构域。本发明涉及制备所述抗原结合 构建体的方法及其用途，尤其是在治疗中的用途。本发明抗原结合构建体的某些实例在

图1中阐述。本发明抗原结合构建体也被称为mAbdAb。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体的蛋白质骨架为Ig骨架，例如IgG骨架或IgA骨架。化6骨架可包含抗体的所有结构域(即011、012、013、￥!1、￥1^)。本发明抗 原结合构建体可包含选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE的IgG骨架。本发明抗原结合构建体具有至少两个抗原结合位点，例如其具有两个结合位点， 例如其中第一个结合位点对抗原第一表位具有特异性，第二结合位点对同一抗原的第二表 位具有特异性。在另一实施方案中，有4个抗原结合位点，或6个抗原结合位点，或8个抗 原结合位点，或10个或更多个抗原结合位点。在一个实施方案中，所述抗原结合构建体对 不止一个抗原具有特异性，例如对两个抗原，或对三个抗原，或对四个抗原具有特异性。在另一方面，本发明涉及包含至少一个包含两个或更多个式I结构的同型二聚体 的抗原结合构建体


m
(R7)1
I
(R6)m
I
(R8)m I
(R3)m I
轻链恒定结构域·…·重链恒定结构域
I
(R5)m I
(R4)m
m
I
(R2) I
χ
I
(R1)n
其中
X代表包含重链恒定结构域2和重链恒定结构域3的抗体恒定区； R1 > R4> R7和R8代表独立选自表位结合结构域的结构域； R2代表选自重链恒定结构域1和表位结合结构域的结构域； R3代表选自配对的VH和表位结合结构域的结构域； R5代表选自轻链恒定结构域和表位结合结构域的结构域； R6代表选自配对的VL和表位结合结构域的结构域； η代表独立选自以下的整数0、1、2、3和4 ； m代表独立选自以下的整数0和1 ； 其中重链恒定结构域1和轻链恒定结构域相连接； 其中存在至少一个表位结合结构域；
当R3代表配对的VH结构域时，R6代表配对的VL结构域，由此两个结构域-够结合抗原。在一个实施方案中，R6代表配对的VL，R3代表配对的VH。在另一实施方案中，R7和R8任一个或两个都代表表位结合结构域。
-起能
10
在又一实施方案中，R1和R4任一个或两个都代表表位结合结构域。在一个实施方案中，R4存在。在一个实施方案中，R1R7和R8代表表位结合结构域。在一个实施方案中，R1R7和R8及R4代表表位结合结构域。在一个实施方案中，(R1)n^ (R2)m、(R4)m和(R5)m = O,即不存在，R3为配对的VH结 构域，R6为配对的VL结构域，R8为VH dAb，而R7为VL dAb。在另一实施方案中，(R1)n^ (R2)m、(R4)m和(R5)n^O,即不存在，R3为配对的VH结 构域，R6为配对的VL结构域，R8为VH dAb，而(R7)m = 0，即不存在。在另一实施方案中，(R2)m和(R5)mSO,即不存在，R1SdAb, R4SdAb, R3为配对 的VH结构域，R6为配对的VL结构域，(R8)n^P (R7)m = 0，即不存在。在本发明一个实施方案中，所述表位结合结构域为dAb。应该理解，本文所述任一种抗原结合构建体能够中和一种或多种抗原。本说明书中各处使用的关于本发明抗原结合构建体的术语“中和”及其语法变体， 意指在本发明抗原结合构建体存在下靶标的生物活性与在缺乏所述抗原结合构建体时的 靶标的活性相比，总体或部分降低了。可由于(但不限于)以下一种或多种原因发生中和 封阻配体结合，妨碍配体激活受体，下调受体或影响效应器功能。可以若干方法测量中和水平，例如通过使用由下文实施例及方法提出的测定中的 任何一种，例如测量配体受体结合抑制的测定，其可如例如方法12、19或21或实施例32中 任一个所述进行。通过评估在中和性抗原结合构建体存在下配体与其受体之间结合的降低 情况来测量这些测定中VEGF、IL-4、IL-13或HGF的中和。还可例如在TFl测定中测量中和水平，该测定可例如如方法8、9、10、20或21中所 述来实施。在该测定中IL-13、IL-4或这两种细胞因子的中和都可通过评估在中和性抗原 结合构建体存在下抑制TFl细胞增殖来测量。或者，可在EGFR磷酸化测定中测量中和，该 测定可例如如方法13所述实施。可通过评估在中和性抗原结合构建体存在下受体的酪氨 酸激酶磷酸化的抑制来测量该测定中的EGFR中和。或者，可用MRC-5细胞中的IL-8分泌 测定来测量中和，该测定可例如如方法14或15中所述来实施。在该测定中可通过评估在 中和性抗原结合构建体存在下IL-8分泌的抑制来测量NF α或IL-IRl的中和。例如，通过评估在中和性抗原结合构建体存在下配体与其受体之间的结合降低情 况来评估中和的其它方法在本领域已知，包括例如Biacore 测定。本发明备选方面提供抗原结合构建体，所述抗原结合构建体具有与本文所举例的 抗体至少基本上等同的中和活性，例如，分别在实施例4和20中提出的TFl细胞增殖测定 或 pSTAT6 信号转导抑制测定中保留 586H-TVAAPS-210 或 PascoH-G4S_474 或 PascoH-474、 除去GS的PascoH-474、PascoL-G4S_474或PascoHL-G4S_474的中和活性的抗原结合构建 体；或例如在实施例14. 6和14. 7提出的VEGFR结合测定或IGF-IR受体磷酸化的抑制中保 留BPC1603、BPC1604、BPC1605、BPC1606的中和活性的抗原结合构建体。本发明抗原结合构建体包括对IL-13具有特异性的抗原结合构建体，例如包含能 够结合IL-13的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合IL-13的配对的VH/VL的 抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合IL-13的抗体。抗原结合构建体可包含 能够结合IL-13的dAb。
在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体对不止一种抗原具有特异性，例如其 中所述抗原结合构建体能够结合选自IL-13、IL-5和IL-4的两种或更多种抗原，例如其中 能够结合IL-13和IL-4，或其中能够结合IL-13和IL-5，或其中能够结合IL-5和IL-4。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体对不止一种抗原具有特异性，例如其 中所述抗原结合构建体能够结合选自IL-13、IL-5和IL-4的两种或更多种抗原，例如其 中能够同时结合IL-13和IL-4，或其中能够同时结合IL-13和IL-5，或其中能够同时结合 IL-5 和 IL-4。应该理解，本文所述任何抗原结合构建体可以能够同时结合两种或更多种抗原， 例如其如通过用合适测定的化学计量学分析所测定，所述合适的测定例如实施例部分方法 7中所述测定。本发明抗原结合构建体实例包括具有对IL-4有特异性的表位结合结构域(例如 抗-IL-4dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的C-末端或η_末端)的IL-13抗 体，例如具有 SEQ ID NO: 16-39、SEQ IDNO :41_43、SEQ ID NO 87-90, SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO 152或SEQID NO 155所述的重链序列的mAbdAb。本发明抗原结合构建体包括具有 连接到重链的η-末端的IL-4表位结合结构域的IL-13抗体。本发明抗原结合构建体包括 具有连接到轻链的η-末端的IL-4表位结合结构域的IL-13抗体。本发明抗原结合构建体 包括具有连接到重链的C-末端的IL-4表位结合结构域的IL-13抗体。本发明抗原结合构 建体包括具有连接到轻链的C-末端的IL-4表位结合结构域的IL-13抗体。所述抗原结合 构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原特异性的另外的表位结合结构域，所述 表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。这样的抗原结合构建体的实例包括具有对IL-13有特异性的表位结合结构域(例 如抗-IL-13dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的c_末端或n_末端)的IL-4 抗体，例如具有 SEQ ID NO 48-53, SEQID NO :91、SEQ ID NO :92、SEQ ID NO :149、SEQ ID NO 150或SEQ IDNO 157-160中所述的重链序列和/或SEQ ID NO :54_59中所述的轻链序 列的 mAbdAb。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-13表位结合结构域 的IL-4抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的IL-13表位结合结 构域的IL-4抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的IL-13表位 结合结构域的IL-4抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的IL-13 表位结合结构域的IL-4抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同 的抗原特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或 η-末端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。所述抗原结合构建体的实例包括具有对IL-5有特异性的表位结合结构域(例如 抗-IL-5dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的C-末端或η_末端)的IL-13抗 体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-5表位结合结构域的IL-13 抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的IL-5表位结合结构域的 IL-13抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的IL-5表位结合结构 域的IL-13抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的IL-5表位结合 结构域的IL-13抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末端 和/或轻链的C-末端和/或η-末端。所述抗原结合构建体实例包括具有对IL-13有特异性的表位结合结构域(例如 抗-IL-13dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的c_末端或n_末端)的IL-5抗 体，例如具有SEQ ID NO 72中所述的轻链序列的mAbdAb。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-13表位结合结构域 的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的IL-13表位结合结 构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的IL-13表位 结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的IL-13 表位结合结构域的IL-5抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同 的抗原特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或 η-末端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。所述抗原结合构建体实例包括具有对IL-5有特异性的表位结合结构域(例如 抗-IL-5dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的C-末端或η_末端)的IL-4抗 体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-5表位结合结构域的IL-4 抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的IL-5表位结合结构域的 IL-4抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的IL-5表位结合结构域 的IL-4抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的IL-5表位结合结 构域的IL-4抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原特异 性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末端和 /或轻链的C-末端和/或η-末端。所述抗原结合构建体实例包括具有对IL-4有特异性的表位结合结构域(例如 抗-IL-4dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的C-末端或η_末端)的IL-5抗 体，例如具有SEQ ID NO 71中所述的重链序列的mAbdAb。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-4表位结合结构域的 IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的IL-4表位结合结构域 的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的IL-4表位结合结 构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的IL-4表位结 合结构域的IL-5抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原 特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末 端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。本发明还提供三特异性结合构建体，其能够结合IL-4、IL-13和IL_5。所述抗原结合构建体的实例包括具有对IL-4有特异性的表位结合结构域(例如 抗-IL-4dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的C-末端或η-末端)和对IL-13 有特异性的表位结合结构域(例如抗_IL-13dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链 的C-末端或η-末端)的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的Π-末端的IL-4表位结合结构域和 连接到轻链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-4表位结合结构域和连接到轻链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-连接到重链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的IL-连接到轻链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的IL-连接到重链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的IL-连接到重链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的IL-连接到轻链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的IL-连接到轻链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的IL-连接到重链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的IL-连接到重链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的IL-连接到重链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的IL-连接到轻链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-5抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原特异性的另外 的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末端和/或轻链 的C-末端禾口 /或η-末端。本发明抗原结合构建体包括对IL-18具有特异性的抗原结合构建体，例如包含能 够结合IL-18的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合IL-18的配对的VH/VL的 抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合IL-18的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合 IL-18 的 dAb。本发明还提供能够结合IL-4、IL-13和IL-18的三特异性结合构建体。所述抗原结合构建体实例包括具有对IL-4具有特异性的表位结合结构域(例如 抗-IL-4dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的C-末端或η-末端)和对IL-13 具有特异性的表位结合结构域(例如抗_IL-13dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻 链的C-末端或η-末端)的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-4表位结合结构域和 连接到轻链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-4表位结合结构域和 连接到轻链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的IL-4表位结合结构域和
4表位结合结构域和 4表位结合结构域和 4表位结合结构域和 4表位结合结构域和 4表位结合结构域和 4表位结合结构域和 4表位结合结构域和 4表位结合结构域和 4表位结合结构域和 4表位结合结构域和连接到重链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的 连接到轻链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的 连接到重链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的 连接到重链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的 连接到轻链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的 连接到轻链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的 连接到重链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的 连接到重链的C-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的 连接到重链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的 连接到轻链的η-末端的IL-13表位结合结构域的IL-18抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原特异性的另外 的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末端和/或轻链 的C-末端和 /或η-末端。本发明抗原结合构建体包括对TNF α具有特异性的抗原结合构建体，例如包含能 够结合TNF α的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合TNF α的配对的VH/VL的 抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合TNF α的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合 TNFa 的 dAb。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体对不止一种抗原具有特异性，例如其 中所述抗原结合构建体能够结合选自TNFa、EGFR和VEGF的两种或更多种抗原，例如其中 所述抗原结合构建体能够结合TNF α和EGFR，或其中所述抗原结合构建体能够结合TNF a 和VEGF，或其中所述抗原结合构建体能够结合EGFR和VEGF。所述抗原结合构建体实例包 括具有对EGFR具有特异性的表位结合结构域(例如抗-EGFR dAb，其连接到重链的c_末端 或η-末端或轻链的C-末端或η-末端)的TNF α抗体，例如具有SEQ ID NO :74中所述的 重链序列和/或SEQ ID NO 79中所述的轻链序列的mAbdAb。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的EGFR表位结合结构域的 TNFa抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的EGFR表位结合结构域 的TNF α抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的EGFR表位结合结 构域的TNF α抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的EGFR表位结 合结构域的TNF α抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原
IL-4表位结合结构域和 IL-4表位结合结构域和 IL-4表位结合结构域和 IL-4表位结合结构域和 IL-4表位结合结构域和 IL-4表位结合结构域和 IL-4表位结合结构域和 IL-4表位结合结构域和 IL-4表位结合结构域和特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末 端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的TNF α表位结合结构域 的EGFR抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的TNF α表位结合结 构域的EGFR抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的TNFa表位 结合结构域的EGFR抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的TNF α 表位结合结构域的EGFR抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同 的抗原特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或 η-末端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。所述抗原结合构建体实例包括具有对VEGF具有特异性的表位结合结构域(例如 抗-VEGF dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的C-末端或η-末端)的TNF α抗 体，例如具有SEQ ID NO :75、78或185中所述的重链序列的mAbdAb。本发明抗原结合构建体可对不止一种抗原具有特异性，例如其中所述抗原结合构 建体能够结合TNFa及选自IL-4和IL-13的一种或两种抗原，例如其中所述抗原结合构建 体能够结合TNF α和IL-4，或其中所述抗原结合构建体能够结合TNF α和IL-13，或其中所 述抗原结合构建体能够结合TNF α和IL-13和IL-4。所述抗原结合构建体实例包括具有对 TNF α具有特异性的表位结合结构域(例如抗-TNF α adnectin,其连接到重链的c_末端或 η-末端或轻链的C-末端或η-末端)的IL-13抗体，例如具有SEQ ID NO 134或135中所 述的重链序列的mAbdAb。所述抗原结合构建体其它实例包括具有对TNF α具有特异性的表 位结合结构域(例如抗-TNF α adnectin,其连接到重链的c_末端或n_末端或轻链的c_末 端或η-末端)的IL-4抗体，例如具有SEQ ID NO 146或147中所述的重链序列的mAbdAb。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的VEGF表位结合结构域的 TNFa抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的VEGF表位结合结构域 的TNF α抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的VEGF表位结合结 构域的TNF α抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的VEGF表位结 合结构域的TNF α抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原 特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末 端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的TNF α表位结合结构域 的VEGF抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的TNF α表位结合结 构域的VEGF抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的TNFa表位 结合结构域的VEGF抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的TNF a 表位结合结构域的VEGF抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同 的抗原特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或 η-末端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。本发明抗原结合构建体包括对CD-20具有特异性的抗原结合构建体，例如包含能 够结合CD-20的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合CD-20的配对的VH/VL的 抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合⑶-20的抗体，例如，其可包含具有SEQ ID NO
16120和117的重链和轻链序列的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合⑶-20的dAb。 对⑶-20具有特异性的mAbdAb的实例为具有SEQ ID NO 116，118中所述的重链序列的 mAbdAb，或具有SEQ ID NO 119或121中所述的轻链序列的mAbdAb。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原特异性的另外 的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末端和/或轻链 的C-末端禾口 /或η-末端。本发明抗原结合构建体包括对ILlRl具有特异性的抗原结合构建体，例如包含能 够结合ILlRl的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合ILlRl的配对的VH/VL的 抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合ILlRl的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合 ILlRl 的 dAb。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体对不止一种抗原具有特异性，例如其 中所述抗原结合构建体能够结合ILlRl和第二种抗原，例如其中所述抗原结合构建体能够 结合ILlRl和VEGF。所述抗原结合构建体实例包括具有对VEGF具有特异性的表位结合结 构域(例如抗-VEGF dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的c_末端或n_末端) 的ILlRl抗体，例如具有SEQ ID NO 77中所述的轻链序列的mAbdAb。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的VEGF表位结合结构域的 ILlRl抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的VEGF表位结合结构域 的ILlRl抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的VEGF表位结合结 构域的ILlRl抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的VEGF表位结 合结构域的ILlRl抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原 特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末 端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的η-末端的ILlRl表位结合结构域 的VEGF抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的η-末端的ILlRl表位结合结 构域的VEGF抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到重链的C-末端的ILlRl表位 结合结构域的VEGF抗体。本发明抗原结合构建体包括具有连接到轻链的C-末端的ILlRl 表位结合结构域的VEGF抗体。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同 的抗原特异性的另外的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或 η-末端和/或轻链的C-末端和/或η-末端。本发明抗原结合构建体包括对EGFR具有特异性的抗原结合构建体，例如所述抗 原结合构建体包含能够结合EGFR的表位结合结构域，或包含结合EGFR的配对的VH/VL。抗原结合构建体可包含能够结合EGFR的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合 EGFR的dAb。所述抗原结合构建体某些实例将能够结合包含SEQ ID NO 103的EGFR上的 表位，例如，包含 SEQ ID NO :97-SEQ ID N0:102 禾口 SEQ ID NO :104_SEQ ID N0:107 中所述 的CDR中的一个或多个的抗原结合构建体。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体对不止一种抗原具有特异性，例如其 中所述抗原结合构建体能够结合选自EGFR、IGF-1R、VEGFR2和VEGF的两个或多个抗原， 例如其中所述抗原结合构建体能够结合EGFR和IGF-1R，或其中所述抗原结合构建体能够结合EGFR和VEGF，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGF和IGF-1R，或其中所述抗 原结合构建体能够结合EGFR和VEGFR2，或其中所述抗原结合构建体能够结合IGF-IR和 VEGFR2,或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGF和VEGFR2，或其中所述抗原结合构建体 能够结合EGFR、IGF-IR和VEGFR2，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGF、IGF-IR和 VEGFR2,或其中所述抗原结合构建体能够结合EGFR、VEGF和VEGFR2，或其中所述抗原结合 构建体能够结合EGFR、VEGF和IGF1R。所述抗原结合构建体实例包括具有对VEGFR2具有 特异性的表位结合结构域(例如抗-VEGFR2 adnectin,其连接到重链的c_末端或n_末端 或轻链的C-末端或η-末端)的EGFR抗体，例如具有SEQ ID NO :136、140或144中所述的 重链序列和/或SEQ ID NO :138、142或145中所述的轻链序列的mAbdAb。所述抗原结合构建体实例包括具有对VEGF具有特异性的表位结合结构域(例如 抗-VEGF dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的c_末端或n_末端)的EGFR抗 体，例如具有SEQ ID NO 165、174、176、178、184或186中所述的重链序列和/或SEQ ID NO 188或190中所述的轻链序列的mAbdAb。所述抗原结合构建体实例包括具有对EGFR具有特异性的表位结合结构域(例如 抗-EGFR dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的c_末端或n_末端)的VEGF抗 体，例如具有SEQ ID NO 180中所述的重链序列的mAbdAb。所述mAbdAb还可包含SEQ ID NO 182中所述的轻链序列。所述抗原结合构建体实例包括具有对VEGF具有特异性的表位结合结构域(例如 抗-VEGF脂质运载蛋白，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的C-末端或η_末端)的 IGF-IR抗体，例如具有SEQ ID NO 123或125中所述的重链序列的mAbdAb。所述mAbdAb 还可包含SEQID NO 113中所述的轻链序列。所述抗原结合构建体实例包括具有对VEGFR2具有特异性的表位结合结构域(例 如抗-VEGFR2 adnectin,其连接到重链的c_末端或η-末端或轻链的c_末端或η-末端) 的IGF-IR抗体，例如具有SEQ ID NO 124或133中所述的重链序列的mAbdAb。所述mAbdAb 还可包含SEQID NO 113中所述的轻链序列。本发明抗原结合构建体包括对IL-23具有特异性的抗原结合构建体，例如包含能 够结合IL-23的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合IL-23的配对的VH/VL的 抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合IL-23的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合 IL-23 的 dAb。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体对不止一种抗原具有特异性，例如其 中所述抗原结合构建体能够结合选自TH17型细胞因子(例如IL-17、IL-22或IL-21)的 两种或更多种抗原，例如其中所述抗原结合构建体能够结合IL-23和IL-17，或其中所述 抗原结合构建体能够结合IL-23和IL-21，或其中所述抗原结合构建体能够结合IL-23和 IL-22。所述抗原结合构建体实例包括具有对IL-17具有特异性的表位结合结构域(例如 抗-IL-17dAb，其连接到重链的C-末端或η-末端或轻链的c_末端或n_末端)的IL-23抗 体。本发明抗原结合构建体包括对PDGFRa具有特异性的抗原结合构建体，例如，包 含能够结合PDGFR α的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合PDGFR α的配对的VH/VL的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合PDGFR α的抗体。抗原结合构 建体可包含能够结合PDGFR α的dAb。本发明抗原结合构建体包括对FGFRl具有特异性的抗原结合构建体，例如，包含 能够结合FGFRl的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合FGFRl的配对的VH/VL 的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合FGFRl的抗体。抗原结合构建体可包 含能够结合FGFRl的dAb。本发明抗原结合构建体包括对FGFR3具有特异性的抗原结合构建体，例如，包含 能够结合FGFR3的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合FGFR3的配对的VH/VL 的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合FGFR3的抗体。抗原结合构建体可包 含能够结合FGFR3的dAb。本发明抗原结合构建体包括对VEGFR2具有特异性的抗原结合构建体，例如，包含 能够结合VEGFR2的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合VEGFR2的配对的VH/VL 的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合VEGFR2的抗体。抗原结合构建体可包含能够结 合 VEGFR2 的 dAb。本发明抗原结合构建体包括对VEGFR3具有特异性的抗原结合构建体，例如，包含 能够结合VEGFR3的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合VEGFR3的配对的VH/VL 的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合VEGFR3的抗体。抗原结合构建体可包含能够结 合 VEGFR3 的 dAb。本发明抗原结合构建体包括对VE钙黏着蛋白(cadherin)具有特异性的抗原结合 构建体，例如，包含能够结合VE钙黏着蛋白的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含 结合VE钙黏着蛋白的配对的VH/VL的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合VE钙黏着蛋白的抗体。抗原结合构建体可包含 能够结合VE钙黏着蛋白的dAb。本发明抗原结合构建体包括对神经毡蛋白(neuropilin)具有特异性的抗原结合 构建体，例如，包含能够结合神经毡蛋白的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合 神经毡蛋白的配对的VH/VL的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合神经毡蛋白的抗体。抗原结合构建体可包含能够 结合神经毡蛋白的dAb。本发明抗原结合构建体包括对Flt-3具有特异性的抗原结合构建体，例如，包含 能够结合Flt-3的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合Flt-3的配对的VH/VL 的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合Flt-3的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合 Flt-3 的 dAb。本发明抗原结合构建体包括对ron具有特异性的抗原结合构建体，例如，包含能 够结合ron的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合ron的配对的VH/VL的抗原 结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合ron的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合
19ron 的 dAbo本发明抗原结合构建体包括对Trp-I具有特异性的抗原结合构建体，例如，包含 能够结合Trp-I的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合Trp-I的配对的VH/VL 的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合Trp-I的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合 Trp-I 的 dAb。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体对不止一种抗原具有特异性，例如其 中所述抗原结合构建体能够结合牵涉癌症的两种或更多种抗原，例如其中所述抗原结合 构建体能够结合选自以下的两种或更多种抗原PDGFRa、FGFRl、FGFR3、VEGFR2、VEGFR3、 IGF1R、EGFR和VEGF、VE钙黏着蛋白、神经毡蛋白、Flt_3、ron、Trp-I、CD-20，例如其中所述 抗原结合构建体能够结合PDGFR α和FGFRl，或其中所述抗原结合构建体能够结合PDGFR a 和VEGF，或其中所述抗原结合构建体能够结合PDGFR α和FGFR3，或其中所述抗原结合构建 体能够结合PDGFR α和VEGFR2，或其中所述抗原结合构建体能够结合PDGFR α和VEGFR3， 或其中所述抗原结合构建体能够结合PDGFR α和IGF1R，或其中所述抗原结合构建体能够 结合PDGFR α和EGFR，或其中所述抗原结合构建体能够结合PDGFR α和VEGF，或其中所述 抗原结合构建体能够结合PDGFR α和VE钙黏着蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结合 PDGFRa和神经毡蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结合PDGFR α和Flt_3，或其中所 述抗原结合构建体能够结合PDGFR α和ron，或其中所述抗原结合构建体能够结合PDGFR a 和Trpl，或其中所述抗原结合构建体能够结合PDGFRa和CD-20，或其中所述抗原结合构 建体能够结合FGFRl和FGFR3，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFRl和VEGFR2，或 其中所述抗原结合构建体能够结合FGFRl和VEGR3，或其中所述抗原结合构建体能够结 合FGFRl和IGF1R，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFRl和EGFR，或其中所述抗原 结合构建体能够结合FGFRl和VEGF，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFRl和VE钙 黏着蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFRl和神经毡蛋白，或其中所述抗原结 合构建体能够结合FGFRl和Flt-3，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFRl和ron， 或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFRl和Trp-Ι，或其中所述抗原结合构建体能够结 合FGFRl和CD-20，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFR3和VEGFR2，或其中所述抗 原结合构建体能够结合FGFR3和VEGFR3，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFR3和 IGF1R，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFR3和EGFR，或其中所述抗原结合构建体能 够结合FGFR3和VEGF，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFR3和VE钙黏着蛋白，或其 中所述抗原结合构建体能够结合FGFR3和神经毡蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结 合FGFR3和Flt-3，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFR3和ron，或其中所述抗原结 合构建体能够结合FGFR3和Trp-Ι，或其中所述抗原结合构建体能够结合FGFR3和CD-20， 或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR2和VEGFR3，或其中所述抗原结合构建体能够 结合VEGFR2和IGF1R，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR2和EGFR，或其中所述 抗原结合构建体能够结合VEGFR2和VEGF，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR2和 VE钙黏着蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR2和神经毡蛋白，或其中所述抗 原结合构建体能够结合VEGFR2和Flt-3，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR2和 ron,或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR2和Trp-Ι，或其中所述抗原结合构建体能
20够结合VEGFR2和CD-20，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR3和IGF-1R，或其中所 述抗原结合构建体能够结合VEGFR3和EGFR，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR3 和VEGF，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR3和VE钙黏着蛋白，或其中所述抗原 结合构建体能够结合VEGFR3和神经毡蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR3 和Flt-3，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGFR3和Trp-Ι，或其中所述抗原结合构建 体能够结合VEGFR3和⑶-20，或其中所述抗原结合构建体能够结合IGFlR和EGFR，或其中 所述抗原结合构建体能够结合IGFlR和VEGF，或其中所述抗原结合构建体能够结合IGFlR 和VE钙黏着蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结合IGFlR和神经毡蛋白，或其中所述 抗原结合构建体能够结合IGFlR和Flt-3，或其中所述抗原结合构建体能够结合IGFlR和 ron，或其中所述抗原结合构建体能够结合IGFlR和Trp-Ι，或其中所述抗原结合构建体能 够结合IGFlR和CD-20，或其中所述抗原结合构建体能够结合EGFR和VEGF，或其中所述抗 原结合构建体能够结合EGFR和VE钙黏着蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结合EGFR 和神经毡蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结合EGFR和Flt-3，或其中所述抗原结合 构建体能够结合EGFR和ron，或其中所述抗原结合构建体能够结合EGFR和Trp-Ι，或其中 所述抗原结合构建体能够结合EGFR和CD-20，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGF 和VE钙黏着蛋白，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGF和神经毡蛋白，或其中所述抗 原结合构建体能够结合VEGF和Flt-3，或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGF和ron， 或其中所述抗原结合构建体能够结合VEGF和Trp-Ι，或其中所述抗原结合构建体能够结 合VEGF和CD-20，或其中所述抗原结合构建体能够结合VE钙黏着蛋白和神经毡蛋白，或其 中所述抗原结合构建体能够结合VE钙黏着蛋白和Flt-3，或其中所述抗原结合构建体能够 结合VE钙黏着蛋白和ron，或其中所述抗原结合构建体能够结合VE钙黏着蛋白和Trp_l， 或其中所述抗原结合构建体能够结合VE钙黏着蛋白和CD-20，或其中所述抗原结合构建体 能够结合神经毡蛋白和Flt-3，或其中所述抗原结合构建体能够结合神经毡蛋白和ron，或 其中所述抗原结合构建体能够结合神经毡蛋白和Trp-Ι，或其中所述抗原结合构建体能够 结合神经毡蛋白和CD-20，或其中所述抗原结合构建体能够结合Flt-3和ron，或其中所述 抗原结合构建体能够结合Flt-3和Trp-Ι，或其中所述抗原结合构建体能够结合Flt-3和 CD-20，或其中所述抗原结合构建体能够结合ron和Trp-Ι，或其中所述抗原结合构建体能 够结合ron和⑶-20，或其中所述抗原结合构建体能够结合Trp-I和⑶-20。所述抗原结合构建体还可具有一个或多个具有相同或不同的抗原特异性的另外 的表位结合结构域，所述表位结合结构域连接到重链的C-末端和/或η-末端和/或轻链 的C-末端禾口 /或η-末端。本发明抗原结合构建体包括对β淀粉状蛋白具有特异性的抗原结合构建体，例 如，包含能够结合β淀粉状蛋白的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合β淀粉 状蛋白的配对的VH/VL的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合β淀粉状蛋白的抗体。抗原结合构建体可包含 能够结合β淀粉状蛋白的dAb。本发明抗原结合构建体包括对CD-3具有特异性的抗原结合构建体，例如，包含能 够结合CD-3的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合CD-3的配对的VH/VL的抗 原结合构建体。
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抗原结合构建体可包含能够结合CD-3的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合 CD-3 的 dAb。本发明抗原结合构建体包括对gpIIIb/IIa具有特异性的抗原结合构建体，例如， 包含能够结合gpIIIb/IIa的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合gpIIIb/IIa 的配对的VH/VL的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合gpIIIb/IIa的抗体。抗原结合构建体可包含能 够结合 gpIIIb/IIa 的 dAb。本发明抗原结合构建体包括对TGFi3具有特异性的抗原结合构建体，例如，包含 能够结合TGFii的表位结合结构域的抗原结合构建体，或包含结合TGFii的配对的VH/VL 的抗原结合构建体。抗原结合构建体可包含能够结合TGF β的抗体。抗原结合构建体可包含能够结合 TGFβ 的 dAb。在本发明一个实施方案中，提供本文所述的本发明抗原结合构建体，其包含致使 抗体具有降低的ADCC和/或补体激活或效应器功能的恒定区。在一个所述实施方案中，重 链恒定区可包含IgG2或IgG4同种型的天然丧失能力的恒定区或突变的IgGl恒定区。合 适修饰的实例阐述于EP0307434中。一个实例包括在235和237 (EU索引编号)位的丙氨 酸残基的取代。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体将保留Fc功能性，例如能够具有ADCC 和CDC活性之一或二者。所述抗原结合构建体可包含位于轻链(例如在轻链C-末端)上 的表位结合结构域。本发明还提供通过在抗体轻链上配置表位结合结构域，尤其是通过在轻链C-末 端配置表位结合结构域，来保持抗原结合构建体的ADCC和CDC功能的方法。所述ADCC和 CDC功能可通过任何合适的测定法来测量，例如实施例15. 3中所述的ADCC测定法和实施例 15. 4中所述的⑶C测定法。本发明还提供通过在抗体重链上配置表位结合结构域，尤其是通过在重链C-末 端配置表位结合结构域，来降低抗原结合构建体的CDC功能的方法。所述CDC功能可通过 任何合适的测定法来测量，例如实施例15. 4中所述的CDC测定法。在另一实施方案中，本发明抗原结合构建体能够结合选自VEGF、IGF-IR和EGFR的 两种或更多种抗原，例如，其能够结合EGFR和VEGF、或EGFR和IGF1R、或IGF1R和VEGF，或 例如其能够结合TNF和IL1-R。在包含IGF-IR结合位点的本发明实施方案中，本发明抗原 结合构建体的IGF-IR结合位点可包含在蛋白质骨架中的配对的VH/VL结构域，所述配对的 VH/VL结构域可包含选自以下的序列中所述的CDR中的一个或多个SEQ ID NO 80、SEQ ID N0:81、SEQID NO :82、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO :85 禾口 SEQ IDNO :86，例如， 其可包含至少SEQ ID NO :80中所述的CDRH3，例如，其可包含SEQ ID NO 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID N0:82、SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 85 禾口 SEQ ID NO :86 中所述的所有 CDR。在包含EGFR结合位点的本发明实施方案中，本发明抗原结合构建体可结合包含 成熟或正常或野生型EGFR序列的第273-501位残基的表位，例如，其可结合包含成熟或正 常或野生型EGFR的第287-302位残基(SEQ ID NO 103)的表位。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体的EGFR结合位点可包含在蛋白质骨架中的配对的VH/VL结构域，所述配对的VH/VL结构域可包含选自以下序列中所述的CDR 中的一个或多个:SEQ ID NO :104、SEQ ID NO :105、SEQ ID NO :106、SEQ ID NO :100、SEQ ID NO: 101和SEQ ID NO 102，例如，其可包含SEQ ID NO 106中所述的CDRH3，或其可包含 SEQ ID N0:104、SEQ ID N0:105、SEQ ID N0:106、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:101 禾口 SEQ ID NO 102中所述的所有6个⑶R。所述配对的VH/VL结构域可进一步包含另外的残基，尤 其是在重链⑶R中，在一个实施方案中，⑶RHl可包含SEQ ID NO 104加上至多5个另外的 残基，例如，SEQ ID NO :97中所述的5个另外的残基中的一个或多个，⑶RH2可包含SEQ ID NO 105加上至多2个另外的残基，例如SEQ ID NO 98和SEQ ID NO 107中所述的2个另 外的残基中的一个或两个，而⑶RH3可包含SEQ ID NO 106加上至多2个另外的残基，例如 SEQ ID NO :99中所述的2个另外的残基中的一个或两个。在一个实施方案中，配对的VH/ VL包含以下序列中所述的CDR中的一个或多个SEQ ID NO 97、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO: 99,SEQ ID NO 100,SEQ ID NO 101 和 SEQ ID NO :102，例如，其可包含至少 SEQ ID NO 99 中所述的 CDRH3，例如，其可包含 SEQ ID NO 97、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 99、SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO 101和SEQ ID NO 102中所述的所有6个⑶R(合适的抗体的更详细的资 料可在 W002/092771 和 W02005/081854 中找到)。在一个实施方案中，抗原结合构建体包含作为结构域抗体(dAb)的表位结合结构 域，例如所述表位结合结构域可为人VH或人VL、或骆驼Vhh或鲨鱼dAb (NARV)。在一个实施方案中，抗原结合构建体包含作为选自以下的骨架衍生物的表位结合 结构域CTLA-4 (Evibody)；脂质运载蛋白；诸如蛋白A的Z-结构域等来源于蛋白A的分子 (Affibody，SpA)、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白，例如 GroEl 和 GroES ；转铁蛋 白(trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连凝集素)； 人Y-晶体蛋白和人泛素(affilin) ；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂蝎毒素kimitz型结构 域；和纤连蛋白(adnectin)；对它们都进行蛋白质工程改造以便实现与不同于天然配体的 配体结合。本发明抗原结合构建体可包含连接到表位结合结构域adnectin的蛋白质骨架， 例如含连接到重链C-末端的adnectin的IgG骨架；或其可包含连接到adnectin的蛋白质 骨架，例如含连接到重链η-末端的adnectin的IgG骨架；或其可包含连接到adnectin的蛋 白质骨架，例如含连接到轻链C-末端的adnectin的IgG骨架；或其可包含连接到adnectin 的蛋白质骨架，例如含连接到轻链η-末端的adnectin的IgG骨架。在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域CTLA-4的 IgG骨架，例如含连接到重链η-末端的CTLA-4的IgG骨架；或其可包含例如含连接到重链 C-末端的CTLA-4的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链η-末端的CTLA-4的IgG骨 架；或其可包含含连接到轻链C-末端的CTLA-4的IgG骨架。在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域脂质运载 蛋白的IgG骨架，例如含连接到重链η-末端的脂质运载蛋白的IgG骨架；或其可包含例如 含连接到重链C-末端的脂质运载蛋白的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链η-末端 的脂质运载蛋白的IgG骨架；或其可包含含连接到轻链C-末端的脂质运载蛋白的IgG骨
^K O在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域SpA的IgG骨架，例如含连接到重链η-末端的SpA的IgG骨架；或其可包含例如含连接到重链C-末端 的SpA的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链η-末端的SpA的IgG骨架；或其可包含 含连接到轻链C-末端的SpA的IgG骨架。在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域affibody 的IgG骨架，例如含连接到重链η-末端的affibody的IgG骨架；或其可包含例如含连接到 重链C-末端的affibody的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链n_末端的affibody 的IgG骨架；或其可包含含连接到轻链C-末端的affibody的IgG骨架。在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域affimer 的IgG骨架，例如含连接到重链η-末端的affimer的IgG骨架；或其可包含例如含连接到 重链C-末端的affimer的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链η-末端的affimer的 IgG骨架；或其可包含含连接到轻链C-末端的affimer的IgG骨架。在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域GroEI的 IgG骨架，例如含连接到重链η-末端的GroEI的IgG骨架；或其可包含例如含连接到重链 C-末端的GroEI的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链η-末端的GroEI的IgG骨架； 或其可包含含连接到轻链C-末端的GroEI的IgG骨架。在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域转铁蛋白 的IgG骨架，例如含连接到重链的η-末端的转铁蛋白的IgG骨架；或其可包含例如具有连 接到重链C-末端的转铁蛋白的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链η-末端的转铁蛋 白的IgG骨架；或其可包含含连接到轻链C-末端的转铁蛋白的IgG骨架。在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域GroES的 IgG骨架，例如含连接到重链的η-末端的GroES的IgG骨架；或其可包含例如具有连接到 重链C-末端的GroES的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链η-末端的GroES的IgG 骨架；或其可包含含连接到轻链C-末端的GroES的IgG骨架。在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域DARPin的 IgG骨架，例如含连接到重链η-末端的DARPin的IgG骨架；或其可包含例如含连接到重链 C-末端的DARPin的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链η-末端的DARPin的IgG骨 架；或其可包含含连接到轻链C-末端的DARPin的IgG骨架。在其它实施方案中，其可包含蛋白质骨架，例如连接到表位结合结构域肽适体的 IgG骨架，例如含连接到重链η-末端的肽适体的IgG骨架；或其可包含例如含连接到重链 C-末端的肽适体的IgG骨架；或其可包含例如含连接到轻链η-末端的肽适体的IgG骨架； 或其可包含含连接到轻链C-末端的肽适体的IgG骨架。在本发明一个实施方案中，有4个表位结合结构域，例如4结构域抗体，其中2个 表位结合结构域可对相同抗原具有特异性，或存在于抗原结合构建体的所有表位结合结构 域可对相同抗原具有特异性。可通过用接头将本发明蛋白质骨架连接到表位结合结构域。合适的接头实例包 括以下氨基酸序列所述氨基酸序列长度可为1个氨基酸到150个氨基酸，或1个氨基酸 到140个氨基酸，例如1个氨基酸-130个氨基酸，或1-120个氨基酸，或1_80个氨基酸，或 1-50个氨基酸，或1-20个氨基酸，或1-10个氨基酸，或5-18个氨基酸。所述序列可具有其 自己的三级结构，例如，本发明接头可包含单一可变结构域。在一个实施方案中，接头大小等同于单一可变结构域。合适的接头大小可为1-20埃，例如小于15埃或小于10埃或小于5埃。在本发明一个实施方案中，用接头将至少一个表位结合结构域直接连接到Ig骨 架，所述接头包含1-150个氨基酸，例如1-20个氨基酸，例如1-10个氨基酸。所述接头可 选自以下接头中的任何一种=SEQID N0:6-ll中所述的接头；‘STG’(丝氨酸、苏氨酸、甘 氨酸)；‘GSTG’或‘RS’ ；例如接头可为‘TVAAPS’，或接头可为‘GGGGS’。在本发明抗原结 合构建体中使用的接头可单独包含或除包含其它接头外还包含一组或多组GS残基，例如 ‘GSTVAAPS’或‘TVAAPSGS’或‘GSTVAAPSGS’。在另一实施方案中，在表位结合结构域(例 如dAb)与Ig骨架之间没有接头。在另一实施方案中，通过接头‘TVAAPS’将表位结合结构 域(例如dAb)连接到Ig骨架。在另一实施方案中，通过接头‘TVAAPSGS’将表位结合结构 域(例如dAb)连接到Ig骨架。在另一实施方案中，通过接头‘GS’将表位结合结构域(例 如dAb)连接到Ig骨架。在一个实施方案中，本发明抗原结合构建体包含能够结合人血清白蛋白的至少一 个表位结合结构域。在一个实施方案中，有至少3个抗原结合位点，例如有4或5或6或8或10个抗 原结合位点，并且抗原结合构建体能够结合至少3或4或5或6或8或10个抗原，例如其 能够同时结合3或4或5或6或8或10个抗原。本发明还提供用于医学的抗原结合构建体，例如用于制备用于治疗癌症或诸如哮 喘、风湿性关节炎或骨关节炎等炎性疾病的药物。本发明提供治疗罹患癌症或诸如哮喘、风湿性关节炎或骨关节炎等炎性疾病的患 者的方法，所述方法包括给予治疗量的本发明抗原结合构建体。本发明抗原结合构建体可用于治疗癌症或诸如哮喘、风湿性关节炎或骨关节炎等 炎性疾病。例如若蛋白质骨架含有源自具有效应器功能的抗体的Fc区，例如若蛋白质骨架 包含来自IgGl的CH2和CH3，则本发明抗原结合构建体可具有某些效应器功能。效应器功 能的水平可根据已知技术而变化，例如通过CH2结构域突变，例如其中IgGlCH2结构域在选 自239和332和330的位点具有一个或多个突变，例如突变选自S239D和I332E和A330L， 致使抗体效应器功能提高，和/或例如改变本发明抗原结合构建体的糖基化概况，致使Fc 区的岩藻糖基化降低。用于本发明的蛋白质骨架包括包含抗体所有结构域的完整单克隆抗体骨架，或本 发明蛋白质骨架可包含非常规抗体结构，例如单价抗体。所述单价抗体可包含配对的重链 和轻链，其中重链铰链区经过修饰致使重链不会同型二聚体化，例如阐述于W02007059782 中的单价抗体。其它单价抗体可包含配对的重链和轻链，它们与缺乏功能可变结构域和CHl 区的第二条重链二聚体化，其中第一条和第二条重链经过修饰致使它们形成异型二聚体而 不是同型二聚体，从而产生含两条重链和一条轻链的单价抗体，例如在W02006015371中所 述的单价抗体。所述单价抗体可提供表位结合结构域可连接的本发明蛋白质骨架，例如实 施例32所述的抗原结合构建体。用于本发明的表位结合结构域为独立于不同V区或结构域地特异性结合 抗原或表位的结构域，其可为结构域抗体，或可为选自以下的骨架衍生物的结构域
25CTLA-4 (Evibody)；脂质运载蛋白；源自蛋白A的分子，例如蛋白A的Z-结构域(Affibody， SpA)、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白，例如GroEl和GroES ；转铁蛋白 (trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连凝集素)；人 Y -晶体蛋白和人泛素(affilin) ；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂蝎毒素kimitz型结构域； 和纤连蛋白(adnectin)；它们已经过蛋白质工程改造以实现与不同于天然配体的配体结 合。在一个实施方案中，它们可为结构域抗体或其它合适的结构域，例如选自以下的结构 域CTLA-4、脂质运载蛋白、SpA、Aff ibody、avimer、GroEl、转铁蛋白、GroES和纤连蛋白。在 一个实施方案中，它们可选自dAb、Affibody、锚蛋白重复蛋白(DARPin)和adnectin。在另 一实施方案中，它们可选自Affibody、锚蛋白重复蛋白(DARPin)和adnectin。在另一实施 方案中，它们可为结构域抗体，例如选自人、骆驼或鲨鱼(NARV)结构域抗体的结构域抗体。可在一个或多个位置将表位结合结构域连接到蛋白质骨架。这些位置包括蛋白质 骨架的C-末端和N-末端，例如在IgG重链的C-末端和/或轻链的C-末端，或例如在IgG 重链的N-末端和/或轻链的N-末端。在一个实施方案中，将第一表位结合结构域连接到蛋白质骨架，将第二表位结合 结构域连接到第一表位结合结构域，例如，其中所述蛋白质骨架为IgG骨架，可将第一表位 结合结构域连接到IgG骨架重链的C-末端，并可将该表位结合结构域以其C-末端连接到 第二表位结合结构域；或例如，可将表位结合结构域连接到IgG骨架轻链的C-末端，并可让 该第一表位结合结构域进一步以其C-末端连接到第二表位结合结构域；或例如，可将第一 表位结合结构域连接到IgG骨架轻链的η-末端，并可让所述第一表位结合结构域进一步以 其η-末端连接到第二表位结合结构域；或例如，可将第一表位结合结构域连接到IgG骨架 重链的η-末端，并可让该第一表位结合结构域进一步以其η-末端连接到第二表位结合结 构域。所述抗原结合构建体实例阐述于实施例31中。当表位结合结构域为结构域抗体时，某些结构域抗体可适于骨架内的特定位置。用于本发明的结构域抗体可以在常规IgG重链和/或轻链的C-末端处连接。另 外，可将某些dAb连接到常规抗体重链和轻链两者的C-末端。在将dAb的N-末端融合到抗体恒定结构域(Ch3或CL)的构建体中，肽接头可辅助 dAb结合抗原。实际上，dAb的N-末端仅挨着涉及抗原结合活性的互补决定区(CDR)。因 此，短肽接头在表位结合结构域与蛋白质骨架的恒定结构域之间起间隔物的作用，其可使 得dAbCDR更易接触抗原，因此其可以以高亲和力结合。dAb与IgG连接所处的环境将根据它们所融合的抗体链而不同当在IgG骨架的抗体轻链的C-末端处融合时，预期每一个dAb位于抗体铰链和Fc 部分附近。很可能所述dAb彼此将离得较远。在常规抗体中，Fab片段之间的角度和每一 个Fab片段与Fc部分之间的角度可显著不同。很可能的是，对于mAbdAb而言，Fab片段之 间的角度将不会差异很大，同时对于每一 Fab片段与Fc部分之间的角度可观察到某程度的 角度限制。当在IgG骨架的抗体重链的C-末端处融合时，预期每一 dAb位于Fc部分的CH3结 构域附近。预期这不会影响Fc对Fc受体(例如c γ RI、II、III、FcRn)的结合特性，因为 这些受体结合(engage with)CH2结构域(对于Fc γ RI、II和III类受体而言)或结合CH2 和Ch3结构域之间的铰链(例如FcRn受体)。所述抗原结合构建体的另一特征为预期两个dAb在空间上彼此靠近，前提是由合适接头提供柔韧性，这些dAb甚至可形成同型二聚体， 从而累增成(Propagate)Fc部分的‘拉链式’四级结构，而这可因此提高构建体的稳定性。这样的结构上的考虑可有助于选择使表位结合结构域例如dAb连接到蛋白质骨 架例如抗体上的最合适的位置。抗原大小、其位置(在血液中或在细胞表面上)、其四级结构(单体或多聚体 结构)可变化。因存在铰链区，常规抗体无需特别设计就能作为衔接构建体(adaptor construct)起作用，其中在Fab片段的末端的两个抗原结合位点的方向可大幅度变化，因 此能适应抗原的分子特性及其环境。相比之下，连接到抗体或其它蛋白质骨架(例如包含 无铰链区抗体的蛋白质骨架)的dAb可能直接或间接地具有较小的结构柔韧性。了解溶液状态和Ab的结合模式也是有帮助的。积累了很多体外dAb在溶液中 可主要以单体、同型二聚体或多聚体形式存在的证据(Reiter等(1999) J Mol Biol 290 第 685-698 页；Ewert 等(2003) J MolBiol 325，第 531-553 页 Jespers 等(2004) J Mol Biol 337 第 893-903 页 Jespers 等(2004) Nat Biotechnol 22 第 1161-1165 页；Martin 等(1997) Protein Eng. 10 第 607-614 页；Sepulvada ^ (2003) J Mol Biol 333 第 355-365 页)。这很容易让人联想到体内观察到的Ig结构域的多聚体化事件，例如Bence-Jones蛋 白(它们为免疫球蛋白轻链的二聚体(Epp等(1975)Biochemistry 14第4943-4952页； Huan 等(1994)Biochemistry33 第 14848-14857 页；Huang 等(1997)Mol immunol 34 第 1291-1301 页)和淀粉样纤维(James 等(2007) J Mol Biol. 367 :603_8)。例如，对于易于在溶液中二聚体化的结构域抗体，可能期需使其与Fc部分的C-末 端连接优先于与轻链C-末端连接，因为与Fc的C-末端连接将使得那些dAb在本发明抗原 结合构建体的情况下二聚体化。本发明抗原结合构建体可包含对单一抗原具有特异性的抗原结合位点，或可具 有对两种或更多种抗原具有特异性或对单一抗原上的两个或多个表位具有特异性的抗原 结合位点，或可存在每一个都对相同或不同的抗原上的不同的表位有特异性的抗原结合位
点ο抗原结合位点可各自对抗原具有结合特异性，所述抗原例如人或动物蛋白质，包 括细胞因子、生长因子、细胞因子受体、生长因子受体、酶(例如蛋白酶)、酶的辅因子、DNA 结合蛋白、脂质和糖类。包括细胞因子、生长因子、细胞因子受体、生长因子受体和其它蛋 白质在内的合适的靶标包括但不限于ApoE、Apo-SAA, BDNF、心肌营养蛋白-1、CEA、⑶40、 CD40 配体、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF 受体、ENA-78、嗜伊红细胞趋化因子(Eotaxin)、 嗜伊红细胞趋化因子_2、Exodus-2、FAP α、酸性FGF、碱性FGF、成纤维细胞生长因子-10、 FLT3配体、CXXXC趋化分子(CX3C)、⑶NF、G-CSF, GM-CSF, GF-β 1、人血清白蛋白、胰岛素、 IFN-Y、IGF-I, IGF-I I, IL-I α、IL-I β、IL-1 受体、IL-I 受体 1 型、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8 (72 个氨基酸)、IL-8 (77 个氨基酸)、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、ΙΡ-10、角质形成细胞生长 因子-2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴细胞趋化蛋白、穆勒氏抑制物(Mullerian inhibitory substance)、单核细胞集落抑制因子、单核细胞引诱蛋白(monocyte attractant protein)、M_CSF、c-fms、v-fmsMDC (67 个氨基酸)、MDC (69 个氨基酸)、MCP_1 (MCAF)、MCP_2、 MCP-3、MCP-4、MDC (67 个氨基酸)、MDC (69 个氨基酸)、MIG、MIP-I α、MIP-I β、ΜΙΡ—3 α、
27ΜΙΡ-3 β、ΜΙΡ-4、骨髓祖细胞抑制因子-1 (MPIF-I)、ΝΑΡ-2、神经营养因子(Neurturin)、神 经生长因子、β -NGF, ΝΤ-3、ΝΤ-4、制瘤素 M、PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4、RANTES, SDFl α ,SDFl β、SCF、SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β 2、TGF-β 3、月中 瘤坏死因子(TNF)、TNF- α、TNF- β、TNF 受体 I、TNF 受体 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、 VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受体 1、VEGF 受体 2、VEGF 受体 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO- β、 GRO-γ、HCCl、1-309、HER UHER 2,HER 3,HER 4、血清白蛋白、vWF、淀粉状蛋白(例如淀粉 状蛋白a)、MMP12、PDKl、IgE和本文公开的其它靶标。应该理解以上列举内容并不全面。在某些实施方案中，蛋白酶抗性肽或多肽结合肺组织中的靶标，例如选自以下的 革巴标TNFRl、IL-I、IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、 IL-12、IL-12R、IL-13、IL-13Ra 1、IL-13Ra 2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、 IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、 CD56、CD 138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、糜蛋白 酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜伊红细胞趋化因子类(例如嗜伊红细胞趋化因子、嗜伊 红细胞趋化因子_2、嗜伊红细胞趋化因子-3)、GM-CSF、ICAM-U I COS, IgE、IFNa、1-309、整 联蛋白、L-选择蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、中性粒细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、0X-40、 PARC、PD-I、RANTES、SCF、SDF-1、涎免凝集素 8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、类 胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α 4 β 7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、ανβ8、 cMET、CD8、vWF、淀粉状蛋白(例如淀粉状蛋白α )、MMP12、PDKl和IgE。具体而言，本发明抗原结合构建体可用于治疗与IL-13、IL_5和IL_4相关的疾病， 例如特应性皮炎、变应性鼻炎、克罗恩氏病(crohn’ sdisease)、C0PD、纤维化疾病或病况 例如特发性肺纤维化、进行性系统性硬化症、肝纤维化、肝肉芽肿、血吸虫病、利什曼病、细 胞周期调节病例如何杰金氏病(Hodgkins disease)』细胞慢性淋巴性白血病，例如所述构 建体可用于治疗哮喘。本发明抗原结合构建体可用于治疗与诸如IGF-1R、VEGF和EGFR等生长因子有关 的疾病，例如癌症或风湿性关节炎，其中可使用所述疗法治疗的癌症类型实例有乳腺癌、前 列腺癌、肺癌和骨髓瘤。本发明抗原结合构建体可用于治疗与TNF有关的疾病，例如关节炎，例如风湿性 关节炎或骨关节炎。本发明抗原结合构建体可用于治疗与ILl-R有关的疾病，例如关节炎，例如风湿 性关节炎或骨关节炎。本发明抗原结合构建体可用于治疗与CD-20有关的疾病，例如自身免疫性疾病， 例如牛皮癣、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、风湿性关节炎、青少年风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、诸如多发性硬化症等神经退行性疾病、诸如COPD等中性粒细胞驱动的疾 病、Wegener脉管炎、囊肿性纤维变性、斯耶格伦综合症(Sjogrenssyndrome)、慢性移植排 斥、1型糖尿病移植物抗宿主病、哮喘、变应性疾病异位性皮炎、湿疹皮炎、变应性鼻炎、包括 甲状腺炎、脊柱关节病、强直性脊柱炎、葡萄膜炎、多软骨炎或硬皮病在内的其它自身免疫 性疾病；或癌症，例如B-细胞淋巴瘤或成熟B细胞瘤，例如CLL或SLL。本发明抗原结合构建体可用于治疗与IL-17和IL-23有关的疾病，例如牛皮癣、 炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、风湿性关节炎、青少年风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、诸如多发性硬化症等神经退行性疾病、诸如COPD等中性粒细胞驱动的疾病、Wegener脉 管炎、囊肿性纤维变性、斯耶格伦综合症、慢性移植排斥、1型糖尿病移植物抗宿主病、哮喘、 变应性疾病异位性皮炎、湿疹皮炎、变应性鼻炎、包括甲状腺炎、脊柱关节病、强直性脊柱 炎、葡萄膜炎、多软骨炎或硬皮病在内的其它自身免疫性疾病。本发明抗原结合构建体可通过用包含编码本发明抗原结合构建体序列的表达载 体转染宿主细胞来产生。表达载体或重组质粒通过使这些编码抗原结合构建体的序列与常 规调控序列以可操作方式连接来产生，所述常规调控序列能够在宿主细胞中调控复制和表 达和/或调控从宿主细胞分泌。调控序列包括启动子序列(例如CMV启动子)和可源自其 它已知抗体的信号序列。同样地，可产生第二表达载体，其具有编码互补的抗原结合构建体 轻链或重链的DNA序列。在某些实施方案中，除了考虑编码序列和选择标记外，该第二表达 载体与第一表达载体相同，以确保尽可能每一条多肽链都能功能表达。或者，抗原结合构建 体的重链和轻链编码序列可位于单个载体上，例如在同一个载体的两个表达盒中。通过常规技术用第一和第二载体二者来共转染(或简单地通过单个载体转染)所 选择的宿主细胞，以制备包含重组或合成的轻链和重链二者的经转染的本发明宿主细胞。 然后通过常规技术培养所转染的细胞，以产生工程改造的本发明抗原结合构建体。通过诸 如ELISA或RIA等合适的测定法，从培养物中筛选包含重组重链和/或轻链二者结合的抗 原结合构建体。可采用类似的常规技术来构建其它抗原结合构建体。本领域技术人员可选择用于本发明方法及组合物构建中所用的克隆和亚克隆步 骤的合适载体。例如，可使用常规PUC系列克隆载体。一种载体pUC19可购自供应商，例如 Amersham(Buckinghamshire, United Kingdom)或 Pharmacia(Uppsala，Sweden)。另夕卜，會邑 够容易地复制，具有大量的克隆位点及选择基因(例如抗生素抗性)并易于操作的任何载 体都可用于克隆。因此，克隆载体的选择不是本发明的限制因素。表达载体的特征还可在于适用于扩增异源DNA序列表达的基因，例如哺乳动物二 氢叶酸还原酶基因(DHFR)。其它优选的载体序列包括聚A信号序列，例如来自牛生长激素 (BGH)和β球蛋白启动子序列(i^glopro)。可通过本领域技术人员众所周知的技术合成 用于本文的表达载体。可通过市购或天然来源获得或通过已知方法合成所述载体组分，例如复制子、选 择基因、增强子、启动子、信号序列等等，用于指导在所选宿主中表达和/或分泌重组DNA产 物。为了该目的也可选择本领域已知的用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达的众多 类型的其它合适的表达载体。本发明还包括用含有编码本发明抗原结合构建体的序列的重组质粒转染的细胞 系。用于克隆及用于这些克隆载体的其它操作的宿主细胞也为常规宿主细胞。然而，可将 来自不同大肠杆菌(E. coli)株系的细胞用于复制克隆载体和构建本发明抗原结合构建体 的其它步骤。用于表达本发明抗原结合构建体的合适的宿主细胞或细胞系包括哺乳动物细胞， 例如NS0、Sp2/0、CH0 (例如DG44)、⑶S、HEK、成纤维细胞细胞(例如3T3)和骨髓瘤细胞，例 如，其可在CHO或骨髓瘤细胞中表达。可使用人细胞，由此使得分子可以以人糖基化型式来 修饰。或者，可使用其它真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择及用于转化、培养、 扩增、筛选和产物产生及纯化的方法为本领域所知。参见例如上面引用的Sambrook等。
可证明细菌细胞作为宿主细胞适用于表达重组FAb或本发明其它实施方案(参 见例如 Pliickthun，Α.，Immunol. Rev.，130 151-188 (1992))。然而，由于在细菌细胞中表 达的蛋白质倾向于非折叠或不恰当折叠形式或呈非糖基化的形式，在细菌细胞中产生的任 何重组Fab将必须为保留抗原结合能力接受筛选。如果由细菌细胞表达的分子以合适的 折叠形式产生，那么该细菌细胞将是所期需的宿主，或在备选实施方案中该分子可在细菌 宿主中表达然后接着重折叠。例如，用于表达的不同株系的大肠杆菌是生物技术领域众所 周知的宿主细胞。在该方法中还可采用不同株系的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、链霉菌 (Streptomyces)、其它杆菌等。若需要，本领域技术人员已知的酵母菌细胞株系以及昆虫细胞(例如果蝇 (Drosophila)和鳞翅目(L印idoptera))和病毒表达系统也可作为宿主细胞使用。参见例 如 Miller 等，Genetic Engineering, 8 :277_298，PlenumPress (1986)及其中引用的参考文 献。可构建载体的通用方法、产生本发明宿主细胞所需的转染方法和从所述宿主细胞 产生本发明抗原结合构建体所需的培养方法，都可为常规技术。通常，本发明培养方法为无 血清培养方法，通常是通过在无血清混悬液中培养细胞。同样地，产生本发明抗原结合构建 体后，可按照本领域标准方法将其从细胞培养内含物中纯化，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲 和柱、柱色谱、凝胶电泳等等。所述技术在本领域技术范围内，其不构成对本发明的限制。例 如，改变的抗体的制备阐述于WO 99/58679和WO 96/16990中。表达抗原结合构建体的又一方法可利用在转基因动物中的表达，例如如美国专利 第4，873，316号所述。其涉及使用动物酪蛋白启动子的表达系统，当将其通过转基因纳入 到哺乳动物中时，使得雌性动物可在其乳汁中产生所需的重组蛋白质。本发明另一方面提供制备本发明抗体的方法，所述方法包括培养用编码本发明抗 体轻链和/或重链的载体转化的或转染的宿主细胞并回收藉此产生的抗体的步骤。本发明提供制备本发明抗原结合构建体的方法，该方法包括以下步骤(a)提供编码抗原结合构建体重链的第一载体；(b)提供编码抗原结合构建体轻链的第二载体；(c)用所述第一和第二载体转化哺乳动物宿主细胞(例如CH0)；(d)在有助于从所述宿主细胞分泌抗原结合构建体到所述培养基中的条件下培养 步骤(c)的宿主细胞；(e)回收步骤(d)所分泌的抗原结合构建体。一旦用所需方法表达抗原结合构建体后，通过用合适的测定法来检查其体外活 性。目前采用常规ELISA测定方式以评估抗原结合构建体与其靶标的定性及定量结合。另 外，还可使用其它体外测定法来验证中和效价，之后进行后续的人临床研究以评估忽略常 规清除机制的抗原结合构建体在体内的持续性。治疗剂量及持续时间涉及本发明分子在人循环中的相对持续时间，可由本领域技 术人员根据待治疗病症及患者的一般健康状况来调整。可设想的是，可能需要长期(例如 4-6个月)重复给药(例如每周1次或每2周1次)以达到最佳治疗效果。本发明治疗剂的给药方式可为将药物递送给宿主的任何合适的途径。本发明抗
30原结合构建体和药用组合物尤其适用于胃肠外给予，即皮下(s. C.)、鞘内、腹膜内、肌肉内 (i.m.)、静脉内(i.v.)或鼻内给予。可将本发明治疗剂制备成在可药用载体中含有作为活性成分的有效量的本发明 抗原结合构建体的药用组合物。在本发明预防性药物中，优选以注射即用的形式并优选以 生理PH缓冲的含有抗原结合构建体的水性混悬剂或溶液剂。胃肠外给予的组合物通常应 包含本发明抗原结合构建体溶液或其溶解于可药用载体(优选水性载体)的混合物。可采 用多种水性载体，例如0. 9%盐水、0. 3%甘氨酸等。这些溶液可无菌制备并通常不含微粒物 质。可通过众所周知的常规灭菌技术(例如过滤)使这些溶液无菌。根据接近生理条件的 需要，组合物可含有可药用辅助物质(例如PH调节剂和缓冲剂等)。在所述药物制剂中的 本发明抗原结合构建体的浓度可大范围变化，即从小于约0. 5%、通常为或至少约到差 不多15或20%重量，其主要基于流液体积、粘度等根据所选的特定给药方式来选择。因此，用于肌内注射的本发明药用组合物可制备为含有ImL无菌缓冲水及以下 量的本发明抗原结合构建体约Ing-约lOOmg，例如约50ng-约30mg或更优选约5mg-约 25mg。相似地，用于静脉内输注的本发明药用组合物可制备为含有约250ml无菌林格氏液 和每毫升林格氏液约Img-约30mg并优选5mg-约25mg的本发明抗原结合构建体。用于制 备可胃肠外给予的组合物的实际方法众所周知，或对本领域技术人员显而易见，其详述于 例如Remington' sPharmaceutical Science,第 15版,Mack Publishing Company,Easton, Pennsylvania中。关于制备可静脉内给予的本发明抗原结合构建体制剂，参见Lasmar U 禾口 Parkins D"The formulation of Biopharmaceuticalproducts (生物药物制品配制)，，， Pharma. Sci. Tech. today，第 129-137 页，第 3 卷(200 年 4 月 3 日)；Wang，W"Instability， stabilisation andformulation of liquid protein pharmaceuticals ( M ^ M I=I ^J 物制剂的不稳定性、稳定化及配制)”，Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188 ；Ahem Τ. J.， Manning Μ· C.主 编 的 Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B, New York, NY :Plenum Press (1992) ；Akers, Μ. J. "Excipient-Druginteractions in Parenteral Formulations (胃肠外制剂中赋形剂-药物之间的相互作用)”，J. Pharm Sci 91 (2002)2283-2300 ；Imamura, K 等"Effectsof types of sugar on stabilization of Protein in the dried state (糖种类对干态蛋白质稳定化的作用)”，J Pharm Sci 92(2003) 266-274 ；Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protei n-structure-stabilizingeffect during freeze—drying (在冻干期间赋形剂结晶及 其蛋白质结构稳定化作用)”，J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039 Johnson, R, “Mannito1-sucrose mixtures-versatile formulations for proteinlyophilization(用 于蛋白质冻干的甘露醇_蔗糖混合物多功能制剂)，，，J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922 ；Ha, E Wang W, Wang Yj. "Peroxideformation in polysorbate 80 and protein stability (在聚 山梨醇酯80中过氧化物的形成和蛋白质稳定性)”，J. Pharm Sci，91，2252-2264，(2002)， 它们的整体内容在此弓I作参考，读者尤其应参考这些文献。 优选本发明治疗剂在药物制剂中呈单位剂量形式存在。合适的治疗有效剂量将易 于由本领域技术人员确定。可按照其体重计算患者的合适的剂量，例如，合适的剂量可在 以下范围内0. 01-20mg/kg,例如 0. l-20mg/kg,例如 l_20mg/kg，例如 10_20mg/kg 或例如 l-15mg/kg，例如10-15mg/kg。为了有效治疗病症，在本发明中人使用的合适的剂量可在以下范围内0. Ol-lOOOmg，例如 0. Ι-lOOOmg，例如 0. l_500mg，例如 500mg，例如 0. I-IOOmg 或 0. l-80mg,或0. l-60mg或0. l_40mg，或例如I-IOOmg或l_50mg的本发明抗原结合构建体， 它们可经胃肠外给予，例如经皮下、静脉内或肌肉内给予。若有需要，所述剂量可以以合适 的时间间隔重复给予，这由医生适当选择。本文所述抗原结合构建体可冻干储存，并在使用前以合适的载体复溶。该技术显 示对常规免疫球蛋白有效，可采用本领域已知的冻干和复溶技术。有若干种本领域已知的方法可用于发现本发明使用的表位结合结构域。术语“文库”指异质的多肽或核酸的混合物。文库由成员组成，每一个成员具有单 个多肽或核酸序列。在这个意义上，“文库”是“谱(repertoire)”的同义词。文库成员之 间的序列差异是造成文库中存在多样性的原因。文库可呈简单的多肽或核酸混合物形式， 或可呈用核酸文库转化的生物体或细胞形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等等。在一 个实例中，每一个单独的生物体或细胞仅含有一个或有限个数的文库成员。有利的是，为了 使得由核酸编码的多肽表达，可将该核酸纳入到表达载体中。因此，在一个方面，文库可呈 宿主生物体群的形式，每一生物体含有表达载体的一个或多个拷贝，所述表达载体含有核 酸形式的单个文库成员，其可被表达以产生其对应的多肽成员。因此，宿主生物体群具有编 码多种多肽的众多谱的可能性。“通用构架”是对应于抗体序列保守区的单独的抗体构架序列，其如Kabat所定义 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest ( 贞目的 的胃白歹I」)，，， US Department of Health and Human Service)，或为对应于人种系免疫球蛋白谱或结构 的单独的抗体构架序列，其如Chothia和Lesk，(1987) J. Mol. Biol. 196 :910_917所定义。 可有单一构架或一套所述构架，业已发现它们尽管只在超变区变化，但使得可衍生几乎任 何结合特异性。在一个实施方案中，用算法BLAST 2 Sequences使用缺省参数(Tatusova， Τ. Α.等，FEMS Microbiol Lett，174 187-188 (1999))，来制备并测定本文所定义的氨基酸 和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性。表位结合结构域和抗原结合位点可各自对通用配体(genericligand)或任何所 需靶配体具有结合特异性，所述配体例如人或动物蛋白，包括细胞因子、生长因子、细胞因 子受体、生长因子受体、酶(例如蛋白酶)、酶的辅因子、DNA结合蛋白、脂质和糖类。包括细 胞因子、生长因子、细胞因子受体、生长因子受体和其它蛋白在内的合适的靶标包括但不限 于ApoE、Apo-SAA, BDNF、心肌营养蛋白-1、CEA、CD40、CD40 配体、CD56、CD38、CD138、EGF、 EGF受体、ENA-78、嗜伊红细胞趋化因子、嗜伊红细胞趋化因子-2、Exodus_2、FAPa、酸性 FGF、碱性FGF、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、CXXXC趋化分子(CX3C)、⑶NF、G-CSF, GM-CSF、GF-β 1、人血清白蛋白、胰岛素、IFNi、IGF-I, IGF-II, IL-I a、IL-I β、IL-I 受 体、IL-I 受体 1 型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL_8(72 个氨基酸)、IL_8(77 个 氨基酸)、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、抑制素 α、抑制素β、ΙΡ-10、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴细胞趋化蛋 白、穆勒氏抑制物、单核细胞集落抑制因子、单核细胞引诱蛋白、M-CSF、c-fmS、V-fmsMDC(67 个氨基酸)、MDC (69 个氨基酸)、MCP-I (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67 个氨基酸)、 MDC(69 个氨基酸)、MIG、MIP-I a、MIP-I β、ΜΙΡ—3 a、MIP—3 β、MIP-4、骨髓祖细胞抑制因子-1 (MPIF-I)、NAP-2、神经营养因子、神经生长因子、β-NGF、ΝΤ-3、ΝΤ-4、制瘤素Μ、 PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4、RANTES, SDFl α、SDFl β、SCF, SCGF、干细胞因子(SCF)、 TARC, TGF- α、TGF- β、TGF- β 2、TGF- β 3、月中瘤坏死因子(TNF)、TNF- α、TNF- β、TNF 受体 I、TNF 受体 II、TNIL-I、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受体 1、VEGF 受 体 2、VEGF 受体 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO- β、GRO- y、HCCl、1-309、HERl、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、淀粉状蛋白(例如淀粉状蛋白a)、MMP12、PDKl、IgE和本文公开的其 它靶标。应该了解该名单并非详尽无遗。在某些实施方案中，结合的是肺组织中的靶标，例如选自以下的靶标TNFR1、 IL-U IL-1R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、 IL-12R、IL-13、IL-13Ra 1、IL_13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、 IL-23 IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CDl la、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、 CD138、ALK5、EGFR、FcERU TGFb, CCL2、CCL18、CEA, CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-I)、糜蛋白酶、 FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜伊红细胞趋化因子(例如嗜伊红细胞趋化因子、嗜伊红细胞 趋化因子_2、嗜伊红细胞趋化因子_3),GM-CSF, ICAM-1、ICOS、IgE, IFNa, 1_309、整联蛋白、 L-选择蛋白、MIF、MIP4、MDC、MCP-I、MMP、中性粒细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、0X-40、PARC、 PD-I、RANTES、SCF、SDF-I、涎免凝集素 8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-I、TNF、TRANCE、类胰蛋白 g|、VEGF、VLA_4、VCAM、α 4 β 7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、α νβ 8,cMET, ⑶8、vWF、淀粉状蛋白(例如淀粉状蛋白a)、MMP12、PDKl和IgE。当在本文所述方法中使用展示系统(例如联系核酸的编码功能与核酸编码的肽 或多肽的功能特性的展示系统)时，例如选择dAb或其它表位结合结构域时，通常有利的是 扩增或增加编码所选择的肽或多肽的核酸的拷贝数。这提供了有效方法来获得足够量核酸 和/或肽或多肽，以用于通过本文所述方法或其它合适的方法进行另外轮次的选择，或用 于制备另外的谱(例如亲和力成熟谱)。因此，在某些实施方案中，选择表位结合结构域的 方法包括使用展示系统(例如联系核酸的编码功能和核酸编码的肽或多肽的功能特性的 展示系统，例如噬菌体展示)，并另外包括扩增或增加编码所选择的肽或多肽的核酸的拷贝 数。可用任何合适的方法例如通过噬菌体扩增、细胞生长或聚合酶链式反应扩增核酸。在一个实例中，所述方法采用联系核酸编码功能和核酸编码的多肽的物理、化 学和/或功能特性的展示系统。这样的展示系统可包含多个可复制的遗传包(genetic package)，例如噬菌体或细胞(细菌)。展示系统可包含文库，例如噬菌体展示文库。噬菌 体展示是展示系统的实例。业已阐述多种合适的噬菌体展示系统(例如单价展示和多价展示系统)。(参 见例如Griffiths等，美国专利第6，555，313 Bl号(在此引作参考)Johnson等，美国 专利第5，733，743号(在此引作参考)；McCafferty等，美国专利第5，969，108号(在 此引作参考)；Mulligan-Kehoe，美国专利第5，702，892号(在此引作参考)；Winter, G.等，Annu. Rev.Immunol. 12 :433_455 (1994) ；Soumillion, P.等，Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3) 175-189 (1994) ；Castagnoli, L.等，Comb. Chem. HighThroughput Screen(高通量筛选)，4(2) 121-133 (2001))。在噬菌体展示系统中展示的肽或多肽可在 任何合适的噬菌体上展示，举例而言，所述细菌噬菌体例如丝状噬菌体(例如fd、M13、Fl)、 裂解性噬菌体(例如T4、T7、λ )或RNA噬菌体(例如MS2)。
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通常产生或提供展示作为含合适噬菌体衣壳蛋白(例如fd pill蛋白)的融合蛋 白的肽或噬菌体多肽的谱的噬菌体文库。融合蛋白可在噬菌体衣壳蛋白的末端或若需要在 内部位置展示肽或多肽。例如，被展示的肽或多肽可存在于PlII的氨基末端到结构域1的 位置。(pill的结构域1也被称为Ni)。可将被展示的多肽直接融合到pill (例如pill的 结构域1的N-末端)，或用接头融合到pill。若有需要，融合体可进一步包含标签(tag) (例如myc表位、His标签)。用任何合适的方法可产生包含作为含噬菌体衣壳蛋白的融 合蛋白展示的肽谱或多肽谱的文库，例如通过将编码被展示的肽或多肽的噬菌体载体或噬 菌粒载体的文库引入到合适的宿主细菌，并培养所得到的细菌以产生噬菌体(例如若有需 要，则用合适的辅助噬菌体或补充质粒(complementingplasmid))。可用任何合适的方法 (例如沉淀和离心)从培养物回收噬菌体文库。展示系统可包含含有任何所需多样性量的肽谱或多肽谱。例如，所述谱可含有具 有对应于由一种生物体、一组生物体、所需组织或所需细胞类型表达的天然存在多肽的氨 基酸序列的肽或多肽，或可含有具有随机或随机化氨基酸序列的肽或多肽。若有需要，多肽 可享有共同核心或骨架。例如，谱或文库中的所有多肽可基于选自以下的骨架蛋白A、蛋 白L、蛋白G、纤连蛋白结构域、anticalin、CTLA4、所需酶(例如聚合酶、纤维素酶)或来自 免疫球蛋白超家族的多肽，例如抗体或抗体片段(例如抗体可变结构域)。在谱或文库中 的多肽可包含随机或随机化氨基酸序列的限定区及共有氨基酸序列的区。在某些实施方案 中，谱中所有或基本上所有多肽为所需类型，例如所需的酶(例如聚合酶)或所需的抗体的 抗原结合片段(例如人Vh或人VJ。在某些实施方案中，多肽展示系统包含多肽谱，其中每 一个多肽包含抗体可变结构域。例如，谱中的每一个多肽可含有Vh、&或Fv(例如单链Fv)。可用任何合适的方法将氨基酸序列多样性引入到肽或多肽或骨架的任何所需区 域中。例如，可通过用任何合适的诱变方法(例如低保真度PCR、寡核苷酸介导的诱变或定 点诱变、用NNK密码子多样化)或任何其它合适的方法制备编码多样化的多肽的核酸文库， 来将氨基酸序列多样性引入靶区域，例如抗体可变结构域的互补决定区或疏水结构域。若 有需要，可使待多样化的多肽区域随机化。构成谱的多肽的大小是主要的选择问题，多肽大小不必一致。谱中的多肽可具有 至少三级结构(形成至少一个结构域)。选择/分离/回收可用任何合适的方法从谱或文库(例如在展示系统中)选择、分离和/或回收表 位结合结构域或结构域群。例如，基于选择特性(例如物理特性、化学特性、功能特性)来 选择或分离结构域。合适的选择性功能特性包括谱中的肽或多肽的生物活性，例如结合通 用配体(例如超抗原)、结合靶配体(例如抗原、表位、底物)、结合抗体(例如通过在肽或 多肽上表达的表位)和催化活性。(参见例如，Tomlinson等，W099/20749 ；WO 01/57065 ； WO 99/58655)。在某些实施方案中，从基本上所有结构域共享共同的选择性特征的肽或多肽文库 或谱中选择和/或分离蛋白酶抗性肽或多肽。例如，结构域可选自其中基本上所有结构域 具有以下特征的文库或谱结合共同的通用配体、结合共同的靶配体、结合共同抗体(或被 共同抗体结合)或拥有共同的催化活性。该选择类型尤其可用于制备基于具有所需生物活 性的母体肽或多肽的结构域谱，例如当实施免疫球蛋白单一可变结构域的亲和力成熟时。
基于结合共同通用配体的选择可产生含有作为原始文库或谱组分的所有或基本 上所有结构域的结构域集或群。例如，可通过淘选或用合适的亲和基质选择、分离和/或回 收结合靶配体或通用配体(例如蛋白A、蛋白L或抗体)的结构域。可通过将配体(例如通 用配体、靶配体)溶液加入到合适的容器(例如试管、培养皿)中并使配体沉积或覆盖在容 器壁上来实施淘选。可洗掉过量配体，可将结构域加到容器中，并将容器保持在适于肽或多 肽结合固定化配体的条件下。可洗掉未结合的结构域，并可例如用任何合适的方法(例如 刮擦或降低PH)来回收结合的结构域。合适的配体亲和基质通常含有配体共价或非共价连接其上的固相支持体或珠粒 (例如琼脂糖)。可在适用于使结构域与基质上的配体结合的条件下用批处理、柱处理或任 何其它合适的处理使亲和基质与肽或多肽(例如业已与蛋白酶孵育的谱)结合。可洗掉不 结合亲和基质的结构域，用任何合适的方法洗脱并回收已结合的结构域，例如用较低PH的 缓冲液、用温和变性剂(例如尿素)或用竞争结合配体的肽或结构域洗脱。在一个实例中， 在适用于使谱中的结构域与靶配体结合的条件下让生物素化的靶配体与谱结合。用固定化 (例如在珠粒上)的亲和素或链霉亲和素回收已结合的结构域。在某些实施方案中，通用配体或靶配体为抗体或其抗原结合片段。与在文库或谱 的肽或多肽中基本上保守的肽或多肽的结构特征结合的抗体或抗原结合片段尤其可用作 通用配体。适于用作分离、选择和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽所用的配体的抗体和抗原 结合片段可为单克隆或多克隆的，并可用任何合适的方法制备。文库/谱可用任何合适的方法制备或获得编码和/或含有蛋白酶表位结合结构域的文库。 可设计文库以编码基于目标结构域或骨架(例如选自文库的结构域)的结构域，或可用本 文所述方法从另一文库中选择文库。例如，可用合适的多肽展示系统来制备富含结构域的 文库。可用任何合适的方法容易地产生编码所需结构域类型的谱的文库。例如，可获 得编码所需多肽类型(例如免疫球蛋白可变结构域)的核酸序列，并且可例如通过用易 错的聚合酶链式反应(PCR)系统扩增核酸、通过化学诱变(Deng等，J. Biol. Chem.，269 9533(1994))或用细菌增变株(LoW等，J. Mol. Biol.，260 =359(1996))来制备每一个含有一 个或多个突变的核酸集合。在其它实施方案中，为了多样化可以特定的核酸区作为靶标。用于在所选择的位 置进行突变的方法在本领域亦众所周知，包括例如在用或不用PCR时使用错配的寡核苷酸 或简并的寡核苷酸。例如，通过将突变靶向抗原结合环来产生合成的抗体文库。业已将随机 或半-随机抗体H3和L3区添加到种系免疫球蛋白V基因区段，以产生含未突变构架区的大 文库(Hoogenboom 和 Winter (1992)上述；Nissim 等(1994)见上述；Griffiths 等(1994) 见上述；DeKruif等(1995)见上述)。业已将所述多样性延伸到包括某些或所有其它抗原 结合环(Crameri 等(1996) Nature Med. ,2 100 ；Riechmann 等(1995) Bio/Technology, 13 475 ；Morphosys, WO 97/08320，见上述)。在其它实施方案中，为了多样化可通过例如采用 第一 PCR产物为“大引物(mega-primer)”的两步PCR策略来靶向核酸的特定区。(参见 例如Landt，0.等，Gene 96:125-128(1990))。例如通过SOE PCR也可完成靶向的多样化。 (参见例如 Horton，R. M.等，Gene 77:61-68(1989))。
可通过改变确定多肽序列的编码序列致使可将许多可能的氨基酸(例如所有20 种氨基酸或其子集)引入到该位置来实现在所选位置的序列多样性。用IUPAC命名法，最 多能的密码子是NNK，其编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。可使用NNK密码子以引入所 需多样性。也使用达到同样目的的其它密码子，包括NNN密码子，该密码子导致产生另外的 终止密码子TGA和TAA。这样的靶向方法可使得靶区域的全序列范围得到探索。某些文库包含作为免疫球蛋白超家族成员(例如抗体或其部分)的结构域。例如， 文库可包含具有已知主链构象的结构域。(参见例如Tomlinson等，WO 99/20749)。可在 合适的质粒或载体中制备文库。本文所用载体指分离的元件(discrete element)，其用于 将异源DNA引入到细胞中用于表达和/或其复制。可使用任何合适的载体，包括质粒(例 如细菌质粒)、病毒或噬菌体载体、人工染色体和游离型载体。这样的载体可用于简单克隆 和诱变，或表达载体可用于驱动文库表达。载体和质粒通常含有一个或多个克隆位点(例 如多接头)、复制起始点和至少一个选择标记基因。表达载体可进一步含有驱动多肽转录及 翻译的元件，例如增强子元件、启动子、转录终止信号、信号序列等等。可以以使其可操作地 连接编码多肽的克隆插入物的方式排列这些元件，由此当所述表达载体保持在适于表达的 条件下(例如在合适的宿主细胞中)时可表达并产生所述多肽。克隆载体和表达载体通常含有使得所述载体可在一个或多个所选择的宿主细胞 中复制的核酸序列。在克隆载体中，通常该序列为能使得载体独立于宿主染色体DNA复制 的序列，包括复制起始点或自主复制序列。对于多种细菌、酵母和病毒，所述序列众所周知。 来自质粒PBR322的复制起始点适用于大部分革兰氏阴性细菌，2微米质粒起始适用于酵母 菌，各种病毒复制起始点(例如SV40、腺病毒)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。除非在 哺乳动物细胞(例如COS细胞)中使用的复制起始点能够复制高水平DNA，否则哺乳动物表 达载体通常不需要复制起始点。克隆载体或表达载体可含有也被称为选择标记的选择基因。此类标记基因编码使 转化的宿主细胞在选择培养基中存活或生长必不可少的蛋白质。因此，未用含有选择基因 的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白赋予抗生素及 其它毒素(例如氨节青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate) 或四环素(tetracycline))抗性，互补的营养缺陷或提供在生长培养基中不能获得的关键 营养素。合适的表达载体可含有多种组分，例如复制起始点、选择标记基因、诸如转录调控 元件(例如启动子、增强子、终止子)等一种或多种表达调控元件和/或一种或多种翻译信 号、信号序列或前导序列等。若存在，表达调控元件和信号序列或前导序列可由载体或其它 来源提供。例如，编码抗体链的已克隆的核酸的转录和/或翻译调控序列可用于指导表达。可提供启动子用于在所需宿主细胞中进行表达。启动子可为组成型或诱导型。例 如，可让启动子可操作地连接编码抗体、抗体链或其部分的核酸，致使其指导该核酸转录。 可利用多种适用于原核宿主的启动子(例如用于大肠杆菌的内酰胺酶和乳糖启动子系 统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、lac、tac、T3、T7启动子)和真核宿主的启动子 (例如，猴肾病毒40早期或晚期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复启动子、巨细胞病毒启动 子、腺病毒晚期启动子、EG-Ia启动子)。另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标记，并在可复制
36的表达载体情况下包含复制起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因为常用选择标 记，可用于原核细胞(例如内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、四环素抗性的Tet基因) 和真核细胞(例如新霉素(G418或遗传霉素(geneticin))、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或 潮霉素(hygromycin)抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因使得可用甲氨蝶呤在多种宿 主中选择。在酵母中通常将编码宿主的营养缺陷型标记物的基因产物的基因(例如LEU2、 URA3、HIS3)用作选择标记。还涵盖使用病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体和能够整合 到宿主细胞基因组的载体(例如逆转录病毒载体)。适用于在原核细胞(例如细菌细胞，例如大肠杆菌)或哺乳动物细胞中表达的表 达载体包括例如pET 载体(例如 pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40，Novagen 等)、 噬菌体载体(例如 pCANTAB5 E,Pharmacia)、pRIT2T (蛋白 A 融合载体，Pharmacia)、pCDM8、 pCDNAl. l/amp、pcDNA3. 1、pRc/RSV、pEF_l(Invitrogen, Carlsbad, CA)、pCMV-SCRIPT、pFB、 pSG5、pXTl (Stratagene, La Jolla, CA)、pCDEF3 (Goldman, L. A.,等，Biotechniques, 21 1013-1015(1996))、pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD)、pEF-Bos (Mizushima，S.，等， Nucleic Acids Res.，18 :5322 (1990))等等。可利用适用于不同表达宿主的表达载体，所 述不同表达宿主例如原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果蝇(Drosophila Schnieder) S2 细胞，Sf9)、酵母(甲醇毕赤酵母(P. methanol!ca)、巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)、酿酒酵 母(S. cerevisiae))细胞和哺乳动物细胞(例如COS细胞)。载体的某些实例为能使对应于多肽文库成员的核苷酸序列表达的表达载体。因 此，可通过让表达多肽文库成员的单个克隆单独增殖并表达来进行用通用配体和/或靶 配体的选择。如上所述，特定的选择展示系统为噬菌体展示。因此，可使用噬菌体或噬菌 粒载体，例如，载体可为具有大肠杆菌复制起始点(用于双链复制)以及此外的噬菌体复 制起始点(用于产生单链DNA)的噬菌粒载体。所述载体的操作及表达在本领域众所周 知(Hoogenboom和Winter (1992)见上述；Nissim等(1994)见上述)。简言之，载体可含 有内酰胺酶基因以赋予噬菌粒选择性，并含有表达盒上游的Iac启动子，所述表达盒 可含有合适的前导序列、多个克隆位点、一个或多个肽标签、一个或多个TAG终止密码子和 噬菌体蛋白pill。因此，用各种大肠杆菌阻抑菌株和非阻抑菌株并加入葡萄糖、异丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体(例如VCS Μ13)，载体能够作为不表达而只产生 大量的多肽文库成员的质粒复制，或作为产物噬菌体复制，所述产物噬菌体中某些在其表 面含有多肽-PlII融合体的至少一个拷贝。抗体可变结构域可包含靶配体结合位点和/或通用配体结合位点。在某些实施方 案中，通用配体结合位点为超抗原(例如蛋白Α、蛋白L或蛋白G)结合位点。可变结构域可 基于任何所需的可变结构域，例如人VH(例如Vh la、Vh lb, Vh 2, Vh 3, Vh 4, Vh 5, Vh 6)、人 V λ (例如 V λ I、V λ II、V λ III、V λ IV、νλ V、νλ VI 或 Vk 1)或人 V κ (例如 Vk 2、Vk 3、 Vk 4、Vk 5、Vk 6、Vk 7、Vk 8、Vk 9 或 Vk 10) ο另一类技术涉及选择人工分隔间(artificial compartment)的谱，所述人工 分隔间使得基因可与其基因产物相连接。例如，可在由油包水乳剂形成的微胶囊中选 择编码所需基因产物的核酸的选择系统阐述于W099/02671、W000/40712和Tawfik & Griffiths (1998)NatureBiotechnol 16(7) ,652-6中。可将编码具有所需活性的基因产 物的遗传元件分区到微胶囊中，然后在微胶囊内转录和/或翻译以产生其各自的基因产物(RNA或蛋白质)。随后挑选产生具有所需活性的基因产物的遗传元件。本方法通过经由多 种手段检测所需活性来选择目的基因产物。表位结合结构域表征可通过为本领域技术人员所熟悉的方法检测结构域与其特异性抗原或表位的结 合，所述方法包括ELISA。在一个实例中，用单克隆噬菌体ELISA检测结合。可按照任何合适程序实施噬菌体ELISA 以下提出例示性方案。可通过ELISA针对所选择的抗原或表位的结合情况来筛选每一轮选择产生的噬 菌体群，以鉴定"多克隆"噬菌体抗体。然后可通过ELISA筛选来自这些群中的单个受感 染的细菌菌落的噬菌体，以鉴定"单克隆"噬菌体抗体。也期需针对与抗原或表位的结合 情况来筛选可溶性抗体片段，这还可通过ELISA用例如针对C-或N-末端标签的试剂来进 行(参见例如Winter等(1994) Ann. Rev. Immunology 12，433-55及其中所引用参考文献)。还可通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等1991，上述；Nissim等1994上述)、用探 针探测(Tomlinson等，1992J. Mol. Biol. 227，776)或通过测定载体DNA序列，来评估所选择 的噬菌体单克隆抗体的多样性。E. dAb 结构在例如用本文所述噬菌体展示技术从所选择的V-基因谱选择dAb的情况下，这些 可变结构域包含通用构架区，由此可以通过本文所定义的特定通用配体来识别它们。通用 构架区、通用配体等的使用阐述于W099/20749中。当使用V-基因谱时，多肽序列中的变化可位于可变结构域结构环内。任一可变结 构域的多肽序列可通过DNA改组或通过突变来改变，致使提高每一可变结构域与其互补对 的相互作用。DNA改组为本领域所知，由例如Stemmer, 1994，Nature 370 :389_391和美国 专利第6，297，053号教导，它们在此引作参考。其它诱变方法为本领域技术人员所熟知。用于构津dAb的骨架 .诜择主链构象免疫球蛋白超家族成员在其多肽链方面都共享相似的折叠。例如，尽管抗体就其 一级序列而言高度不同，但与预期的相反，序列比较和晶体结构显示抗体的6个抗原结合 环中的5个(HI、H2、Li、L2、L3)采用少数主链构象或规范结构(Chothia和Lesk(1987) J. Mol. Biol.，196 901 ；Chothia 等(1989) Nature，342 :877)。因此，环长度及关键残基分析 使得可预测在大部分人抗体中存在的HI、H2、Li、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992) J. Mol. Biol.，227 799 ；Tomlinson 等(1995) EMBO J.，14 4628 ；Williams 等(1996) J. Mol. Biol.，264:220)。尽管就序列、长度及结构(由于使用D区段)而言H3区更多样，但其由 于环长度短而同样形成少数主链构象，这要视长度及环中及抗体构架中关键位置的特定残 基的存在情况或残基类型而定(Martin等(1996) J. Mol. Biol.，263 800 ；Shirai等(1996) FEBS Letters,399 1)。有利地的是，从结构域文库(例如Vh结构域文库和/或\结构域文库)组装dAb。 在一个方面，对结构域文库进行设计，其中选择某些环长度和关键残基以确保成员的主链 构象是已知的。有利的是，为了使其无功能的几率最小化，它们是在自然界发现的免疫球蛋 白超家族分子的真正构象，其如上所述。种系V基因区段用作一个合适的基本构架用于构 建抗体或T-细胞受体文库；其它序列也有用。可以以低频率发生变化，以使少数功能成员
38可拥有改变的主链构象，所述构象并不影响其功能。规范结构理论还可用于评估由配体编码的不同的主链构象的数量，以基于配体序 列预测主链构象，并为多样化选择不影响规范结构的残基。已知在人Vk结构域中，Ll环可 采用4种规范结构中的1种，L2环具有单一的规范结构，对于L3环90%的人Vk结构域采 用4种或5种规范结构中的1种(Tomlinson等(1995)见上述)；因此，在单独的Vk结构域 中，不同的规范结构可联合以产生一系列不同的主链构象。已知νλ结构域编码Li、L2和 L3环的一系列不同的规范结构，且Vk和νλ结构域可与可编码Hl和Η2环的若干规范结构 的任何Vh结构域配对，那么在这5种环中观察到的规范结构组合的数目将极大。这表明主 链构象多样性的产生对于产生大范围的结合特异性可能是必需的。然而，通过基于单一已 知主链构象构建抗体文库，业已发现与预期相反，对于产生足以靶向基本上所有抗原的多 样性并不需要主链构象多样性。甚至更意想不到的是，单一主链构象不必为共有结构_单 一天然存在的构象可用作整个文库的基础。因此，在一个特别的方面，dAb拥有单一的已知 主链构象。所选择的单一主链构象可以是所考虑的免疫球蛋白超家族类型分子中的普通的 一种。当观察到大量天然存在的分子采用该构象时，所述构象就是普通构象。因此，在一个 方面，单独考虑对于免疫球蛋白结构域的每一结合环的不同主链构象的天然存在情况，然 后为不同环选择天然存在的可变结构域，所述可变结构域拥有所期需的主链构象组佥。如 果没有一个可以利用，那么可选择最接近的等同物。可通过选择编码所需主链构象的种系 基因区段来产生对于不同环的所期需的主链构象组合。在一个实例中，所选择的种系基因 区段在自然界中频繁表达，具体而言，在所有天然种系基因区段中它们可能是最频繁地表 达。在设计文库的过程中，可以单独考虑对于6个抗原结合环中的每一个的不同的主 链构象发生率。对于111、!12、1^1、1^2和1^3，选择20% -100%的天然存在的分子的抗原结合 环所采用的既定构象。通常，其观察到的发生率超过35% (即35%至100%之间)，理想情 况为超过50%或甚至超过65%。由于绝大多数H3环不具有规范结构，因而优选选择在这 些不展示规范结构的环中普通的主链构象。因此，对于每一种环，选择在天然谱中最经常观 察到的构象。在人抗体中，对于每一种环而言最普遍的规范结构(CS)如下Hl-CS 1(79% 所表达的谱)、H2-CS 3(46%)、Ll-CS 2VK (39% ), L2-CS 1(100% L3-CS IVk (36% ) (计算假设K: λ 比率为 70 :30，Hood 等(1967)Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol二， 48 133)。对于具有规范结构的H3环，在第94位残基-第101位残基含有盐桥的长7个 残基的 CDR3(Kabat 等(1991)Sequences of proteins of immunological interest, U. S. Departmentof Health and Human Services)以乎是最普遍的。在 EMBL 数据库中有 至少16种人抗体序列含有形成该构象所需的H3长度和关键残基，在用作抗体建模的基础 的蛋白质数据库中有至少两种晶体结构(2cgr和ltet)。规范结构的这种组合的最频繁表 达的种系基因区段为Vh区段3-23 (DP-47)、Jh区段JH4b、VK区段02/012 (DPK9)和Jk区段 JK1。Vh区段DP45和DP38也是合适的。因此，可将这些区段组合用作构建具有所期需单一 主链构象的文库的基础。或者，代替基于处于孤立状态的每一结合环的不同的主链构象的天然发生率来选 择单一主链构象，将主链构象组合的天然发生率作为用于选择单一主链构象的基础。例如，在抗体情况下，可确定对于抗原结合环中的任何两个、三个、四个、五个或所有六个的规范 结构组合的自然发生率。此时所选择的构象可为天然存在的抗体中的普通构象，并且可在 天然谱中最经常地观察到。因此，例如在人抗体中，当考虑5种抗原结合环HI、H2、Li、L2 和L3的天然组合时，确定规范结构的最频繁的组合，然后与H3环的最普遍的构象联合，作 为选择单一主链构象的基础。规范序列的多样化选择了几种已知主链构象或单一已知主链构象后，就可通过改变分子的结合位点 来构建dAb，以产生含结构和/或功能多样性的谱。这意味着产生变体，致使在其结构和/ 或其功能方面具有足够的多样性，由此它们能够提供一系列的活性。通常通过在一个或多个位置改变所选择的分子来产生所期需的多样性。可随机选 择待改变的位置，或它们可能已被选定。然后通过以下方式来实现变异随机化，在随机化 期间由任意氨基酸或其天然或合成的类似物取代氨基酸残基产生极大量的变体；或者用一 种或多种限定的氨基酸子集置换氨基酸残基，产生更少量的变体。业已报道用于引入所述多样性的各种方法。可用易错PCR(Hawkins等(1992) J. Mol.Biol.，226 :889)、化学诱变(Deng 等(1994) J. Biol. Chem. , 269 9533)或细菌增变 株(LoW等(1996) J. Mol. Biol.，260 :359)来将随机突变引入编码分子的基因中。用于突 变所选位置的方法在本领域亦众所周知，包括用或不用PCR使用错配的寡核苷酸或简并寡 核苷酸。例如，通过以抗原结合环作为目标进行突变产生若干合成的抗体文库。使结合人 破伤风类毒素-Fab的H3区随机化以产生一系列新的结合特异性(Barbas等(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89 :4457)。随机或半-随机H3和L3区业已被添加到种系V基因区 段以产生含未突变构架区的大文库(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol. , 227 381 ； Barbas 等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4457 ；Nissim 等(1994) EMBO J.，13 692 ； Griffiths 等(1994) EMBO J.，13 3245 ；De Kruif■等(1995) J. Mol. Biol.，248 97)。所述多 样化业已延伸到包括某些或所有其它抗原结合环(Crameri等(1996) Nature Med. ,2 100 ； Riechmann 等(1995) Bio/Technology, 13 475 ；Morphosys, W097/08320,见上述)。由于环的随机化有可能产生大约超过IO15种针对单独的H3的结构，以及同样大量 的其它5种环的变体，因而用目前的转化技术或甚至通过用无细胞系统以产生代表所有可 能组合的文库是不可行的。例如，在迄今构建的最大的文库之一中，产生了 6xl01(l种不同的 抗体，这仅是该设计的文库的潜在多样性的小部分而已(Griffiths等(1994)见上述)。在一个实施方案中，仅那些直接参与产生或修饰所期需的分子功能的残基被多样 化。对于很多分子而言，功能应为结合靶标，因此多样性应该集中在靶标结合位点，同时避 免改变对于分子的整体包装或对于维持所选择的主链构象很重要的残基。在一个方面，使用其中仅那些抗原结合位点的残基被改变的dAb文库。这些残基 在人抗体谱中极具多样性，并且已知为高分辨的抗体/抗原复合体的接触点。例如，在L2 中，已知在天然存在的抗体中位置50和53是多变的，并观察到其与抗原接触。相比之下， 常规方法将使由Kabat等(1991，上述)定义的相应的互补决定区(CDRl)中的所有残基多 样化，与文库中多样化的两个残基相比某些有7个残基被多样化。就产生一系列抗原结合 特异性所需的功能多样性而言，这代表显著改进。实际上，抗体多样性是两个过程的结果种系V、D和J基因区段的体细胞重组致使产生天然的初始谱(primary repertoire)(所谓的种系和连接多样性)和导致产生重排 的V基因的体细胞超突变。人抗体序列分析显示，初始谱多样性集中在抗原结合位点中心， 而体细胞超突变将多样性散布在在初始谱中高度保守的抗原结合位点的外围区域(参见 Tomlinson等(1996) J. Mol. Biol.，256 :813)。这种互补很可能进化为搜寻序列间隔的有效 策略，尽管对于抗体明显是独特的，但这可能容易地应用到其它多肽谱。被改变的残基是形 成靶标结合位点的那些残基的子集。若有需要，靶标结合位点中不同的(包括重叠的)残 基子集在选择期间在不同阶段被多样化。在抗体谱情况下，当某些而不是所有抗原结合位点残基被多样化时，产生了初始 “天然”谱。本文上下文所用术语“天然”或“假体(dummy)”指没有预先确定靶标的抗体分 子。这些分子类似于尚未经历免疫多样化的个体的免疫球蛋白基因所编码的分子，所述尚 未经历免疫多样化的个体的例子为胎儿及新生儿个体，其免疫系统尚未受到多种抗原刺激 物的攻击。然后针对一系列抗原或表位选择该谱。若有需要，可在初始谱中被多样化的区 域之外引入另外的多样性。可选择这种成熟的谱用于改变功能、特异性或亲和力。应该理解的是，本文所述序列包括与本文所述序列具有基本同一性的序列，例如 至少90%同一性，例如至少91%或至少92%或至少93%或至少94%或至少95%或至少 96%或至少97%或至少98%或至少99%同一性。对于核酸，术语“基本同一性”表明当对两种核酸或其指定序列以适当的核苷酸插 入或缺失进行最佳比对及比较时，它们有至少约80%的核苷酸、通常至少约90% -95%并 更优选至少约98% -99. 5%的核苷酸相同。或者，当区段在选择性杂交条件下与互补链杂 交时存在基本上同一性。对于核苷酸和氨基酸序列，术语“同一"表明当两个核酸或氨基酸序列之间以适 当插入或缺失进行最佳比对和比较时的相同程度。或者，当DNA区段在选择性杂交条件与 互补链杂交时存在基本上同一性。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一位置数量的函数(即同一性％ =同一位置数目/位置总数乘以100)，为了两个序列的最佳比对需要考虑空位数目及每一 空位长度。可用数学算法完成序列比较和两个序列之间同一性百分比的测定，其如以下非 限制性实施例所述。可用GCG软件包中的GAP程序、用NWSgapdna. CMP矩阵和40、50、60、70或80的空 位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。还可 用被整合至IJ ALIGN 程序(2. 0 版)的 E. Meyers 和 W. Miller 算法(Comput. Appl. Biosci.， 4 11-17 (1988))、用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来测定两个核苷 酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。另外，可用业已整合到GCG软件包中的GAP程序的 Needleman 和 Wunsch(J. Mol. Biol. 48 444-453 (1970))算法、用 Blossum 62 矩阵或 PAM250 矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，来测定两个氨基酸序列 之间的同一性百分比。举例而言，本发明多核苷酸序列可与SEQ ID NO :122参考序列同一，也就是说 100%同一，或其与参考序列比较可包括至多某些整数个的核苷酸改变。所述改变选自至少 一个核苷酸缺失、置换(包括转换和颠换)或插入，并且其中所述改变可发生在参考核苷酸 序列的5'或3'末端位置，或这些末端位置之间的任何位置，其各自散布在参考序列的核
41苷酸之中的或在参考序列内的一个或多个邻接基团(contiguousgroup)中。通过让SEQ ID N0:122的核苷酸总数乘以各自同一性百分比数值(除以100)，并从所述SEQ ID N0:122核 苷酸总数减去该乘积，求出核苷酸改变数目，或nn 彡 xn_ (xn · y),其中rm为核苷酸改变数目，xn为SEQ ID NO 122核苷酸总数，y 对于50%为 0. 50、对于60%为0. 60、对于70%为0. 70、对于80%为0. 80、对于85%为0. 85、对于90% 为0. 90、对于95%为0. 95、对于97%为0. 97或对于100%为1. 00，其中在从xn减去xn与 y的任何非整数乘积之前将其四舍五入成最接近的整数。SEQ ID N0:122多核苷酸序列的 改变可在该编码序列中产生无意义、错义或移码突变，藉此在所述改变后改变多核苷酸所 编码的多肽。同样地，在另一实施例中，本发明可多肽序列可与SEQ ID NO 26编码的参考序列 同一，也就是说100 %同一，或其与参考序列比较可包括至多某些整数个的氨基酸改变，致 使同一性％小于100%。所述改变选自至少一个核苷酸缺失、取代(包括保守和非保守取 代)或插入，其中所述改变可发生在参考多肽序列的氨基末端或羧基末端位置，或这些末 端位置之间的任何位置，其各自散布在参考序列的氨基酸之中或在参考序列内的一个或多 个邻接基团中。通过让SEQ ID NO :26编码的多肽序列中氨基酸总数乘以各自同一性百分 比数值(除以100)，然后从所述SEQ ID NO :26编码的多肽序列中氨基酸总数减去该乘积， 求出对应于既定同一性％的氨基酸改变数目，或na ^ xa- (xa · y),其中na为氨基酸改变数目，xa为SEQ ID NO :26所编码的多肽序列中氨基酸的总 数，y为例如对于70%为0. 70、对于80%为0. 80、对于85%为0. 85等，其中在从xa减去 xa与y的任何非整数乘积之前将其四舍五入成最接近的整数。
实施例以下方法在本文所述实施例中使用。方法1通过ELISA测定与大肠杆菌表达的重组人IL-13的结合在直接结合ELISA中评估mAbdAb分子对大肠杆菌表达的重组人IL-13的结合。简 言之，将5 μ g/ml大肠杆菌表达的重组人IL-13 (由GSK制备并纯化)包被到96孔ELISA 板。在室温将各孔封闭1小时，然后对所述板滴定出(titrate out)mAbdAb构建体(通常 从3倍稀释液中的大约IOOnM到大约0. OlnM)。用抗-人κ轻链过氧化物酶缀合抗体(货 号Α7164，Sigma-Aldrich)的适当稀释液或抗-人IgG γ链特异性过氧化物酶缀合检测抗 体(货号Α6029，Sigma-Aldrich)的适当稀释液检测结合。方法2通过ELISA测定与大肠杆菌表达的重组人IL_4的结合在直接结合ELISA中评估mAbdAb构建体对大肠杆菌表达的重组人IL_4的结合。 简言之，将5 μ g/ml大肠杆菌表达的重组人IL-4 (由GSK制备并纯化)包被到96孔ELISA 板。在室温将各孔封闭1小时，然后对所述板滴定出mAbdAb构建体(通常从3倍稀释液中 的大约IOOnM到大约0. OlnM)。用山羊抗-人κ轻链过氧化物酶缀合抗体(货号Α7164，Sigma-Aldrich)的适当稀释液或抗-人IgG γ链特异性过氧化物酶缀合检测抗体(货号 Α6029，Sigma-Aldrich)的适当稀释液检测结合。方法3诵i寸ELISA检测丨与大肠杆菌表汰的重鉬λIL-18的结合在直接结合ELISA中评估mAbdAb构建体对大肠杆菌表达的重组人IL-18的结 合。简言之，将5 μ g/ml大肠杆菌表达的重组人IL-18 (由GSK制备并纯化)包被到96孔 ELISA板。在室温将各孔封闭1小时，然后对所述板滴定出mAbdAb构建体(通常从3倍稀 释液中的大约IOOnM到大约0. OlnM)。用抗-人κ轻链过氧化物酶缀合抗体(货号Α7164， Sigma-Aldrich)的2000倍稀释液或抗-人IgG γ链特异性过氧化物酶缀合检测抗体(货 号Α6029，Sigma-Aldrich)的2000倍稀释液检测结合。方法4对结合大肠杆菌表汰的重组人IL-13的Biacore 结合亲和力评估由Biacore 分析评估了 mAbdAb构建体对于大肠杆菌表达的重组人IL-13的结合 亲和力。用蛋白A或抗-人IgG捕获抗体进行分析。简言之，按照制造商提议通过伯胺偶 联将蛋白A或抗-人IgG偶联到CM5芯片上。然后将mAbdAb构建体捕获到该表面上，以限 定浓度使人IL_13(由GSK制备并纯化)通过(pass over)。用温和的酸洗脱条件(例如 IOOmM磷酸)使该表面再生为蛋白A表面，这不会显著影响捕获抗体对随后的IL-13结合 事件的能力。用与再生蛋白A表面相似的条件或通过用3M MgCl2H抗-人IgG表面再生。 在Biacore 3000和/或TlOO设备上实施该工作，用设备中的评估软件分析数据，并拟合 为1 1的结合模型。在25°C或37°C实施Biacore 运行。方法5对结合大肠杆菌表汰的重组人IL-4的Biacore 结合亲和力评估由Biacore 分析评估了 mAbdAb构建体对于大肠杆菌表达的重组人IL_4的结合 亲和力。用蛋白A或抗-人IgG捕获抗体进行分析。简言之，按照制造商提议通过伯胺偶 联将蛋白A或抗-人IgG偶联到CM5芯片上。然后将mAbdAb构建体捕获到该表面，以限定 浓度使人IL-4 (由GSK制备并纯化)通过。用温和的酸洗脱条件(例如IOOmM磷酸)使该 表面再生为蛋白A表面，这不会显著影响捕获抗体对随后的IL-4结合事件的能力。用与再 生蛋白A表面相似的条件或通过用3M MgCl2H抗-人IgG表面再生。在Biacore 3000和 /或T100和/或A100设备上实施该工作，用设备中的评估软件分析数据，并拟合为1 1 的结合模型。在25°C或37°C实施Biacore 运行。方法6对结合大肠杆菌表达的重组人IL-18的Biacore 结合亲和力评估由Biacore 分析评估了 mAbdAb构建体对于大肠杆菌表达的重组人IL-18的结合 亲和力。用蛋白A或抗-人IgG捕获抗体进行分析。简言之，按照制造商提议通过伯胺偶联 将蛋白A或抗-人IgG偶联到CM5芯片上。然后将mAbdAb构建体捕获到该表面，以限定浓 度使人IL_18(由GSK制备并纯化)通过。用温和的酸洗脱条件(例如IOOmM磷酸)使该表 面再生为蛋白A表面，这不会显著影响捕获抗体对随后的IL-18结合事件的能力。用与再 生蛋白A表面相似的条件或通过用3M MgCl2H抗-人IgG表面再生。在Biacore 3000和 /或T100和/或A100设备上实施该工作，用设备中的评估软件分析数据，并拟合为1 1的结合模型。在25°C实施Biacore 运行。方法7对IL-13.IL-4或IL-18的mAbdAb双特异件杭体或三特异件杭体的化学i十量i平估 (M Biacorea)通过伯胺偶联将抗-人IgG固定到CM5生物传感器芯片上。在使单一浓度的 IL-13、IL-4或IL-18细胞因子通过后，将mAbdAb构建体捕获到该表面上，该浓度足以使结 合表面饱和，所观察到的结合信号达到满R-max。然后用给定公式计算化学计量化学计量=RmaX*Mw (配体)/Mw(分析物)*R(被固定或捕获的配体)当计算不止一种在同一时间结合的分析物的化学计量时，使不同的细胞因子以 饱和细胞因子浓度序贯通过，如上计算化学计量。本工作在Biacore 3000上于25°C下用 HBS-EP运行缓冲液进行。方法8^h TF-iκ n-i3 的中禾口TF-I细胞因响应包括人IL-13在内的许多不同的细胞因子而增殖。因此，可将这 些细胞对IL-13的增殖性响应用于测量IL-13的生物活性，并随后开发出测定mAbdAb构建 体对IL-13的中和效能(抑制IL-13生物活性)的测定法。在无菌条件下于无菌96孔组织培养板中实施测定，所有测试孔以一式三份进行。 让大约14ng/ml大肠杆菌表达的重组人IL-13与mAbdAb构建体的各种稀释液(通常从以3 倍稀释滴定的200nM到0. 02nM)在50 μ 1总体积中于37°C预孵育1小时。然后将这些样品 加到无菌96孔组织培养板的50 μ 1的TF-I细胞(以每毫升2x105个细胞的浓度)中。因 此，最后100 μ 1测定体积含有各种稀释度的mAbdAb构建体(以从以3倍稀释滴定的IOOnM 到0. OlnM的终浓度)、大肠杆菌表达的重组人IL-13(以7ng/ml的终浓度)和TF-I细胞 (以每毫升IxlO5个细胞的终浓度)。让测定板在37°C增湿CO2培养箱中孵育大约3天。然 后用来自 Promega 的 iCellTitre 96 Non-Radioactive Cell ProliferationAssay'(货 号G4100)如制造商说明书所述测定细胞增殖的量。在板读数器中于570nm处读取96-孔 板的样品的吸光度。将mAbdAb构建体中和大肠杆菌表达的重组人IL-13的生物活性的能力，表示为 中和限定量的人IL-13(7ng/ml)的生物活性到50%所需的mAbdAb构建体浓度(=ND50)。 所需mAbdAb构建体的浓度越低，中和能力的功效越强。手动或通过用微软excel固有的 Robosage软件包计算本文提供的ND5tl数据.方法9在TF-I细胞增殖生物测定中大肠杆菌表达的重组人IL-4的中和TF-I细胞因响应包括人IL-4在内的许多不同的细胞因子而增殖。因此，可将这些 细胞对IL-4的增殖性响应用于测量IL-4的生物活性，并随后开发出测定mAbdAb构建体对 IL-4的中和效价(抑制IL-4生物活性)的测定法。在无菌条件下于无菌96孔组织培养板中实施测定，所有测试孔以一式三份进行。 让大约2. 2ng/ml大肠杆菌表达的重组人IL-4与mAbdAb构建体的各种稀释液(通常从以 3倍稀释滴定的200nM到0. 02nM)在50 μ 1总体积中于37°C预孵育1小时。然后将这些 样品加到于无菌96孔组织培养板的50 μ 1的TF-I细胞(以每毫升2χ105个细胞的浓度)
44中。因此，最后100 μ 1测定体积含有各种稀释度的mAbdAb构建体(以从以3倍稀释滴定 的IOOnM到0. OlnM的终浓度)、大肠杆菌表达的重组人IL_4(以1. lng/ml的终浓度)和 TF-I细胞(以每毫升IxlO5个细胞的终浓度)。让测定板在37°C增湿CO2培养箱中孵育大 约 3 天。然后用来自 Promega 的 ‘CellTitre 96 Non-Radioactive CellProliferation Assay'(货号G4100)如制造商说明书所述测定细胞增殖的量。在板读数器中于570nm处 读取96-孔板的样品的吸光度。将mAbdAb构建体中和大肠杆菌表达的重组人IL-4的生物活性的能力，表示为中 和限定量的人IL-4(1. lng/ml)的生物活性到50%所需的mAbdAb构建体浓度(=ND50)。 所需mAbdAb构建体的浓度越低，中和能力的功效越强。手动或通过用微软excel固有的 Robosage软件包计算本文提供的ND5tl数据.方法10^ TF-iκ n-i3 m^m^mmmm 组人IL-4的双重中和TF-I细胞因响应包括人IL-13和人IL-4在内的许多不同的细胞因子而增殖。因 此，可将这些细胞对IL-13及IL-4的增殖性响应用于同时测量IL-13及IL-4的生物活性， 并随后开发出测定mAbdAb构建体对IL-13及IL-4双重中和效价(IL-13及IL-4生物活性 的双重抑制)的测定法。在无菌条件下于无菌96孔组织培养板中实施测定，所有测试孔以一式三份进行。 让大约14ng/ml大肠杆菌表达的重组人IL-13和大约2. 2ng/ml大肠杆菌表达的重组人 IL-4与mAbdAb构建体的各种稀释液(通常从以3倍稀释滴定的200nM到0. 02nM)在50 μ 1 总体积中于37°C预孵育1小时。然后将这些样品加到无菌96孔组织培养板的50 μ IWTF-I 细胞(以每毫升2χ105个细胞的浓度)中。因此，最后100 μ 1测定体积含有各种稀释度的 mAbdAb构建体(以从以3倍稀释滴定的IOOnM到0. OlnM的终浓度)、大肠杆菌表达的重组 人IL-13(以7ng/ml的终浓度)、大肠杆菌表达的重组人IL_4(以1. lng/ml的终浓度)和 TF-I细胞(以每毫升IxlO5个细胞的终浓度)。让测定板在37°C增湿CO2培养箱中孵育大 约 3 天。然后用来自 Promega 的 ‘CellTitre 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay'(货号G4100)如制造商说明书所述测定细胞增殖的量。在板读数器中于570nm处 读取96-孔板的样品的吸光度。方法11对结合Sf21_表达的重组人IL-5的Biacoren结合亲和力评估由Biacore 分析评估了 mAbdAb分子对于Sf21_表达的重组人IL_5的结合亲和 力。用蛋白A或抗-人IgG捕获抗体进行分析。简言之，按照制造商提议通过伯胺偶联将 蛋白A或抗-人IgG偶联到CM5芯片上。然后将mAbdAb分子捕获到该表面上，以限定浓度 使人IL-5 (由GSK制备并纯化)通过。用温和的酸洗脱条件(例如IOOmM磷酸)使该表面 再生为蛋白A表面，这不会显著影响捕获抗体对随后的IL-5结合事件的能力。用与再生蛋 白A表面相似的条件或通过用3M MgCl2使抗-人IgG表面再生。在Biacore 3000、T100 和A100设备上实施该工作，用设备中的评估软件分析数据，并拟合为1 1的结合模型。在 25°C 实施 Biacore 运行。方法12
VEGF警体结合测定本测定测量VEGF165与VEGF R2 (VEGF受体)的结合及测试分子封阻该相互作用的 能力。用VEGF受体(R&D Systems，货号357-KD_050)(在0· 2M碳酸钠/碳酸氢钠ρΗ9· 4 中0. 5 μ g/ml终浓度)过夜包被ELISA板，洗涤并用2 % BSA/PBS封闭。在将VEGF(R&D Systems，货号293-VE_050)和测试分子(在含 0. 1% BSA 的 0. 05% Tween 20TMPBS 中稀 释)预孵育1小时，随后加入到板(3ng/ml VEGF终浓度)中。用生物素化抗-VEGF抗体 (0. 5 μ g/ml终浓度)(R&D Systems，货号BAF293)和过氧化物酶缀合抗-生物素第二抗体 (1 5000稀释)(Stratech，货号200-032-096)检测VEGF与VEGF受体的结合，并在用等 体积IMHCl终止反应后用比色底物(Sure Blue TMB过氧化物酶底物，KPL)在0D450处显不。方法13EGFR激酶测定通过其与EGF的相互作用激活在A431细胞表面表达的EGFR，导致受体的酪氨酸 激酶磷酸化。测量EGFR酪氨酸激酶磷酸化的减少以测定测试分子的效价。让A431细胞过 夜附着到96孔组织培养板，然后加入测试分子并放置1小时，然后与EGF(300ng/ml) (R&D Systems货号236-EG)孵育10分钟。使细胞裂解，并将裂解的制备物转移到用抗-EGFR抗 体(lug/ml) (R&D Systems，货号AF231)包被的ELISA板。捕获在裂解细胞液中存在的磷 酸化和非磷酸化的两种EGFR。洗掉未结合的物质后，用HRP缀合的抗-磷酸酪氨酸抗体 (1 2000稀释)(UpstateBiotechnology，货号16-105)特异性检测磷酸化的EGFR。用显 色底物使结合可视化。方法14MRC-5/TNF 测定用人肺成纤维细胞MRC-5细胞测定测试分子防止人TNF_a结合人TNFRl及中和 IL-8分泌的能力。让系列稀释的测试样品与TNF-a(500pg/ml) (Peprotech)孵育1小时。 然后用MRC-5细胞悬浮液(ATCC，货号CCL-171) (5xl03细胞/孔)对其进行1 2稀释。过 夜孵育后，将样品稀释10倍，用IL-8 ABI 8200细胞检测测定(FMAT)来测定IL-8的释放， 其中用抗-IL_8(R&D Systems，货号208-IL)包被的聚苯乙烯珠粒、生物素化抗_IL_8 (R&D Systems，货号 BAF208)和链霉亲和素 Alexanuor647 (Molecular Probes，货号 S32357)测 定IL-8浓度。以647nm荧光发射来定位测定读数，用包括在该测定中的IL-8标准曲线内 推(interpolate)未知 IL-8 浓度。方法15MRC-5/IL-1 测定用人肺成纤维细胞MRC-5细胞测定测试分子防止人IL-Ia结合人ILl-R及中和 IL-8分泌的能力。用胰蛋白酶处理MRC-5细胞(ATCC，货号CCL-171)，然后作为混悬液与测 试样品孵育1小时。然后加入IL-Ia(200pg/ml终浓度)(R&D Systems货号:200_LA)。过 夜孵育后，用IL-8定量ELISA试剂盒(R&D Systems)与抗-IL-8包被的ELISA板、生物素 化抗-IL-8和链霉亲和素-HRP来测定IL-8的释放。测定读数为450nm处的色度吸光度， 用包括在该测定中的IL-8标准曲线内推未知IL-8浓度。方法16
在全血磷-STAT6牛物测定中大肠杆菌表汰的重组人IL-13或IL_4的中和效价可用大肠杆菌表达的重组人IL-4(rhIL_14)或IL_13 (rhIL_13)离体刺激全血细 胞，以表达磷-STAT6 (pSTAT6)。本测定被开发为定量测量pSTAT6，并由此测定mAbdAb构建 体的中和效价(抑制IL-4或IL-13的生物活性)。在无菌条件下于无菌96孔组织培养板中实施测定，所有测试孔以一式三份进行。 在无血清细胞培养基中制备12ng/ml的rhIL-13或rhIL-4,加31. 2 μ L到96孔板的孔中。 以6χ的最终测定浓度制备mAbdAb构建体或同种型对照的9点稀释曲线，将31. 2 μ L的各稀 释液加到含有rhIL-4或rhIL-13的孔中。将125 μ L肝素化的人全血加到所有孔中，并在 混合器上混合30秒。最终测定体积含有各个稀释度的mAbdAb构建体，连同终浓度为2ng/ mL的rhIL-13或rhIL-4。让测定板在37°C>5% CO2中孵育60分钟。然后通过加入62. 5 μ L的4χ裂解缓冲液裂解细胞。裂解缓冲液含有最终测定浓 度的50mM Tris盐酸、300mM氯化钠、1 % NP40,0. 5%脱氧胆酸钠、50mM氟化钠、ImM原钒酸 钠、ImM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物。将板置于冰上30分钟，然后在-80°C冷冻直到用于 PSTAT6 测定。用电致化学发光免疫测定(Meso-Scale-Discovery，MSD)实施全血样品的pSTAT6 测量。简言之，用每孔150 μ L的5% MSD封闭剂A于室温在混合器上以750rpm对亲和素包 被的96孔MSD板封闭1小时。用每孔150 μ L的MSD Tris洗涤缓冲液洗涤板3次。每孔 加入25 μ L的捕获抗体(生物素化小鼠抗_人STAT6单克隆抗体)，让板在4°C孵育过夜。 让捕获抗体在由50mM Tris、150mM氯化钠、0. 2% BSA,0. 5% Tween 20、ImM EDTA组成的测 定缓冲液中稀释到4 μ g/mL。用MSDtris洗涤缓冲液洗涤板3次，然后用150 μ L的5% MSD 封闭剂A于室温在混合器上对板封闭1小时。如前述洗涤板3次，然后每孔加入25μ L全 血裂解物或PSTAT6标定剂(calibrator)。让板于室温在混合器上孵育3小时。洗涤板3 次，然后加入25 μ L兔抗人pSTAT6抗体(在测定缓冲液中以1 800稀释)，然后于室温孵 育1小时。进一步洗涤后，每孔加入25yL的1 500稀释的MSD TAG山羊抗-兔IgG抗 体，然后于室温在混合器上孵育1小时。在每孔加入150yL的2x MSD读出缓冲液T之前 再次洗涤板。在MSD SECTOR成像器上立即读板。将mAbdAb构建体中和rhIL_13或rhIL_4生物活性的能力表示为中和2ng/mL人 IL-4或人IL-13到50%所需的mAbdAb构建体浓度(IC5tl)。所需mAbdAb构建体浓度越低， 中和能力的功效就越强。方法17通过ELISA测定与大肠杆菌表达的重组猕猴IL-13的结合在直接结合ELISA中评估mAbdAb分子对大肠杆菌表达的重组猕猴(cynomolgus) IL-13的结合。简言之，将5 μ g/ml大肠杆菌表达的重组猕猴IL-13 (由GSK制备并纯化) 包被到96孔ELISA板。在室温将各孔封闭1小时，然后对所述板滴定出mAbdAb分子(通 常从3倍稀释液中的大约IOOnM到大约0. OlnM)。用抗-人κ轻链过氧化物酶缀合抗体 (货号Α7164，Sigma-Aldrich)的适当稀释液或抗-人IgG γ链特异性过氧化物酶缀合检 测抗体(货号Α6029，Sigma-Aldrich)的适当稀释液检测结合。方法18未使用
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方法19通过ELISA检测人IL_4与人IL4警体α (IL4Ra)结合的抑制除非另外指出，否则所有试剂在使用前于封闭液(tris缓冲的盐水和0.05% Tween20中的4%牛血清白蛋白)中稀释到所需浓度。用磷酸盐缓冲盐水中的5 μ g/ml重组 人IL4Ra-Fc嵌合体(R&D Systems，货号604-4R)于4°C过夜包被ELISA板。所有随后的步 骤都在室温进行。在加入业已与0. 02 μ g/ml重组人IL-4 (由GSK制备)预混合的50 μ 1不 同浓度的mAbdAb (或阳性对照mAb或dAb)之前，让板在封闭液中封闭2小时。在用洗涤缓 冲液(Tris缓冲的盐水和0. 05% Tween20)洗涤板4次之前让板孵育1小时。将50 μ 1的 0.5 μ g/ml生物素化抗-人IL-4 (R&D Systems，货号BAF 204)溶液加入到每一孔，并孵育1 小时。用洗涤缓冲液洗涤板4次，然后加入50 μ 1/孔的1/2000稀释的Extravadin (Sigma， 货号E2886)。1小时后，洗涤板4次，通过与OPD过氧化物酶底物(来自Sigma)孵育来检测 色度信号，用终止溶液(3M H2SO4酸)终止该反应，通过在板读数器上于490nm处获得吸光 度数据。在GraphPad Prism上对平均吸光度和标准差作图，用Cambridge Soft BioAssay 计算IC5tl值。方法20
_2] ^h TF-i μmmm^m^mmmmmmm n-13 的中和TF-I细胞因响应包括猕猴IL-13在内的许多不同的细胞因子而增殖。因此，可将 这些细胞对IL-13的增殖性响应用于测量IL-13的生物活性，并随后开发出测定mAbdAb构 建体对IL-13的中和效价(抑制IL-13生物活性)的测定法。在无菌条件下于无菌96孔组织培养板中实施测定，所有测试孔一式三份进行。让 大约14ng/ml大肠杆菌表达的重组猕猴IL-13与mAbdAb构建体的各种稀释液(通常从以3 倍稀释滴定的IOOOnM或200nM到InM或0. 02nM)在50 μ 1总体积中于37°C预孵育1小时。 然后将这些样品加到无菌96孔组织培养板的50 μ 1的TF-I细胞(以每毫升2χ105个细胞的 浓度)中。因此，最后100 μ 1测定体积含有各种稀释度的mAbdAb构建体(以从以3倍稀释 滴定的500ηΜ或IOOnM到0. 5ηΜ或0. OlnM的终浓度)、大肠杆菌表达的重组猕猴IL-13 (以 7ng/ml的终浓度)和TF-I细胞(以每毫升IxlO5个细胞的终浓度)。让测定板在37°C增 湿CO2培养箱中孵育大约3天。然后用来自Promega的‘CellTitre 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay，(货号G4100)如制造商说明书所述测定细胞增殖的量。在板 读数器中于570nm处读取96-孔板的样品的吸光度。将mAbdAb构建体中和大肠杆菌表达的重组猕猴IL-13的生物活性的能力，表示为 中和限定量的猕猴IL-13 (7ng/ml)的生物活性到50%所需的mAbdAb构建体浓度(=ND50)。 所需mAbdAb构建体的浓度越低，中和能力的功效越强。手动或通过用微软excel固有的 Robosage软件包计算本文提供的ND5tl数据.方法21在TF-I细胞增殖生物测定中大肠杆菌表达的重组猕猴IL-4的中和TF-I细胞因响应包括猕猴IL-4在内的许多不同的细胞因子而增殖。因此，可将这 些细胞对IL-4的增殖性响应用于测量IL-4的生物活性，并随后开发出测定mAbdAb构建体 对IL-4的中和效价(抑制IL-4生物活性)的测定。在无菌条件下于无菌96孔组织培养板中实施测定，所有测试孔以一式三份进行。让大约2. 2ng/ml大肠杆菌表达的重组猕猴IL-4与mAbdAb构建体的各种稀释液(通常从 以3倍稀释滴定的200nM到0. 02nM)在50 μ 1总体积中于37°C预孵育1小时。然后将这 些样品加到无菌96孔组织培养板的50 μ 1的TF-I细胞(以每毫升2χ105个细胞的浓度) 中。因此，最后100 μ 1测定体积含有各种稀释度的mAbdAb构建体(以从以3倍稀释滴定 的IOOnM到0. OlnM的终浓度)、大肠杆菌表达的重组猕猴IL-4 (以1. lng/ml的终浓度)和 TF-I细胞(以每毫升IxlO5个细胞的终浓度)。让测定板在37°C增湿CO2培养箱中孵育大 约 3 天。然后用来自 Promega 的 ‘CellTitre 96 Non-Radioactive CellProliferation Assay'(货号G4100)如制造商说明书所述测定细胞增殖的量。在板读数器中于570nm处 读取96-孔板中的样品的吸光度。将mAbdAb构建体中和大肠杆菌表达的重组猕猴IL-4的生物活性的能力，表示 为中和限定量的猕猴IL_4(1. lng/ml)的生物活性到50%所需的mAbdAb构建体浓度(= ND5tl)。所需mAbdAb构建体的浓度越低，中和能力的功效越强。手动或通过用微软excel固 有的Robosage软件包计算本文提供的ND5tl数据。方法22通过ELISA测定人IL-13与人IL13警体α 2(IL13Ra )结合的抑制除非另外指出，否则所有试剂在使用前于封闭液(tris缓冲的盐水和0.05% Tween20中的牛血清白蛋白)中稀释到所需浓度。用包被缓冲液(0.05M碳酸氢盐 ρΗ9· 6，Sigma C-3041)溶液中的5μ g/ml在Sf21细胞中表达的重组人IL13Ra -Fc嵌合体 (R&D Systems，货号614-1R)于4°C过夜包被ELISA板。在加入业已于37°C与30ng/ml重组 人IL-13 (由GSK制备)预孵育30分钟的不同浓度的mAbdAb (或阳性对照mAb或dAb)之 前，让板于室温在封闭液(TBST中的BSA)中封闭1小时。在用洗涤缓冲液(Tris缓冲 的盐水和0. 05% Tween20)洗涤板3次之前，让板于室温孵育1小时。将50 μ 1的0. 5 μ g/ ml生物素化抗-人IL-13 (R&DSystems，货号BAF 213)溶液加入到每一孔，并在室温孵育1 小时。用洗涤缓冲液洗涤板3次，然后加入合适稀释度的Extravadin (Sigma，货号E2886)。 1小时后洗涤板，通过与OPD过氧化物酶底物(来自Sigma)孵育来检测色度信号，用终止溶 液(3M酸)终止该反应，通过在板读数器上于490nm处获得吸光度数据。在Excel表格上 对平均吸光度和标准差作图，用来自微软Excel的Robosage软件计算IC5tl值。方法23对结合大肠杆菌表达的重组猕猴IL-13的Biacore 结合亲和力评估由Biacore 分析评估了 mAbdAb (或mAb)分子对于大肠杆菌表达的重组猕猴 IL-13的结合亲和力。用蛋白A或抗-人IgG捕获抗体进行分析。简言之，按照制造商提 议通过伯胺偶联将蛋白A或抗-人IgG偶联到CM5芯片上。然后将mAbdAb (或mAb)分子 捕获到该表面上，以限定浓度使猕猴IL-13(由GSK制备并纯化)通过。用温和的酸洗脱条 件使该表面再生为蛋白A表面，这不会显著影响捕获抗体对随后的IL-13结合事件的能力。 在Biacore 3000和/或T100设备上实施该工作，用设备中的评估软件分析数据，并拟合 为1 1的结合模型。在25°C或37°C实施Biacore 运行。方法24对结合大肠杆菌表达的重组猕猴IL-4的Biacore 结合亲和力评估由Biacore 分析评估了 mAbdAb (或mAb)分子对于大肠杆菌表达的重组猕猴IL_4的结合亲和力。用蛋白A或抗-人IgG捕获抗体进行分析。简言之，按照制造商提议通过 伯胺偶联将蛋白A或抗-人IgG偶联到CM5芯片上。然后将mAbdAb (或mAb)分子捕获到 该表面上，以限定浓度使猕猴IL_4(由GSK制备并纯化)通过。用温和的酸洗脱条件(例 如IOOmM磷酸)使该表面再生为蛋白A表面，这不会显著影响捕获抗体对随后的IL-4结合 事件的能力。用与再生蛋白A表面相似的条件或通过用3M MgCl2H抗-人IgG表面再生。 在Biacore 3000和/或TlOO和/或AlOO设备上实施该工作，用设备中的评估软件分析 数据，并拟合为1 1的结合模型。在25°C或37°C实施Biacore 运行。方法25基于IL-13细胞的中和测定在IL-13细胞测定中用工程改造的报告细胞系HEK Blue_STAT6测定对IL13具有 特异性的mAbdAb的效价。转录因子STAT6主要由两种具有重叠生物学功能的细胞因子IL_4和IL-13激活， 这两种细胞因子结合由IL-4Ra和IL-13Ral组成的受体复合体。配体结合后，受体复合体 激活受体相关的Janus激酶(JAK1和Tyk2)，导致STAT6募集及其磷酸化。活化的STAT6形 成转移到细胞核的同型二聚体，诱导基因在响应型启动子控制下转录。将HEK Blue-STAT6 细胞系工程改造为在所述启动子调控下表达分泌性胎盘碱性磷酸酶(Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase, SEAP)。将细胞接种到96孔板，并与预先平衡的人IL-13及测试分子孵育20_24小时。在 该孵育期后，然后用Quanti-blue系统(Invivogen)测量因IL-13刺激而由细胞产生的 SEAP 量。实施例11.产生双重靶向的mAbdAb用以下方法构建表1-4中所述的双重靶向的mAbdAb。通过将编码结构域抗体的序 列移植到编码单克隆抗体重链或轻链(或二者)的序列上来产生表达构建体，致使表达时 dAb被连接到重链或轻链的C-末端。对于某些构建体，将接头序列用于连接结构域抗体与 重链CH3或轻链Ck。在其它构建体中，将结构域抗体不用接头序列直接连接到重链或轻 链。这些mAbdAb构建体的总示意图示于图8 (mAb重链用灰色画出；mAb轻链用白色画出； dAb用黑色画出)中。由图8中所述的mAbdAb 1型实例为PascoH-G4S_474。由图8中所述的mAbdAb 2 型实例为 PascoL-G4S-474。由图 8 中所述的 mAbdAb3 型实例为 PascoHL-G4S_474。mAbdAb 1型和2型为四价构建体，mAbdAb 3型为六价构建体。以下显示描述构建mAbdAb重链(上图)或mAbdAb轻链(下图)的示意图。除非 另外指出，否则将这些限制性位点用于构建表1-4所述的mAbdAb。Hindlll SpelBamHI EcoRI
VHCH1CH2CH3dAb
接头
Hindlll BsiWIBamHI EcoRI
VlCKdAb
接头注意对于重链，术语“VH”为单克隆抗体可变重链序列；“CH1、CH2和CH3”为人IgGl 重链恒定区序列；“接头”是所用的特定接头区的序列；“dAb”为结构域抗体序列。对于轻 链，术语为单克隆抗体可变轻链序列；“Ck ”为人轻链恒定区序列；“接头”是所用的特 定接头区的序列；“dAb”为结构域抗体序列。某些DNA表达构建体通过寡核苷酸构件(build)从头制备。其它DNA表达构建体 通过限制性克隆或位点定向诱变从现存的构建体(其根据上文所述来制备)获得。用标准分子生物技术将这些构建体(mAbdAb重链或轻链)克隆到哺乳动物表达载 体(RlruRld或pTT载体系列)。将哺乳动物氨基酸信号序列(如SEQ ID NO 64所示)用 于构建这些构建体。为了表达其中dAb连接到单克隆抗体重链的C-末端的mAbdAb，，让合适的重链 mAbdAb表达载体与对于该单克隆抗体的合适轻链表达载体配对。为了表达其中dAb连接到 单克隆抗体轻链的C-末端的mAbdAb，让合适的轻链mAbdAb表达载体与对于该单克隆抗体 的合适重链表达载体配对。为了表达其中dAb连接到单克隆抗体重链的C-末端并且其中dAb连接到单克隆 抗体轻链的C-末端的mAbdAb，让合适的重链mAbdAb表达载体与合适的轻链mAbdAb表达载 体配对。
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1. 1.命名及所用缩写 单克隆抗体(mAb) 单克隆抗体(mAbs) 结构域抗体(dAb) 结构域抗体(dAbs) 重链(H链) 轻链(L链) 重链可变结构域(Vh) 轻链可变结构域 人IgGl恒定重链区1 (CHl) 人IgGl恒定重链区2(CH2) 人IgGl恒定重链区3(CH3)
人κ轻链恒定区(CK)1. 2.抗-IL13mAb_ 抗 _IL4dAb如上所述构建双特异性抗-IL13mAb-抗_IL4dAb。将多种不同的接头用于将 抗-IL4结构域抗体连接到单克隆抗体。某些构建体没有接头。注意BamHI克隆位点(其编码氨基酸残基G和S)用于将接头和dAb克隆到mAb重 链的CH3或克隆到mAb轻链的C κ。因此，除既定的接头序列外，另外的G和S氨基酸残基 也存在于接头序列与重链及轻链表达构建体二者的结构域抗体之间，或于CH3与某些但不 是所有重链表达构建体中的接头序列之间。然而，当将G4S接头置于mAbdAb形式的mAb和 dAb之间时，已经存在BamHI克隆位点(由于G和S氨基酸残基为G4S接头序列内固有)， 因此，在CH3或Ck与用该接头的构建体内的结构域抗体之间不存在另外的G和S氨基酸 残基。当在mAbdAb形式的mAb和dAb之间不使用接头序列时，BamHI克隆位点(并因此G 和S氨基酸残基)仍存在于CH3或Ck与结构域抗体之间。关于mAbdAb重链和轻链的氨 基酸序列的详细资料在表1阐述。以下若干实施例使用IL_4mAb为对照抗体。在这些实施例中所用的对照IL_4mAb 将为具有SEQ ID NO :14重链序列和SEQ ID NO 15轻链序列的抗体，或将为具有SEQ ID NO 166重链序列和SEQ ID NO 15轻链序列的抗体。这两种IL_4mAb共享相同的⑶R，预期 它们以同样的方式结合，因此这两种抗体在以下实施例中都被称为帕考珠单抗“帕考珠单 抗(Pascolizumab)”或“IL-4mAb”。以下若干实施例使用IL_5mAb为对照抗体。在这些实施例中所用的对照IL_5mAb 应为具有SEQ ID NO :65重链序列和SEQ ID NO :66轻链序列的抗体，或为具有SEQ ID NO :191重链序列和SEQ ID NO :66轻链序列的抗体。这两种IL_5mAb共享相同的⑶R， 预期它们以同样的方式结合，因此这两种抗体在以下实施例中都被称为“美泊利单抗 (Mepolizumab) ”或 “ IL_5mAb，，。在CHOKl细胞上清液中瞬时表达表1中所述的mAbdAb。在定量测定mAbdAb后，分 析这些含有mAbdAb的上清液在IL-13和IL-4结合ELISA中的活性。表 1 在CHOKl或CHOEla细胞上清液中的一种或两者中表达表2所述的mAbdAb，经纯化 并在多种IL-13和IL-4活性测定法中分析。表2 1. 3.抗-IL4mAb_ 抗-IL13dAb如上所述构建双特异性抗-IL4mAb_抗-IL13dAb。将多种不同的接头用于连接 抗-IL13结构域抗体与单克隆抗体。某些构建体没有接头。注意BamHI克隆位点(其编码氨基酸残基G和S)用于将接头和dAb克隆到mAb 重链的CH3或克隆到mAb轻链的C κ。因此，除几既定接头序列外，另外的G和S氨基酸残 基也存在于接头序列与重链及轻链表达构建体二者的结构域抗体之间，或于CH3与某些但 不是所有重链表达构建体的接头序列之间。然而，当将G4S接头置于mAbdAb形式的mAb和 dAb之间时，已经存在BamHI克隆位点(由于G和S氨基酸残基为G4S接头序列内固有)， 因此，在CH3或Ck与用该接头的构建体内的结构域抗体之间不存在另外的G和S氨基酸 残基。当在mAbdAb形式的mAb和dAb之间不使用接头序列时，BamHI克隆位点(并因此G 和S氨基酸残基)仍存在于CH3或Ck与结构域抗体之间。关于mAbdAb重链和轻链的氨基酸序列的详细资料在表3中阐述。在CHOKl细胞上清液中瞬时表达表3中所述的mAbdAb。在定量测定mAbdAb后，分 析这些含有mAbdAb的上清液在IL-13和IL-4结合ELISA中的活性。表3 在CH0Kl、CH0Ela或HEK293-6E细胞中的一种或多种中表达表4中所述的mAbdAb。表 4 1. 4.单克隆抗体、结构域抗体和接头的序列ID号用于产生mAbdAb的单克隆抗体(mAb)、结构域抗体(dAb)和接头的序列ID号示于 下表5中。表 5 成熟人IL-13氨基酸序列(无信号序列)示于SEQ ID NO 63中。成熟人IL-4氨基酸序列(无信号序列)示于SEQ ID NO 62中。
1.5. mAbdAb的表达和纯化将实施例1所述的mAbdAb表达构建体转染到CHOKl细胞、CHOEla细胞或 HEK293-6E细胞中的一种或多种细胞中，小规模(大约3ml)或中等规模(大约50ml_100ml) 或大规模(大约1升)表达，然后用固定化的蛋白A柱纯化某些构建体，通过在280nm处读 取吸光度来定量测定。1. 6.纯化的mAbdAb的大小排阻色谱分析通过大小排阻色谱(SEC)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分 析了多种 mAbdAb。这些分子中的某些(PascoH-G4S_474，PascoL-G4S_474，PascoH-474 和 PascoHL-G4S-474.)的代表性数据分别示于图9、10、11和12。显示对这些除掉“GS”基序 的分子的SEC和SDS Page分析的代表性数据示于图90-98中。在某些情况下SEC用于进一步纯化这些分子以除去凝聚物。实施例2
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通过ELISA测定mAbdAb与人IL-13和人IL_4的结合2. 1.抗-IL13mAb-抗 _IL4dAb 与 IL-13 和 IL-4 的结合在直接结合ELISA (如方法1所述)中测试mAbdAb上清液对人IL-13的结合。这 些数据示于图13中。图13显示所有抗-IL13mAb-抗_IL4dAb结合IL-13。这些mAbdAb的结合活性亦 与单独的纯化的抗_人IL13mAb接近相等(在2倍-3倍内)，在本测定中包括所述抗_人 IL13mAb作为IL-13结合的阳性对照，并为了直接与mAbdAb比较。包括纯化的抗-人 IL4mAb (帕考珠单抗)作为IL-13结合的阴性对照。在直接结合ELISA (如方法2所述)中还测试这些分子与人IL-4的结合。这些数 据示于图14中。图14显示所有抗-IL13mAb_抗_IL4dAb结合IL-4，但未观察到在IL-4结合活性 中的某种程度变化。当mAbdAb构建体中不存在抗-IL4dAb时，未观察到与IL-4的结合。也 包括纯化的抗_人IL13mAb作为IL-4结合的阴性对照。注意在本测定中没有检测单独的 抗-IL-4dAb，因为所述dAb不能被第二检测抗体检测；取而代之的是在本测定中用纯化的 抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为阳性对照以证明IL-4结合。还可在直接结合ELISA (如方法1所述)中测试纯化的mAbdAb样品对人IL-13的 结合。这些数据示于图15中。这些纯化的抗-IL13mAb-抗-IL4dAb结合IL-13。这些mAbdAb对IL-13的结合活 性与单独的纯化的抗_人IL13mAb相等。在本测定中还包括同种型-匹配的mAb (对不相 关抗原具有特异性)作为IL-13结合的阴性对照。在直接结合ELISA (如方法2所述)中还测试这些纯化的mAbdAb与人IL-4的结 合。这些数据示于图16中。所有这些抗-IL13mAb_抗_IL4dAb结合IL-4。注意在本测定中不检测单独的 抗-IL-4dAb，因为所述dAb不能被第二检测抗体检测；取而代之的是，在该测定中使用纯化 的抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为阳性对照以证明IL-4结合。在本测定中还包括同种 型_匹配的mAb (对不相关抗原具有特异性)作为IL-4结合的阴性对照。2. 2.抗-IL4mAb-抗-IL13dAb 与 IL-13 和 IL-4 的结合在直接结合ELISA (如方法2所述)中测试mAbdAb上清液对人IL-4的结合。这 些数据示于图17 (某些样品一式二份制备和测试，并标注为样品1和样品2)。图17显示所有这些mAbdAb结合了 IL-4。在本测定中包括单独的纯化的抗-人 IL4mAb (帕考珠单抗)，但不产生结合曲线，因为当稀释该mAb用于测定时出错(帕考珠单 抗业已成功用于所有其它随后的IL-4结合ELISA)。包括纯化的抗-人IL13mAb作为IL-4 结合的阴性对照。在直接结合ELISA (如方法1所述)中还测试同一 mAbdAb上清液对人IL-13的结 合。这些数据示于图18 (某些样品一式二份制备和测试，并标注为样品1和样品2)。图18显示所有这些抗-IL4mAb-抗-IL13dAb结合IL-13。在本测定中包括单 独的纯化的抗-人IL13mAb，但不产生结合曲线，因为当稀释该mAb用于测定时出错(纯 化的抗-人IL13mAb业已成功用于所有其它随后的IL-13结合ELISA)。包括纯化的 抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为IL-13结合的阴性对照。注意在该测定中不检测单独的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因为该dAb不能被第二检测抗体检测。在直接结合ELISA(如方法2所述)中还检测纯化的抗-IL4mAb_抗_IL13dAb、 “PascoH-G4S-474”、“PascoH-474”、“PascoL-G4S-474”和“PascoHL-G4S-474”对人 IL-4 的 结合。这些数据示于图19中。这些纯化的抗-IL4mAb-抗-IL 13dAb结合IL-4。这些mAbdAb的结合活性与单独 的纯化的抗_IL4mAb (帕考珠单抗)接近相等(在2倍内)。在本测定中还包括同种型-匹 配的mAb (对不相关抗原具有特异性)作为IL-4结合的阴性对照。在直接结合ELISA(如方法1所述)中还检测这些相同的纯化的 抗-IL4mAb-抗 _IL13dAb、 PascoH-G4S_474、 PascoH_474、 PascoL-G4S_474 禾口 PascoHL-G4S-474对人IL-13的结合。这些数据示于图20A。这些纯化的抗-IL4mAb-抗_IL13dAb结合IL-13。在本测定中还包括同种型-匹 配的mAb (对不相关抗原具有特异性)作为IL-13结合的阴性对照。注意在本测定中没有 检测单独的抗-IL-13 dAb (D0M10-53-474)，因为所述dAb不能被第二检测抗体检测；取而 代之的是，在本测定中使用抗_人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。在如方法17所述的直接结合ELISA中，还检测纯化的PascoH-474、 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-ELQLE-474 对猕猴 IL-13 的结合(在本 测定中也包括去除GS的PascoH-474和去除GS的PascoH-TVAAPS_474，这些分子的构建如 实施例18所述)。显示代表性数据的图出示于图20B中。所有纯化的PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-ELQLE-474都结合猕猴IL-13。在本测定中包括单独的纯化的抗-人IL4mAb (帕考 珠单抗)作为IL-13结合的阴性对照。包括纯化的抗_人IL13mAb作为猕猴IL-13结合的 阳性对照。注意在本测定中没有检测单独的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因为该dAb不能 被第二检测抗体检测；取而代之的是，在本测定中使用抗-人IL13mAb作为阳性对照以证明 IL-13结合。实施例3通过表面等离子共振(BIAcorelg)检测mAbdAb与人IL-13和人IL_4的结合3. 1.通过 BIAcore 检测抗-IL13mAb-抗 _IL4dAb 与 IL-13 和 IL-4 的结合用BIAcore 于25°C (如方法4所述)检测mAbdAb (在CHO细胞上清液中，如1. 5 章节所述制备)对人IL-13的结合。对于该数据集，评估了两条IL-13浓度曲线(IOOnM和 InM)，关于每一 mAbdAb构建体的相对响应捕获水平达到1000至1300 (大约)之间。由于 使用限定浓度的IL-13，产生的数据更适用于为构建体排等级而不是准确的动力学测量。这 些数据示于表6中。表6
抗体结合亲和力KD (nM)586H-250. 39586H-G4S-250. 41 所有这些抗-IL13mAb-抗-IL4dAb以相似的结合亲和力结合IL-13，所述结合亲 和力与单独的纯化的抗_人IL13mAb结合亲和力接近相等。这些数据提示将接头和/或 抗-IL4dAb加到抗-IL13mAb重链，不影响这些mAbdAb构建体内mAb组分的IL-13结合亲 和力。也用BIAcore 于25°C (如方法5所述)检测这些mAbdAb对人IL-4的结合。这 些数据示于表7中。对于该数据集，评估了四个IL-4浓度曲线(512、128、32和8nM)，在表 中指出了关于所检测的每一 mAbdAb的大概相对响应捕获水平。注意在本测定中没有检测 单独的抗-IL-4dAb，因为不能将所述dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯片上； 取而代之的是，在本测定中使用抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为阳性对照以证明IL-4结
I=I ο表7 对上述某些数据集观察到预示(caveat)。对某些数据集(*)观察到次等曲线拟 合，因此，应该谨慎处理在这些数据中已经测定的实际结合亲和力值。某些曲线观察到正解 离(positive dissociation) (**)，因此，应该谨慎处理在这些数据中已经测定的实际结合 亲和力值。另外，BIAcore 不能(即不够灵敏)测定所有含有D0M9-112-210 dAb的mAbdAb 构建体的结合速率和解离速率，这是由于这些mAbdAb与IL-4的结合异常紧密。这些mAbdAb 对IL-4的结合动力学的测定进一步受到所观察到的正解离作用的妨碍。这些数据示于图 21中。在另外的实验中获得相似数据。这些数据示于图22中。这2个独立的数据集表明所有抗-IL13mAb_抗_IL4dAb结合IL_4，但结合亲和力 根据用于连接抗_IL4dAb与抗-IL13mAb重链的接头而变化。在本实验中，发现接头的存在 提高了 mAbdAb形式中抗-IL4dAb组分(当位于重链时)对IL-4的结合亲和力。例如，具 有TVAAPS或ELQLEESCAEAQDGELDG接头的分子似乎是更有效的结合物(binder)。当mAbdAb 构建体中不存在抗_IL4dAb时，没有观察到结合IL-4。由于这些mAbdAb的D0M9-112-210 组分结合得极为紧密并因此解离速率太小而不能用BIAcore 测定这一事实，测量586-接 头-210mAbdAb对于IL-4的结合亲和力是不可能的。也用BIAcore 在25°C (如方法4和5所述)检测纯化的抗-IL13mAb_抗_IL4dAb 对人IL-13和人IL-4的结合。这些数据示于表8中。表8 所有586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154 和 586H-TVAAPS-210 都以相似的结合亲 和力结合IL-13，所述结合亲和力与单独的纯化的抗-人IL13mAb结合亲和力接近相等。所有 586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154 和 586H-TVAAPS-210 都结合 IL-4。由于该 mAbdAb 的D0M9-112-210组分结合得极为紧密并因此解离速率太小而不能用BIAcore 测定这一事 实，测量586-TVAAPS-210对于IL-4的结合亲和力是不可能的。注意在本测定形式中没有检 测单独的抗-IL-4dAb (D0M9-155-25、D0M9-155-154 和 D0M9-112-210)，因为不能将该 dAb 捕 获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯片上；取而代之的是在本测定中用抗-人IL4mAb (帕 考珠单抗)作为阳性对照以证明IL-4结合。3. 2.通过 BIAcore 测定抗-IL4mAb_ 抗 _IL13dAb 与 IL-4 和 IL-13 的结合用BIAcore 于25°C (如方法5所述)检测mAbdAb (在CHO细胞上清液中，如1. 5 章节所述制备)对人IL-4的结合。这些数据示于表9 (某些样品以一式二份制备并测试， 其被标注为样品1和样品2)。对于该数据集，评估了四个IL-4浓度曲线(ΙΟΟηΜ、IOnMUnM 和0. InM)，表中指示关于所测的每一mAbdAb的大约的相对响应捕获水平。在本测定中还包 括同种型_匹配的mAb (对不相关抗原具有特异性)作为IL-4结合的阴性对照。表9
68 测试的所有抗-IL4mAb_抗_IL13dAb都以相似结合亲和力结合IL_4，该结合亲和 力与单独的抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)的结合亲和力接近相等。PascoL-EPKSC-474以比 帕考珠单抗小约2倍的效价结合IL-4。这些数据提示将接头和抗-IL13dAb加到帕考珠单 抗的重链或轻链，并不明显影响mAbdAb构建体中mAb组分对IL-4的结合亲和力。也用BIAcore 于25°C (如方法4所述)检测这些mAbdAb对人IL-13的结合。这 些数据示于表10 (某些样品以一式二份制备并测定，其被标注为样品1和样品2)。对于该 数据集，评估了四个IL-13浓度曲线(128nM、32nM、8nM和2nM)，表中指示关于所测的每一 mAbdAb的大约的相对响应捕获水平。表 10 在实验2中所测的构建体的结合亲和力数据也示于图23中。所有的抗-IL4mAb_抗-IL13dAb都结合IL-13。在大部分情况下，当将接头置于 抗-IL4mAb重链中时，接头的存在似乎不提高抗-IL13dAb组分对IL-13的结合亲和力。然 而，当将接头置于抗_IL4mAb轻链上时，接头的存在似乎不提高抗_IL13dAb组分对IL-13 的结合亲和力。在本实验中，PascoL-TVAAPS-474似乎具有最强的IL-13结合亲和力。
注意在本测定中没有检测单独的抗-IL-13dAb(D0M10-53_474)，因为不能将该 dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯片上；取而代之的是，在本测定中用纯化的 抗-人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。在本测定中还包括同种型-匹配的 mAb (对不相关抗原具有特异性)作为IL-13结合的阴性对照。也用BIAcore 于25°C (如方法4和5所述)检测纯化的抗-IL4mAb_抗_IL13dAb 对人IL-4和人IL-13的结合。这些数据示于表11中。表11 在该实验中，所有PascoH-G4S_474、PascoH-474、PascoL-G4S_474 和 PascoHL-G4S-474都以相似的结合亲和力结合IL-4，该结合亲和力与单独的抗-人 IL4mAb (帕考珠单抗)的结合亲和力接近相等。它们全部也结合IL-13。注意该测定中没 有检测单独的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因为不能将dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包 被的CM5芯片上；取而代之的是，在本测定中将抗-人IL13mAb用作阳性对照以证明IL-13
社a
？口口。3. 3.用 BIAcore 的 IL-13 和 IL-4 与抗-IL4mAb_ 抗 _IL13dAb 结合的化学计量用BIAcore (如方法7所述)评估纯化的抗-IL4mAb_抗_IL13dAb结合IL-13和 IL-4的化学计量。这些数据示于表12中。表12 PascoH-G4S_474、PascoH-474 和 PascoL-G4S_474 能够结合几乎两个 IL-13 分子 和两个IL-4分子。PascoHL-G4S-474能够结合几乎两个IL-4分子和几乎4个IL-13分子。 这些数据表明所测构建体能够被预期数目的IL-13或IL-4分子完全占据。实施例4mAbdAb在IL-13和IL_4牛物测定中的中和效价4. 1.抗-IL 13mAb-抗 _IL4dAb在TF-I细胞生物测定(如方法8所述)中测试纯化的抗-IL13mAb_抗_IL4dAb 对人IL-13的中和。这些数据示于图24中。在TF-I 细胞生物测定中，纯化的抗-IL13mAb-抗-IL4dAb、586H-TVAAPS_25、 586H-TVAAPS-154 和 586H-TVAAPS-210 完全中和 IL-13 的生物活性。这些 mAbdAb 的 中和效价在单独的纯化的抗-人IL_13mAb效价的2倍内。在该测定中包括纯化的 抗-人 IL-4mAb (帕考珠单抗)和纯化的抗 _IL4dAb (D0M9-155-25、D0M9-155-154 或 D0M9-112-210)作为中和IL-13的阴性对照。也在TF-I细胞生物测定(如方法9所述)中检测纯化的抗-IL13mAb-抗-IL4dAb、 586H-TVAAPS-25、586H-TVAAPS-154 和 586H-TVAAPS-210 对人 IL-4 的中和。这些数据示于 图25中。在该TF-I细胞生物测定中，586H-TVAAPS-210完全中和IL-4的生物活性。该 mAbdAb的中和效价在单独的纯化的抗-人IL-4dAb (D0M9-112-210)中和效价的2倍 内。586H-TVAAPS-25和586H-TVAAPS-154不中和IL-4的生物活性，这与单独的纯化 的抗-人 IL-4dAb (D0M9-155-25 和 D0M9-155-154)相反。如 BIAcore 所证明，纯化的 586H-TVAAPS-25 和 586H-TVAAPS-154 对于 IL-4 具有 1. InM 和 0. 49nM 的结合亲和力(分 别)。IL-4结合IL-4受体极为紧密(在文献出版物中报道大约为50pM的结合亲和力)，因 此，在TF-I细胞生物测定中观察到586H-TVAAPS-25或586H-TVAAPS-154 二者都不能有效 中和IL-4的生物活性，这可能是与IL-4对于IL-4受体的效价相比，这些mAbdAb对于IL-4 的亲和力相对较低的结果。在本生物测定中包括纯化的抗-人IL_4mAb (帕考珠单抗)作为中和IL_4的阳性 对照。在本生物测定中包括纯化的抗_人IL-13mAb作为中和IL-4的阴性对照。4. 2.抗-IL4mAb~ 抗 ~IL13dAb
在TF-I细胞生物测定(如方法9所述)中检测纯化的抗-IL4mAb-抗-IL 13dAb、 PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 对人 IL-4 的中和。这 些数据示于图26中。在TF-I 细胞生物测定中，纯化的抗-IL4mAb-抗 _IL13dAb、PascoH-G4S_474、 PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 完全中和 IL-4 的生物活性。这些mAbdAb 的中和效价与单独的纯化的抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)、纯化的抗-人IL-13mAb、纯化的 D0M10-53-474dAb的中和效价接近相等，并且在本生物测定中也包括对不相关抗原具有特 异性的dAb (阴性对照dAb)作为IL-4中和的阴性对照。在TF-I细胞生物测定(如方法8所述)中，检测纯化的抗-IL4mAb_抗-IL 13dAb、 PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S-474 对人 IL-13 的中和。这 些数据示于图27中。在TF-I 细胞生物测定中，纯化的抗-IL4mAb_ 抗 _IL13dAb、PascoH-G4S_474、 PascoH-474、PascoL-G4S_474 和 PascoHL-G4S_474 完全中和 IL-13 的生物活性。这些 mAbdAb的中和效价在单独的纯化的抗-IL13dAb(D0M10-53-474)中和效价的3倍内。在本 生物测定中还包括纯化的抗_人IL-13mAb作为IL-13中和的阳性对照。在本生物测定中， 还包括对不相关抗原具有特异性的dAb (阴性对照dAb)和单独的纯化的抗-人IL4mAb (帕 考珠单抗)作为IL-4中和的阴性对照。还在双重中和TF-I细胞生物测定(如方法10所述)中检测纯化的 抗-IL4mAb-抗 _IL13dAb、 PascoH-G4S_474、 PascoH-474、 PascoL-G4S_474 禾口 PascoHL-G4S-474对人IL_4和人IL-13的同时中和。这些数据示于图28中。在双重中和TF-I细胞生物测定中，纯化的抗-IL4mAb-抗_IL13dAb、 PascoH-G4S-474、PascoH-474, PascoL-G4S_474 和 PascoHL-G4S_474 完全中和 IL-4 和 IL-13 二者的生物活性。这些mAbdAb的中和效价与纯化的抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)和 纯化的抗-IL13 dAb (D0M10-53-474)组合的中和效价接近相等。在该双重IL-4和IL-13 中和生物测定中，单独的纯化的抗_人IL-13mAb、单独的纯化的抗-人IL-4mAb (帕考珠单 抗)和单独的抗-人IL-13dAb(D0M10-53-474)(其作为阴性对照被包括在内)并不完全中 和IL-4和IL-13 二者的生物活性。实施例5dAb 的 SEC-MALLS 分析通过SEC-MALLS (大小排阻色谱法-多角度激光散射)表征抗原特异性dAb 的溶液状态，结果示于表13中D0M10-53-474，dAb在溶液中以单体存在，而所有D0M9 dAb (D0M9-112-210,D0M9-155-25.D0M9-155-147 和 D0M9-155-154)可形成稳定二聚体(在 某些情况下为四聚体)。5.1.蛋白的制备将样品纯化并透析到合适的缓冲液例如PBS中。透析后过滤样品，测定浓度 (0. 43mg/ml D0M-155-25)、(1. 35mg/ml D0M9-155-147)禾Π 1. 4mg/ml D0M9-155-159)。将 D0M10-53-474 和 D0M9-112-210 调整为 lmg/ml。BSA购自Sigma，无需进一步纯化使用。5.2.大小排阻色谱法和检测仪设置
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将带有自动进样器(SIL-20A)和SPD-20A Prominence紫外/可见光检测仪的 Shimadzu LC-20AD Prominence HPLC 系统连接到 WyattMini Dawn Treos (MALLS，多角度 激光散射检测仪)和Wyatt OptilabrEX DRI (示差折光率)检测仪。按以下顺序连接检 测仪LS-UV-RI。RI和LS两种仪器都在488nm波长处操作。以50mM磷酸盐缓冲液(不含 盐)或IxPBS ( 二者都是pH7. 4)流动相使用TSK2000 (Tosoh公司))柱(基于二氧化硅的 HPLC柱)。所用流速为0.5或Iml/分钟，调整运行时间(45或23分钟)来形成不同的流 速，不期望对分子的分离有显著影响。在缓冲液中将蛋白制备成lmg/ml的浓度，注射体积 为 IOOul。5. 3.检测仪标定按照制造商说明书用甲苯标定激光散射检测仪。5. 4.用BSA标定检测仪将UV检测仪输出和RI检测仪输出连接到光散射设备上，致使能同时用Wyatt ASTRA软件收集来自所有三个检测仪的信号。使若干含BSA的PBS流动相的注射液(lml/ 分钟)流过Tosoh TSK2000柱，由Wyatt软件收集UV、LS和RI信号。然后用ASTRA软件分 析图录(trace)，按照制造商说明书针对谱带增宽对信号进行标准化、比对和校正。然后将 标定常数取平均值，并输入到用于将来样品运行的模板中。5. 5.绝对摩尔质量计算将IOOul的各个样品注射到合适的预平衡柱上。样品经过SEC柱后经过3个在线检测仪-UV检测仪、MALLS (多角度激光散射)检 测仪和DRI (示差折光率)检测仪，其使得可测定绝对摩尔质量。在柱上进行的稀释为约10 倍，酌情测定溶液状态中的浓度。ASTRA以及通常在批样品模式中执行的Zimm作图技术的计算基础是来自Zimm的 方程式[J. Chem. Phys. 16，1093-1099 (1948)]-^ =(方程式 1) K c ·其中· C为溶剂中溶质分子的质量浓度(g/mL)· M为重均分子量(g/mol)· A2 为第二维里系数(mol mL/g2)·Κ* = ApWdh/dW4、1，其为光学常数，其中nQ为溶剂在入射辐射(真 空)波长的折射率，1。为入射辐射(真空)波长，以纳米表示，Na为阿伏伽德罗数，等于 6. 022xl023mor1,而dn/dc为溶剂-溶质溶液关于溶质浓度变化的示差折射率增量，以mL/g 表示(该系数应该用dRI检测仪独立测量)。#P(q)为理论推导的波形因素，大约等于L_2y2<r2>/31+···，其中μ = (4 π/λ) sin (θ/2)，而<r2>为均方半径。P (q)为分子的z_平均大小、 形态及结构的函数。· Rq 为超出的瑞利(Rayleigh)比(cm—1)本方程式假设为垂直偏振入射光，并对于阶(order) c2有效。为了用Zimm拟合方法进行计算，我们需要展开方程式1 一阶c的倒数，所述Zimm拟合方法为拟合到R/K*c对比sin2(q/2)为了用Zimm拟合方法进行计算，我们需要展开方程式1 一阶c的倒数，所述Zimm 拟合方法为拟合到Rq/K*c对比sin2 (q/2)1^=^^+她「方程式2
P在该情况下合适的结果是
'V"1M-j —-2Α, 方程式 3
I ^ - /禾口=方程式 4其中m。Ed[K*C/R0]/d[Sin3(e/2)]0_o 方程式 5通过ASTRA软件进行自动计算，其产生具有所测的每一部分(slice)的摩尔质量 图表[Astra手册]。将从在色谱图中观察到的每个峰的图获得的摩尔质量与一个单位的蛋白质的预 期分子量比较。这提供得到关于蛋白质溶液状态的结论的基础。代表性数据示于表13中。表13:概述 D0M10-53-474具有确定为约14kDa的平均摩尔质量的单峰表明在溶液中为单体状态，其示于图 29中。D0M9-112-210具有确定为30kDa的摩尔质量的单峰表明在溶液中为二聚体状态，其示于图30中。
75
D0M9-155-25精致的对称峰，但在缓冲液前面流出。峰的中间部分用作摩尔质量测定(参见含 所有三个重叠信号的下图)。摩尔质量为28kDa，其代表二聚体dAb，示于图31中。所有三个信号重叠(图32)。D0M9-155-147主峰的右边部分确定为26kDa摩尔质量，峰的左边向上渐陡的部分确定为高达 53kDa。该峰最可能代表二聚体和在快速平衡中的小部分四聚体。在7. 6分钟洗脱的更小 的峰代表摩尔质量为51kDa的四聚体蛋白质(图33)。D0M9-155-159蛋白质作为单个对称峰流动，其确定为约28kDa的平均摩尔质量，这表明在溶液 中为二聚体状态(图34)。用于通过SEC-MALLS确定丽的对照BSA上所述的每一次实验的每一次BSA流动产生预期的棚，例如含67及145kDa摩尔 质量的2个峰(单体和二聚体)(图35)。实施例6产牛三特异件mAbdAb通过组装PCR产生VH和VL序列然后克隆到现有的mAbdAb表达载体，或通过将 来自mAb表达载体的现有VH和VL区亚克隆到现有mAbdAb表达载体，来构建三特异性 mAb-dAb，致使当表达时，该三特异性mAbdAb具有连接到重链和轻链二者的C-末端的dAb。将接头序列用于连接结构域抗体与重链CH3或轻链C κ。三特异性mAbdAb分子的 示意图示于图36(mAb重链画为灰色；mAb轻链画为白色；dAb画为黑色)中。以下显示阐明构建三特异性mAbdAb重链(上图)和三特异性mAbdAb轻链(下
图)的示意图。 对于重链，术语“VH”为单克隆抗体可变重链序列；“CH1、CH2和CH3”为人IgGl重 链恒定区序列；“接头”是所用的特定接头区的序列；“dAb”为结构域抗体序列。对于轻链 “八”为单克隆抗体可变轻链序列；“Ck ”为人轻链恒定区序列；“接头”是所用的特定接头 区的序列；“dAb”为结构域抗体序列。将哺乳动物氨基酸信号序列(如SEQ ID NO 64所示)用于产生这些构建体。
6. 1.三特异性抗-IL18mAb-抗-IL4dAb_ 抗 _IL13dAb通过将编码抗-人IL-4结构域抗体(D0M9-112-210)的序列移植到编码重链的序 列上，并将编码抗-IL13结构域抗体(D0M10-53-474)的序列移植到编码抗-人IL-18人源 化单克隆抗体轻链的序列上，来构建三特异性抗-IL18mAb-抗-IL4dAb-抗_IL13dAb (也称 为IL18mAb-210-474)。G4S接头用于将抗-IL4结构域抗体连接到单克隆抗体重链上。G4S 接头还用于将抗-IL13结构域抗体连接到单克隆抗体轻链上。在CHOKl细胞上清液中瞬时表达IL18mAb-210_474，在对细胞上清液中的 IL18mAb-210-474定量测定后，以多种IL-18、IL-4和IL-13结合测定法进行分析。 6. 2.三特异性抗-IL5mAb-抗-IL4dAb_ 抗 _IL13dAb通过将编码抗-人IL-4结构域抗体D0M9-112-210的序列(SEQ IDNO 4)移植到 编码抗-人IL-5人源化单克隆抗体(SEQ ID NO 65)的重链序列上，并将编码抗-IL13结 构域抗体D0M10-53-474的序列(SEQID NO 5)移植到编码抗-人IL-5人源化单克隆抗体 轻链的序列(SEQID NO 66)上，来构建三特异性抗-IL5mAb_抗-IL4dAb_抗-IL13dAb (也 称为M印O-210-474)。G4S接头用于将抗-IL4结构域抗体连接到单克隆抗体重链上。G4S 接头还用于将抗-IL13结构域抗体连接到单克隆抗体轻链上。在CHOKl和HEK293-6E细胞上清液中瞬时表达该mAbdAb，在对细胞上清液定量后， 以多种IL-4、IL-5和IL-13结合测定法进行分析。 6.3.单克隆抗体、结构域抗体和接头的序列用于产生三特异性mAbdAb的单克隆抗体、结构域抗体和接头的序列(或在以下举 例说明的内容中用作对照试剂)示于下表14中。表 14 成熟人IL-4氨基酸序列(无信号序列)示于SEQ ID NO 62中。成熟人IL-13氨基酸序列(无信号序列)示于SEQ ID NO 63中。6. 4.三特异性mAbdAb的表达和纯化用标准分子生物学技术将编码三特异性mAbdAb分子的DNA序列克隆到哺乳动物 表达载体(Rln、Rld或pTT)。将三特异性mAbdAb表达构建体瞬时转染到CHOKl或HEK293-6E 细胞之一或二者中，以小规模(3ml-150ml)表达。用于产生三特异性mAbdAb的表达程序与 常规用于表达单克隆抗体的程序相同。用固定化的蛋白A柱纯化某些构建体，通过在280nm处读取吸光度来定量测定。实施例7通过ELISA测定三特异性mAbdAb与人IL-4、人IL-13和人IL-18的结合7. 1.通过 ELISA 测定 IL-18mAb-210_474 与 IL-4、IL-13 和 IL-18 的结合在直接结合ELISA(如方法1、2和3所述)中，检测如实施例6所述制备的三特异 性 mAbdAb IL18mAb-210-474(上清液)(SEQ IDNO :69 和 70)对人 IL-18、人 IL-13 和人 IL-4 的结合，这些数据分别示于图37、38和39(多次制备并检测IL18mAb-210-474，其在图中被 标注为样品1、样品2、样品3等)中。这些图显示IL18mAb-210-474 通过 ELISA 结合 IL-4、IL-13 和 IL-18。在 IL-18 结 合ELISA中包括纯化的抗-人IL18mAb作为IL-18结合的阳性对照。在IL-4结合ELISA中 没有检测抗-IL-4dAb(D0M9-l 12-210)，因为该dAb不能被第二检测抗体检测；取而代之的 是，在该ELISA中用纯化的抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为阳性对照以证明IL-4结合。 在IL-13结合ELISA中没有检测抗-IL_13dAb (D0M10-53-474)，因为该dAb不能被第二检 测抗体检测；取而代之的是，在该ELISA中用纯化的抗-人IL-13mAb作为阳性对照以证明 IL-13结合。如图所示，在每次结合ELISA中包括针对不相关抗原的阴性对照mAb。
在每次ELISA中，IL18mAb-210_474样品5的结合曲线位置上远离其它 IL18mAb-210-474样品的结合曲线。其原因尚不知道，然而，可能是由于在人IgG定量ELISA 中对于该特定IL18mAb-210-474样品5的定量问题。7. 2.通过 ELISA 测定 M印0-210-474 与 IL-4 和 IL-13 的结合在直接结合ELISA (分别如方法1和2所述)中，检测如第1部分所述制备的三特 异性mAbdAb M印o-210-474(上清液)(序列ID号为71和72)对人IL-13和人IL-4的结 合，这些数据分别示于图40和41(M印O-210-474以一式四份制备并检测，其被标注为样品 1、样品2、样品3和样品4)中。这些图说明M印O-210-474通过ELISA结合IL-4和IL-13。在IL-4结合ELISA中 没有检测抗-IL-4dAb(D0M9-l 12-210)，因为该该dAb不能被第二检测抗体检测；取而代之 的是，在该ELISA中用纯化的抗-人IL-4mAb (帕考珠单抗)作为阳性对照以证明IL-4结 合。在IL-13结合ELISA中没有检测抗-IL_13dAb (D0M10-53-474)，因为该dAb不能被第二 检测抗体检测；取而代之的是，在该ELISA中包括纯化的抗-人IL-13mAb作为阳性对照以 证明IL-13结合。如图40和41所示，在每次结合ELISA中包括针对不相关抗原的阴性对 照 mAb。在一个瞬时转染实验中制备M印O-210-474样品1和样品2，在另一单独的瞬时转 染实验中制备M印O-210-474样品3和样品4。在IL-13和IL-4结合ELISA中，所有四种 样品都结合IL-13和IL-4。然而，样品1和2相对样品3和4结合曲线不同的原因尚不知 道，但可反映在每一次转染实验中产生的mAbdAb (在上清液中)的质量差异。实施例8通过表面等离子共振(BIAcoren)测定三特异性mAbdAb与人IL_4、人IL_5、人 IL-13和人IL-18的结合8. 1.通过 BIAcore 测定 L-18mAb_210-474 与 IL-4、IL-13 和 IL-18 的结合用BIAcore 于25°C (分别如方法4、5和6所述)检测如实施例6. 1所述制备的 三特异性 mAbdAb IL18mAb-210_474 (上清液)(SEQ IDNO 69 和 70)对人 IL-4、人 IL-13 和 人IL-18的结合。捕获水平在大约400-850响应单位范围内。检测每一分析物的三个浓度 (256,32和4nM)。得到的数据示于表15 (样品以一式三份制备并检测，其被标注为样品1、 样品2和样品3)中。表 15
79 *由于正解离作用和BIAcore 技术的灵敏度水平而不能测定KD用 BIAcore 确定了 三特异性 mAbdab 结合 IL-4、IL-13 和 IL-18。mAbdAb 对 IL-18的结合亲和力与单独的纯化的抗-人ILlSmAb的结合亲和力接近相等，在该测定 中包括单独的纯化的抗_人IL18mAb作为IL-18结合的阳性对照，便于直接与mAbdab的 结合亲和力比较。由于该三特异性mAbdAb的D0M9-112-210组分极为紧密地结合IL-4 并因此解离速率太小而不能用BIAcore 测定这一事实，不可能测定mAbdab对IL-4的 绝对结合亲和力。在该测定中没有检测单独的抗-IL-4dAb(D0M9-l 12-210)，因为不能将 该dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯片上；取而代之的是，在该测定中包括 抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为阳性对照以证明IL-4结合。在该测定中没有检测单独 的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因为不能将该dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5
80芯片上；取而代之的是，在该测定中包括抗_人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。8. 2.通过 BIAcore 测定 M印0-210-474 与 IL-4、IL-5 和 IL-13 的结合用BIAcore 于25°C (分别如方法5、11和4所述)检测如实施例6. 2所述制备 的三特异性mAbdAb M印o-210-474(上清液)(SEQ ID NO 71和72)对人IL-4、人IL-5和 人IL-13的结合。捕获水平在大约450-900响应单位范围内。对于IL-4和IL-13结合，检 测每一分析物的5个浓度(256、64、16、4和InM)。对于IL-5结合，检测每一分析物的4个 浓度(64、16、4和InM)。得到的数据示于表16中。表 16 用BIAcore 测定了 M印0-210-474 结合 IL-4、IL-5 和 IL-13。M印0-210-474 对 IL-5的结合亲和力与纯化的抗-人IL5mAb (美泊利单抗)的结合亲和力接近相等，在该测定中包括纯化的抗_人IL5mAb作为IL-5结合的阳性对照，便于直接与M印O-210-474的 结合亲和力比较。由于该三特异性mAbdAb的D0M9-112-210组分极为紧密地结合IL-4并 因此解离速率太小而不能用BIAcore 测定这一事实，不可能测定M印O-210-474对IL-4 的绝对结合亲和力。在该测定中没有检测单独的抗-IL-4dAb(D0M9-l 12-210)，因为不能 将该dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯片上；取而代之的是，在该测定中包括 抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为阳性对照以证明IL-4结合。在该测定中没有检测单独的 抗-IL-13 dAb (D0M10-53-474)，因为不能将该dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5 芯片上；取而代之的是，在该测定中包括抗_人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。实施例9化学计量9. 1.用 BIAcore 的 IL_4、IL_13 和 IL-18 与 IL-18mAb-210_474 结合的化学计量用BIAcore (如方法7所述)评估IL18mAb-210_474(在CHO细胞上清液中如第 1章节所述制备)(SEQ ID NO 69和70)对IL_4、IL_13和IL-18结合的化学计量。这些数 据示于表17(R-maX为饱和结合响应，其为按照方法7中给出的公式计算化学计量所需要) 中。每种细胞因子的浓度为500nM。注射位置指加入每一种细胞因子的次序。表17 化学计量数据表明IL18mAb-210-474结合大约两个IL-18分子、两个IL-13分子 和仅一个IL-4分子。已知单独的抗-IL4dAb(D0M9-l 12-210)在溶液状态中为二聚体，仅能 够结合一个IL-4分子。因此，IL18mAb-210-474仅结合一个IL-4分子是在意料之中。这 些数据表明所测分子能被预期数目的IL-18、IL-13和IL-4分子完全占据。所述化学计量数据还表明细胞因子的捕获次序似乎与加入细胞因子的次序无关。实施例1010. 1.产牛双重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb通过让dAb与mAb重链C-末端融合，来构建该双重靶向的mAbdAb。先前业已构建 了抗-TNF mAb重链和轻链表达盒。用于克隆的限制性位点在下面显示(图42)。为了将用于插入dAb的限制性位点引入到重链中，用mAb重链表达载体作为模板 将位点定向诱变用于产生SalI和HindIII克隆位点。然后通过PCR(用编码SalI和HindIII 末端的引物)扩增编码抗-EGFRdAb (D0M16-39-542)的DNA，并将其插入到经修饰的3’编码 区，在mAb和dAb之间产生接头“STG” (丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸)。选择已验证序列的克隆(SEQ ID NO 170和169分别为轻链和重链)，按照制造商 方案用Qiagen Mega Prep试剂盒大规模制备。通过用瞬时转染技术共转染轻链和重链(SEQ ID NO 73和74)在哺乳动物HEK293-6E细胞中表达mAbdAb。10. 2.双重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb的纯化和SEC分析按照已确定的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液中纯化抗-TNF/ 抗-EGFR mAbdAb。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度测量值确定纯化样品的浓 度。纯化的样品的SDS-PAGE分析(图43)显示未经还原的样品泳动至约170kDa，而经还原 的样品显示为泳动至约25和约60kDa的两条带，其分别对应于轻链和融合dAb的重链。对于大小排阻色谱(SEC)分析，将抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb上样到预平衡的 Superdex-200 10/30HR 柱(连接到 Akta Express FPLC 系统)，并用 PBS 以 0. 5ml/ 分钟流 动。SEC曲线显示作为对称峰流动的单一物质(图44)。10. 3.双重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb的结合亲和力分别如方法13和14所述测定对EGFR和TNF的结合亲和力。用GraphPad Prism 分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。该mAbdAb的 抗-EGFR效价(图45)计算为39. InM,而对照抗-EGFR mAb给出的EC50值为3. 4nM。在 抗-TNF生物测定(图46)中，mAbdAb效价为3pM(0. 0028nM)，而抗-TNF对照mAb产生的 EC50为104pM。综上所述，测定数据显示实施例10的构建体即双重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb对两种抗原都有效。10. 4.双重靶向的抗-TNF/抗-EGFR mAbdAb的大鼠PK在大鼠中检测该分子的体内药代动力学特性。静脉内给予三只大鼠抗-TNF/ 抗-EGFR mAbdAb,经7天(168小时)时间采集血清样品。通过针对TNF及EGFR的ELISA 评估给药后不同时间点残留的药物浓度。结果示于图125中。PK参数证实该分子具有长半衰期，与先前观察的未经修饰的阿达木单抗 (adalimumab)在同一区域(125小时)。进一步的详细资料示于表17. 1中。表 17. 1
83 实施例1111. 1.产牛双重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb采用实施例10所述相似策略制备抗-TNF/抗-VEGF。为了构建重链表达盒，采用编 码实施例10重链的载体DNA作为起始点。用限制性酶SalI和HindIII切割抗-EGFR dAb。 通过PCR(用编码Sail和HindIII末端的引物)扩增DOMl5-26-593 (抗-VEGF dAb)，并将 其连接到具有先前业已通过相同限制性位点切割的抗-EGFR dAb的载体主链，在mAb和dAb 之间产生接头“STG”(丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸)。选择已验证序列的克隆(SEQ ID NO 169和168分别为轻链和重链)，大规模制 备DNA制备物，通过用瞬时转染技术共转染轻链和重链(SEQ ID NO :73和75)在哺乳动物 HEK293-6E 细胞中表达抗-TNF/ 抗-VEG mAbdAb。11. 2.双重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb的纯化和SEC分析按照已确定的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液中纯化抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb (命名为DMS4000)。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度测量值确 定纯化样品的浓度。纯化的样品的SDS-PAGE分析(图47)显示未经还原的样品泳动至约 170kDa，而经还原的样品显示为泳动至约25和约60kDa的两条带，其分别对应于轻链和融 合dAb的重链。对于大小排阻色谱(SEC)分析，将抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb上样到经预平衡的 Superdex-200 10/30HR 柱(连接到 Akta Express FPLC 系统)，并用 PBS 以 0. 5ml/ 分钟 流动。SEC曲线显示作为对称峰流动的单一物质(图48)。11. 3.双重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb的结合亲和力分别如方法12和14所述测定对EGFR和TNF的结合亲和力。用GraphPad Prism 分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。该mAbdAb的 抗-VEGF效价(图49)计算为57pM，而对照抗-VEGF mAb给出的EC50值为366pM。在抗-TNF 生物测定(图50)中效价为ΙΟρΜ，而抗-TNF对照mAb产生的EC50为22pM。综上所述，测 定数据显示实施例11的分子即双重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb对两种抗原都有效。11. 4.双重靶向的抗-TNF/抗-VEGF mAbdAb的大鼠PK在大鼠中检测该分子的体内药代动力学特性。静脉内给予三只大鼠抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb,经10天(240小时)时间采集血清样品。通过针对TNF及VEGF 二者的 ELISA评估给药后不同时间点残留的药物浓度。结果示于图126中。PK参数证实该分子具有可与未经修饰的阿达木单抗相比的体内药代动力学特性。 不认为所观察到的对VEGF组分的较短t1/2 β具有意义，其可能是测定假象。进一步的详细 资料示于表17. 2中。
表 17. 2 11. 5.备选抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb 的产生以与上面实施例11. 1所述相似的方式构建备选抗-TNF/抗-VEGFmAbdAb，该过 程用STG接头将同样的抗-TNF mAb连接到重链C-末端上的VEGF dAb。在该案例中所用 抗-VEGF dAb为D0M15-10-11。通过用瞬时转染技术共转染轻链和重链(SEQ ID NO :73和 185)在哺乳动物HEK293-6E细胞中表达该分子。该分子经表达获得与实施例11. 2所述相 似的表达水平的mAbdAb，然而，当如实施例11. 3所述在相同的VEGF测定中检测效价时，在 该测定中发现具有不可检测的抑制VEGF结合VEGF受体的水平。实施例1212. L产牛双重靶向的抗-VEGF/抗-ILlRl dAb-延伸的IgG按照在dAb和两个链的恒定区之间插入假体V结构域(Dummy Vdomain)编码区的 策略，用标准分子生物学技术构建两个双重靶向的dAb-延伸IgG分子。对于轻链，先前将抗-ILlRl dAb 00114-130-54克隆到含5&11和88丨11位点的表达 盒(图51)，以产生dAb-Ck链。为了制备dAb-延伸的IgG轻链，通过PCR用两端编码BsiWI 的引物扩增假体Vk区。用BsiWI消化含有dAb-Ck表达盒的质粒。让BsiWI消化的假体Vk 结构域与其连接，产生在两个可变结构域之间含“TVAAPS”接头的dAb-延伸的IgG轻链。按照同样的策略产生dAb-延伸的IgG重链，其中将PCR扩增的含NheI端的假体 VH结构域连接到经NheI消化的dAb重链，在dAbD0M15-26和CHl之间(图51)，其在两个 可变结构域之间有接头“ASTKGPS”。其被命名为DMS2090，具有 SEQ ID NO 163 (SEQ ID NO 162 的 DNA 序列)中所述 的序列。其与SEQ ID NO 77 (DNA序列SEQ ID NO 171)中所述的轻链配对。以同样方式但用dAb D0M15-26-593构建第二条重链。其被命名为DMS2091，具有 SEQ ID NO 76 (DNA 序列 SEQ ID NO 172)中所述的序列。其与 SEQ ID NO 77 (DNA 序列 SEQ ID NO 171)中所述的轻链配对。选择已验证序列的克隆，按照制造商方案用Qiagen Maxi或MegaPr印试剂盒大规 模制备DNA制备物。通过用瞬时转染技术共转染轻链和重链在哺乳动物细胞中表达得到的 构建体。12. 2.双重靶向的抗-VEGF/抗-ILlRl mAbdAb的纯化和SEC分析按照已确定的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液中纯化两种 抗-ILlRl/抗-VEGF dAb-延伸的IgG分子。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度 测量值确定纯化样品的浓度。DMS2090的SDS-PAGE分析示于图52，DMS2091的SDS-PAGE分 析示于图53。两种纯化的样品都显示未经还原的样品泳动至190kDa，而经还原的样品显示 为泳动到35和60kDa的两条带，其分别对应于dAb-延伸的轻链和重链。对于大小排阻色谱(SEC)分析，将抗-VEGF/抗-ILlRl dAb-延伸的-IgG上样到经
85预平衡的 Superdex-20010/30HR 柱(连接到 Akta ExpressFPLC 系统)，并用 PBS 以 0. 5ml/ 分钟流动。DMS2090(图54)和DMS2091 (图55) 二者的SEC曲线都显示作为对称峰流动的
单一物质。12. 3.双重靶向的抗-VEGF/抗-ILlRl mAbdAb的结合亲和力分别如方法12和15所述测定对VEGF和ILlRl的结合亲和力。用GraphPad Prism 分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。计算DMS2090的 抗-VEGF效价(图57)为158. 4pM，而对照抗-VEGF mAb给出的EC50值为689. 2pM。计算 DMS2091的抗-VEGF效价(图56)为55pM，而对照抗-VEGF mAb给出的EC50值为766pM。在抗-ILlRl生物测定(图46)中，DMS2090效价(图58)为32pM，而抗-ILlRl对 照mAb产生的EC50为35pM。DMS2091效价(图59)为17. 47pM,而抗-ILl-Rl对照mAb产 生的 EC50 为 35. 02pM。综上所述，测定数据显示实施例12的双重靶向的抗-ILlRl/抗-VEGF dAb_延伸 的IgG对两种抗原都有效。12. 4.双重靶向的抗-VEGF/ 抗-ILlRl mAbdAb 的大鼠 PK在大鼠中检测该分子的体内药代动力学特性。静脉内给予三只大鼠抗-ILlRl/ 抗-VEGF dAb-延伸的IgG A，经7天(168小时)时间采集血清样品。通过针对ILlRl及 VEGF两者的ELISA评估给药后不同时间点残留的药物浓度。结果示于图127中。PK参数示于表17. 3中。表 17. 3 实施例1313. 1.产生三重靶向的抗-TNF/ 抗-VEGF/ 抗-EGFR mAbdAb用标准分子生物学技术并按照在dAb和两种链的恒定区之间插入mAb V结构域编 码区的策略，构建三重靶向的mAb。对于轻链，先前已将抗-EGFR dAb D0M16_39_542克隆到含SalI和BsiWI位点的 表达盒(图15)，以产生dAb-Ck链。为了制备mAbdAb轻链，通过PCR用两端编码BsiWI的 引物扩增mAb VL区。用BsiWI消化含有dAb_Ck表达盒的质粒。让经BsiWI消化的mAb VL 结构域与其连接，以产生mAbdAb轻链，导致产生在两个可变结构域之间的“TVAAPS”接头。按照同样的策略产生mAbdAb重链，其中将PCR扩增的含NheI端的mAb VH区连接 到经NheI消化的dAb重链载体，在dAb (D0M15-26)和CHl之间(图60)，导致产生在两个可 变结构域之间的接头“ASTKGPS”。选择已验证序列的克隆(SEQ ID NO 78和79分别为重链和轻链)，按照制造商方 案用Qiagen Mega Prep试剂盒大规模制备DNA制备物。通过用瞬时转染技术共转染轻链和重链在哺乳动物细胞中表达mAbdAb。13. 2.三重靶向的抗-TNF/抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb的纯化按照已确定的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液中纯化抗-TNF/ 抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度测量值确定纯化 样品的浓度。经纯化的样品的SDS-PAGE分析(图61)显示未经还原的样品泳动到190kDa， 而经还原的样品显示为泳动到35和60kDa的两条带，其分别对应于dAb-延伸的轻链和重 链。13. 3.三重靶向的抗-TNF/抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb的结合亲和力分别如方法12、13和14所述测定对VEGF、EGFR和TNF的结合亲和力。用GraphPad Prism分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。该mAbdAb 的抗-VEGF效价(图62)计算为1. 885mM,而对照抗-VEGF mAb给出的EC50值为0. 145nM。在抗-TNF生物测定(图636)中效价为87pM，而抗-TNF对照mAb产生的EC50为 104pM。在抗-EGFR测定(图64)中，三重靶向mAbdAb在约300nM下产生约20%抑制。同 时计算VEGF和TNF结合的EC50值，对于EGFR结合，没有产生用于计算EC50值的连续曲线 (fullcurve)。实施例14 :IGF-1R/VEGF mAbdAb14. 1. IGF-1R/VEGF mAbdAb 的构津从重叠寡核苷酸的PCR从头开始构建抗IGF-IR可变重链和可变轻链基因序列。 用标准分子生物学技术在哺乳动物表达载体中将这些区域融合到人IgGl或κ恒定区。同 样用重叠寡核苷酸的PCR构建抗VEGF结构域抗体的基因序列，并如上所述将其融合到抗 IGF-IR组分的重链或轻链基因的3’端。融合体在抗体与结构域抗体组分之间并入了两个 氨基酸(GS)的接头或8个氨基酸(TVAAPSGS)的接头。此外，构建不含结构域抗体和接头 序列的抗体重链和轻链。按照制造商方案用Endofree Qiagen Maxipr印试剂盒选择已验 证序列的克隆用于大规模DNA制备。在序列SEQ ID NO :108、109、111和112中，在抗体和结构域抗体之间的接头序列 位置下划线。可通过除掉全部接头或通过用不同的接头，构建备选变体。在SEQ ID NO 6 和8-11中提供其它合适的接头实例。表18提供一系列经构建并表达的抗体。表18-经构建并检测的抗体
87 实施例14. 2 :IGF-1R/VEGF mAbdAb的表达、纯化和SEC曲线在瞬时转染的HEK293-6E中表达重链和轻链载体组合。简言之，用先前与 293fectin试剂(Invitrogen#51-0031)孵育的25 μ g重链和25 μ g轻链质粒，转染50ml的 1.5xl06个细胞/ml的HEK293-6E细胞。将细胞置于37°C、5% CO2和95%相对湿度的震荡 培养箱中。24小时后，加入蛋白胨养料培养基(feeding media)，让细胞再生长72小时。离 心收获上清液，接着用0. 22 μ m过滤器过滤。用蛋白A琼脂糖柱纯化表达的蛋白质，并透析 到PBS中。通过大小排阻色谱(SEC)分析纯化的蛋白质，示于图65中。在以下测定中用IGF-IR抗体(HOLO)作为比较物。该分子具有SEQID NO 110中 所述的重链序列和SEQ ID NO: 113中所述的轻链序列。在以下测定中将另一具有不相关特异性的mAbdAb用作比较物。该分子具有SEQ ID NO 87中所述的重链序列和SEQ ID NO 13中所述的轻链序列，并被命名为BPC1601。实施例14. 3 IGF-IR 结合 ELISA进行结合ELISA以检测纯化的抗-IGF-1R/VEGF mAbdAb与IGF-1R的结合。简言 之，将 400ng/ml 重组人 IGF_lR_his 标签(R&DSystems 305-GR)的 PBS 溶液装到用 1 μ g/ ml抗-聚组氨酸(AbCamAB9108)包被并用封闭液(在Tris缓冲的盐水中的4% BSA)封 闭的ELISA板中。在用TBS+0.05% Tween 20 (TBST)洗涤前让板于室温孵育1小时。加入 在封闭液中稀释的各种浓度的纯化的mAbdAb以及抗IGF-IR单克隆抗体(HOLO)和不相关 的mAbdAb (BPC1601)。在用TBST洗涤前让板于室温孵育1小时。通过加入在封闭液中以 1/1000稀释的过氧化物酶标记的抗人κ轻链抗体(Sigma A7164)来检测结合。在用TBST 洗涤前让板于室温孵育1小时。通过加入OPD底物(Sigma P9187)使板显色，通过加入3M
88H2SO4终止显色。在490nm处用板读数器测量吸光度，作图确定平均吸光度。结合ELISA的结果提供在图66中，其确证所检测的所有IGF1R-VEGF mAbdAb 变体(BPC1603-1606)都显示以可比得上抗-IGF-IR抗体HOLO的水平与IGF-IR结 合。用 Cambridgesoft Bioassay 软件计算 EC50 值，结果如下H0L0 (0. 1797 μ g/ ml))、BPC1603 (0. 1602 μ g/ml)、BPC1604 (0. 1160 μ g/ml)、BPC1605 (0. 1975 μ g/ml)、 BPC1606(0. 1403 μ g/ml)。不相关的对照双特异性抗体BPC1601显示对IGF-IR没有可检测 的结合。实施例14. 4 :VEGF 结合 ELISA进行结合ELISA以检测经纯化的抗-IGF-1R/VEGF双特异性抗体与VEGF的结合。 用PBS中的400ng/ml重组人VEGF(GSK)包被并用封闭液(TBS中的4% BSA)封闭ELISA 板。加入在封闭液中稀释的各种浓度的纯化的mAbdAb，包括mAbdAb BPCI601作为阴性对 照。在用TBST洗涤前让板于室温孵育1小时。通过加入在封闭液中以1/1000稀释的过氧 化物酶标记的抗人κ轻链抗体(Sigma A7164)来检测结合。在用TBST洗涤前让板于室温 孵育40分钟。通过加入OPD底物(Sigma P9187)使板显色，通过加入3M H2SO4终止显色。 在490nm处用板读数器测量吸光度，作图确定平均吸光度。结合ELISA的结果提供在图67中，其确证所有四种抗-IGF-1R/VEGF mAbdAb (BPC1603-1606)都可结合固定化VEGF。BPC1605和BPC1606显然更低的结合活性 可归因于结构域抗体(位于轻链的C-末端)与检测抗体之间的干扰。用Cambridgesoft Bioassay 软件计算 EC50 值，结果如下BPC1603 (0. 044 μ g/ml)、BPC1604 (0· 059 μ g/ ml)、BPC1605(0. 571 μ g/ml)。由于较低的响应值而不可能计算BPC1606的精确EC50值。 抗-IGF-IR抗体HOLO和不相关的对照mAbdAb BPC1601显示对VEGF没有可检测的结合。实施例14. 5 与VEGF结合的动力学通过伯胺偶联到CM5生物感受器芯片来固定针对人IgG的小鼠单克隆抗体 (Biacore BR-1008-39)。用该表面来捕获抗体构建体。在捕获后，使VEGF通过表面后，然后 用3M MgCl2使所述表面再生。用于产生动力学的VEGF浓度为256、64、16、4、1和0.25碰， 且仅将缓冲液注入捕获表面上用于双重参考(double referencing) 0用IxHBS-EP缓冲液 (BR-1006-69)于25°C在Biacore TlOO设备上进行实验。用其分析软件将数据拟合到设备 固有的1 1模型。来自两个独立实验的数据示于表19中。表19-结合人VEGF的动力学 实施例14. 6 =VEGF与警体结合的抑制如方法12所述用VEGF受体结合测定测量mAbdAb活性。在该测定中获得的抑制 VEGF与VEGFR2结合的IC50为BPC1603 (0. 037nM)BPC1604(0. OlOnM)BPC1605 (0. 167nM)BPC1606(0. 431nM)这些结果确证所有四种抗原结合构建体抑制配体结合受体。实施例14. 7 =IGF-IR受体磷酸化的抑制将3T3/LISN c4细胞以10000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并在完全 DMEM(DMEM-H印es改良+10% FCS)中孵育过夜。将纯化的mAbdAb加到细胞中并孵育1小时。 将rhIGF-Ι加到处理的细胞中以达到50ng/ml的终浓度，并再孵育30分钟以刺激受体磷酸 化。吸出培养基，然后通过加入RIPA裂解缓冲液(150mM NaCl、50mMTrisHCl、6mM脱氧胆酸 钠、Tween 20)加上蛋白酶抑制剂混合物(Roche 11 697 498 001)来裂解细胞。过夜冷 冻所述板。解冻后将各孔的裂解液转移到用2 μ g/ml抗IGF-IR捕获抗体2B9 (GSK)预先包 被并用封闭液4%BSA/TBS封闭的96孔ELISA板。用TBST(TBS+0. 1% Tween 20)洗涤板，将 用4% BSA/TBS以1/2500稀释的铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体(PerkinElmer DELFIA Eu-Nl PT66)加入到各孔中。孵育1小时后洗涤板，加入DELFIA增强(PerkinElmer 1244-105)溶 液。孵育10分钟后，用板读数器装置测定受体磷酸化水平以测量铕时间分辨荧光(TRF)。实验结果提供在图68和69中。结果确证mAbdAb BPC1603-1606可以以比得上 抗-IGF-IR单克隆抗体HOLO的水平抑制IGF-I介导的受体磷酸化。在该测定中不相关抗 体(标记为IgGl, Sigma 15154)显示无活性。实施例15抗-⑶20/IL-13抗原结合蛋白实施例15. 1 分子生物学用基于PCR的方法和标准分子生物学技术从头构建编码SEQ IDNO :117和120中 所述的抗-⑶20mAb的重链和轻链序列的哺乳动物表达载体。通过将编码抗-⑶20mAb重链 和轻链可变区的序列克隆到含有融合到抗-人IL-13结构域抗体(D0M10-53-474)的人抗 体恒定区的哺乳动物表达载体，来构建双特异性抗-⑶20mAb-抗-IL13dAb重链和轻链。
将mAbdAb表达构建体转染到CHOEla细胞。收获上清液，然后用固定化的蛋白A 纯化抗体，通过读取280nm处的吸光度来定量。已构建并检测的mAbdAb (和抗-⑶20对照 mAb)列于表20中。表 20 实施例15. 2 与人IL-13结合的动力学通过BIAcore 分析评估mAbdAb构建体对人IL-13的结合亲和力。进行抗-人IgG 捕获分析。简言之，通过伯胺偶联将抗-人IgG(Biacore BR-1008-39)偶联到CM5芯片上。 然后将mAbdAb构建体捕获到该表面。以限定浓度使人IL-13(由GSK制备并纯化)通过。 用3MMgCl2使该表面再生回抗人IgG表面。该处理不显著影响捕获抗体对随后的IL-13结 合事件的能力。用HBS-EP缓冲液在25°C于BIACore T100设备上进行运作。用设备中的评 估软件分析数据，并拟合成1 1结合模型。分析结果提供在表48中，其确证所有mAbdAb 构建体结合IL-13的动力学都相当。表48-表面等离子共振(BIAcore )数据
91
通过流式细胞术用⑶20阳性细胞系(Weinl33)评估mAb_dAb与⑶20的结合。所有 mAb-dAb (BPC1401-BPC1404)和抗-⑶20对照抗体显示平均荧光强度剂量依赖性增加(MFI) (数据未显示)实施例15. 3 用抗-CD20/IL-13双特异件抗体讲行ADCC测定ADCC测定基于Boyd等(1995) J. Imm. Meth. 184 :29_38公开的方法。简言之，用 铕如下标记Raji细胞(靶标)。收获细胞，计数，并在15ml falcon试管中制备为终密度 lxlO7，用 H印es 缓冲液(50mMHEPES、83mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2. Η20、ρΗ7· 4)洗涤一次。 沉淀细胞，将Iml冰冷的铕标记的缓冲液(HEPES缓冲液加600 μ MEuCl3、3mM DTPA和25mg/ ml硫酸葡聚糖)加入到各管中。在标记开始猛烈弹击细胞悬浮液，然后在冰上孵育的30 分钟期间每10分钟弹击一次。加入IOml冰冷的修复缓冲液(含有294mg/l CaCl2. 2H20、 1. 8g/lD-葡萄糖、pH7. 4的!fepes缓冲液)，细胞在冰上再孵育10分钟。然后离心细胞，滗 出上清液，用修复缓冲液洗涤2次，然后用完全培养基洗涤一次。然后计数标记的细胞，以 2xl05细胞/ml重新悬浮在无血清培养基中，并储存在冰上。如下制备人纯化的血单核细胞(PBMC或效应细胞)。以2000rpm将150ml全血离 心10分钟以除掉血清。用PBS(InvitrOgen/GibCO，#14190)将细胞稀释到原始体积的2倍。 通过加 15ml 淋巴细胞分离剂(lymphopr印)(Axis shield, #NYC1114547)制备 Accuspin 密 度梯度管(Sigma，#A2055-10EA)，以1500rpm离心1分钟。将25ml血混悬液加入到密度梯 度管，以2500rpm离心20分钟，让离心机慢慢减速。弃掉IOml顶部上清液。将剩余物(包 括“淡黄色”层)倒入干净试管中，用PBS加满，以1500rpm离心5分钟。弃掉上清液，合并 细胞沉淀，用RPMI培养基洗涤一次，重新离心并计数。在无血清RPMI培养基中以5xl06/ml 制备效应细胞。在96孔圆底板(Nunc 96 maxisorb板，#735-0199)中如下设定测定板。在无血 清RPMI培养基中以大约12 μ g/ml的起始浓度制备抗体稀释液，甚至进一步3倍稀释。以 下进行板布置，将50 μ 1抗体样品加入合适的孔(仅B-G排)中，使每个稀释度进行6个重 复。将50 μ 1 RPMI培养基加入A和H排的所有孔中。将50 μ 1的RPMI培养基加入到培养 基标记的板的所有孔中。将在RPMI培养基中稀释到4 μ g/ml (1 μ g/ml终浓度，GSK内部材 料)的50μ1重组人IL-13加入到+IL13标记的板的所有孔中。所有板在4°C孵育最少30 分钟。将50 μ 1铕标记的靶标细胞加入到所有板。将20 μ 1的IOX triton加入到所有板H排的所有孔中。让板在4°C孵育最少30分钟。将50μ1 RPMI培养基加入到仅标记靶标的 列的所有孔中。将50μ1 PBMC加入到标记的效应器靴标为25 1比率的列的所有孔中。 让板以1500rpm离心3分钟，并37°C孵育3-4小时。将200 μ 1的增强液(ffallac/Perkin Elmer，货号1244-105)加入到nunc免疫吸附ELISA板(一个ELISA板对应每一个测定板) 的各孔中。将20 μ 1上清液从测定板转移到ELISA板。让ELISA板于室温在板振荡器上孵 育最少30分钟，或储存在4°C过夜。用时间滞后荧光测定法(time-delayed fluorimetry) (Wallac Victor板读数器)测量铕释放。自发裂解=只从细胞和培养基中释放的铕的测量 值。最大裂解=通过加入Triton-XlOO (非离子去污剂)靶标细胞的非特异性裂解。
效应器靶标靶标效应器靶标靶标 在两个单独的时机用两种不同的供体PBMC进行ADCC测定。来自一个代表性测定 的结果提供在图70和71中。另外，在单独的时机用不同的供体PBMC进行使用较窄剂量范 围的相似的ADCC测定。将来自该测定的结果示于图72和73中。实施例15. 4 用抗-⑶20/IL-13双特异性抗体进行⑶C测定用铕如下标记TOIN细胞(靶标)。简言之，收获细胞，计数，并在15ml falcon试 管中制备为终密度 lxio7，用 Ifepes 缓冲液(50mMHEPES、83mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2. H20、pH7.4)洗涤一次。沉淀细胞，将Iml冰冷的铕标记的缓冲液(HEPES缓冲液加上 600yMEuCl3>3mM DTPA和25mg/ml硫酸葡聚糖)加入到各管中。在标记开始猛烈弹击细胞 悬浮液，然后在冰上孵育的30分钟期间每10分钟弹击一次。加入IOml冰冷的修复缓冲液 (含有294mg/l CaCl2. 2H20、1. 8g/lD_葡萄糖、pH7. 4的H印es缓冲液)，细胞在冰上再孵育 10分钟。然后离心细胞，滗出上清液，用修复缓冲液洗涤2次，然后用完全培养基洗涤一次。 然后计数标记的细胞，以2xl05细胞/ml重新悬浮在无血清培养基中，并储存在冰上。通过离心从采集自内部供体的全血中移走血清。让一半样品在56°C热处理30分 钟灭活。在无血清RPMI培养基中以大约12μ g/ml的起始浓度稀释抗体，进行5次3倍稀 释。将50μ 1抗体样品加入到仅B-G排的合适的孔(按照以下所述的板布置)中。将50μ 1 RPMI培养基加入到1-6列的所有孔中。在必要时将50 μ 1的重组人IL-13 (以在RPMI培养 基中4yg/ml)加入到第7-12列的各孔中。让板在4°C孵育最少30分钟。将50 μ 1铕标记
93的靶标细胞加入到所有板，并让板在4°C孵育最少30分钟。将50 μ 1血清(活性或热灭活) 加入到合适的孔(参见以下板布置)中。让板在37°C培养箱中孵育2-3小时，之后将所述板 以 1500印111离心3分钟。将200口 1 的增强液(ffallac/Perkin Elmer, Catalogue#1244-105) 加入到nunc免疫吸附ELISA板(一个ELISA板对应每一个测定板)的各孔中。将20 μ 1 上清液从测定板转移到ELISA板。让ELISA板于室温在板振荡器上孵育最少30分钟，或储 存在4°C过夜。用时间滞后荧光测定法(Wallac Victor板读数器)测量铕释放。自发裂解 =只从细胞和培养基中释放的铕的测量值。最大裂解=通过加入Triton-XlOO (非离子去
污剂)使靶标细胞非特异性裂解。
在三个单独的时机用三种不同的供体血清进行CDC测定。来自一个代表性测定的 结果提供在图74和75中，并显示抗体样品的⑶C活性比得上无IL-13时的⑶C活性。在 过量IL-13存在下，抗体样品BPC1401和BPC1402 (融合到重链的结构域抗体)的⑶C活性 降低了，而BPC1403和BPC1404 (融合到轻链的结构域抗体)的⑶C活性并没有受IL-13存 在的较大影响。实施例1616. 1包含由备诛骨架組成的表位结合结构域的抗JC结合g白的设i十i^勾建将以下列出的5种备选骨架与单克隆抗体联合以提供mAb-备选骨架双特异性分 子 抗VEGF泪液脂质运载蛋白(TLPC) 抗 HER2 Affibody (AFFI) 抗 HER2 DARPin (DRPN) 抗鸡蛋白溶菌酶(NARV)·抗-RNA 酶 A 骆驼 VHH将TLPC(其进一步的资料参见US2007/0224633)、AFFI (其进一步的资料参见
94W02005003156A1)、DRPN(其进一步的资料参见 Zahnd，C.等(2007)、J. Mol. Biol.，369， 1015-1028)和NARV(其进一步的资料参见US20050043519A)的蛋白序列逆翻译为DNA并优 化密码子。在这4种备选骨架的每一种中包括在N-末端处的BamHI位点和在C-末端处的 EcoRl位点，以方便克隆。用基于PCR的策略和重叠寡核苷酸从头构建编码这四种备选骨架DNA序列的DNA 片段。将TLPC, AFFI和DRPN PCR产物克隆到含有HOLO重链(抗-hlGF-lR抗体)的哺乳 动物表达载体。得到的DNA序列编码经由TVAAPSGS接头或GS接头融合到重链的C-末端 的备选骨架。将NAR V PCR产物克隆到含有编码帕考珠单抗(抗-IL-4抗体)重链的DNA 的哺乳动物表达载体。得到的DNA序列编码经由GS接头融合到重链的C-末端的NAR V。通过PCR修饰抗-RNA酶A骆驼VHH DNA序列，以在5’端包括BamHI位点并在3’ 端包括EcoRl位点便于克隆。将PCR产物克隆到含有帕考珠单抗(抗-IL-4抗体)重链的 哺乳动物表达载体。得到的DNA序列编码经由GS接头融合到重链的C-末端的骆驼VHH。以下表21概述了业已构建的抗原结合蛋白。表 21 用293fectin(Invitrogen，12347019)将表21中所述的编码抗原结合蛋白的重链 和轻链表达质粒瞬时共转染到HEK 293-6E细胞。在同一天或第二天将蛋白胨养料加入到 各细胞培养物中，在初始转染约2-6天后收获上清液物质。用蛋白A柱纯化来自上清液的 抗原结合蛋白，然后在结合测定中进行检测。16. 2 :rhIGF-lR 结合 ELISA用1 μ g/ml抗-his-标签抗体(Abcam，ab9108)的PBS溶液包被96孔高结合板， 并在4°C储存过夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。将200 μ L 封闭液(5% BSA/DPBS缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后再进行 另一洗涤步骤。将0. 4yg/mL的rhIGF-lR(R&D Systems)以每孔50 μ L加入到各孔中。让 板在室温孵育1小时，然后洗涤。用封闭液在板中对纯化的抗原结合蛋白质/抗体进行连续稀释。1小时孵育后，洗涤板。用封闭液将山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗 体稀释到1 μ g/mL，将50 μ L加入到各孔中。让板孵育1小时。在进行另一个洗涤步骤后， 将50 μ 1的OPD (邻苯二胺二盐酸盐)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分钟后通过 加入25 μ L的3Μ硫酸终止反应。在490nm处用VersaMaxTunable微板读数器(Molecular Devices)用碱性终点方案读取吸光度。图76、78和80显示ELISA结果，并确证抗原结合蛋白BPC1803-BPC1808结合重 组人IGF-1R。还显示抗-IGF-IR单克隆抗体HOLO结合重组人IGF-1R，然而阴性对照抗体 (sigma 15154)显示不结合 IGF-IR016. 3 :VEGF 结合 ELISA用0. 4 μ g/ml的hVEGF165 (R&D Systems)包被96孔高结合板，并在+4°C孵育过 夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。将200 μ L封闭液(5% BSA/ DPBS缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后进行另一个洗涤步骤。用 封闭液在板中对纯化的抗原结合蛋白质/抗体进行连续稀释。1小时孵育后，洗涤板。用 封闭液将山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体稀释到1 μ g/mL，将50 μ L加入到 各孔中。让板孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，将50μ1的OPD(邻苯二胺二盐酸盐) SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸终止反应。在490nm 处用VersaMax Tunable微板读数器(Molecular Devices)用碱性终点方案读取吸光度。图77显示VEGF结合ELISA结果，并确证双特异性抗体BPC1803和BPC1804结合 人VEGF。在该测定中抗VEGF双特异性抗体(BPC1603)用作阳性对照，显示结合VEGF。与 此相反，显示抗-IGF-IR单克隆抗体HOLO不结合人VEGF。16. 4 :HER2 结合 ELISA用1 μ g/ml的HER2(R&D Systems)包被96孔高结合板，并在+4°C孵育过夜。用 含0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。将200 μ L封闭液(5% BSA/DPBS 缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后再进行一次洗涤。用封闭液在 板中对纯化的抗原结合蛋白质/抗体进行连续稀释。1小时孵育后，洗涤板。用封闭液将 山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体稀释到1 μ g/mL，将50 μ L加入到各孔中。 让板孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，将50μ 1的OPD (邻苯二胺二盐酸盐)SigmaFast 底物溶液加入到各孔中，15分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸终止反应。在490nm处用 VersaMaxTunable微板读数器(Molecular Devices)用碱性终点方案读取吸光度。图79和80显示HER结合ELISA结果，并确证抗原结合蛋白BPC1805、BPC1806、 BPC1807和BPC1808结合重组人HER2。在该测定中赫赛汀(Here印tin)用作阳性对照，显 示结合HER2。与此相反，显示抗-IGF-IR单克隆抗体HOLO不结合人HER2。16. 5 :IL~4 结合 ELISA用5μ g/ml人IL-4的PBS溶液包被96孔高结合板，并在4°C储存过夜。用含 0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。将200 μ L封闭液(5% BSA/DPBS缓 冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后进行另一个洗涤步骤。用封闭液 在板中对纯化的抗原结合蛋白质/抗体进行连续稀释。1小时孵育后，洗涤板。用封闭液将 山羊抗-人K轻链特异性过氧化物酶缀合抗体(Sigma，A7164)稀释到1 μ g/mL，将50 μ L 加入到各孔中。让板孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，将50μ1的OPD (邻苯二胺二盐酸盐)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸终止反应。在 490nm处用VersaMax Tunable微板读数器(Molecular Devices)用碱性终点方案读取吸光度。图82显示ELISA结果，并确证抗原结合蛋白BPC1809以可比得上抗IL-4单克隆 抗体帕考珠单抗的水平结合人IL-4。显示阴性对照抗体(Sigma 15154)不结合IL-4。图84显示ELISA结果，并确证抗原结合蛋白BPC1816以可比得上抗IL_4单克隆 抗体帕考珠单抗的水平结合人IL-4。显示阴性对照抗体(Sigma 15154)不结合IL-4。16. 6 :RNA 酶 A 结合 ELISA将业已用PBS稀释的 50uL 的 lug/mL RNA酶A(Qiagen，19101)加入到 96 孔Costar 板的各孔中。让板在室温孵育2小时，然后用PBST洗涤板，之后将200uL的4% BSA/PBS的 封闭液加入到各孔中。让板孵育1小时，并在加入样品前洗涤。以2ug/mL的浓度将纯化的 抗体和抗原结合蛋白BPC1809加入到第1列的孔中，然后以1 2用封闭液对板进行系列 稀释。让板孵育1小时然后洗涤。加入50yL用封闭液以1 1000稀释的山羊抗-人κ 轻链特异性过氧化物酶缀合抗体(Sigma，A7164)。让板孵育1小时然后洗涤。将50 μ 1的 OPD加入到各孔中，在15-30分钟后用3Μ硫酸终止反应。在490nm处用VersaMax Tunable 微板读数器(Molecular Devices)用碱性终点方案读取吸光度。图83显示RNA酶A结合ELISA的结果，并确证纯化的人单克隆抗体_骆驼VHH双 特异性抗体BPC1809显示结合RNA酶A。与此相反，显示IL-4单克隆抗体帕考珠单抗和阴 性对照(sigma 15154) 二者都不结合RNA酶A。16. 7 :HEL 结合 ELISA用5 μ g/ml的HEL (鸡蛋溶菌酶，Sigma L6876)的PBS溶液包被96孔高结合板， 并在4°C储存过夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。将200 μ L 封闭液(5% BSA/DPBS缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后进行另一 个洗涤步骤。用封闭液在板中对纯化的抗体进行连续稀释。1小时孵育后，洗涤板。用封 闭液将山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体(Sigma，A7164)稀释到lyg/mL，将 50 μ L加入到各孔中。让板孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，将50μ1的OPD (邻苯二胺 二盐酸盐)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸终止反 应。在490nm处用VersaMax Tunable微板读数器(Molecular Devices)用碱性终点方案 读取吸光度。图85显示HEL结合ELISA的结果，并确证纯化的人单克隆抗体-NAR V双特异性 抗体BPC1816结合HEL。与此相反，显示IL-4单克隆抗体帕考珠单抗不结合HEL。实施例1717. 1包含由adnectin组成的表位结合结构域的抗原结合蛋白的设计与构建CTOl adnectin对VEGFR2(进一步资料参见W02005/056764)具有特异性。将CTOl adnectin蛋白序列逆翻译为DNA并优化密码子。包括N-末端的BamHI位点和C-末端的 EcoRl位点以便于克隆。用基于PCR的策略和重叠寡核苷酸从头构建编码最终CTOl DNA序列的DNA片段。 将PCR产物克隆到含有HOLO重链(抗-hIGF-lR抗体)的哺乳动物表达载体，使得经由GS 接头或TVAAPSGS接头将adnectin融合到重链的C-末端。IGF-1R-VEGFR2双特异性的重链和轻链的蛋白序列示于SEQ ID NO 124、113和133中。将编码抗-TNF-αadnectin(进一步资料参见 US20080139791)的另一 adnectin 蛋白序列逆翻译为DNA，优化密码子，并在用前述重叠寡核苷酸PCR方法构建之前修饰为包 括末端BamHI和EcoRl位点。将PCR产物克隆到含有编码帕考珠单抗(抗-IL-4抗体)重链 的DNA的哺乳动物表达载体，使得经由GS接头或TVAAPSGS接头将编码抗-TNF- α adnectin 的DNA融合到重链C-末端。IL-4-TNF-a双特异性重链和轻链的蛋白序列示于SEQ ID NO: 146、147 和 15 中。还设计了利用在IL-13单克隆抗体重链C-末端处融合的TNF-α特异性adnectin 的抗原结合蛋白。蛋白序列实例示于SEQ ID 134、13和135中。另外，业已设计基于在 抗-EGFR抗体爱必妥和IMC-11F8的重链或轻链的C-末端或N-末端处融合CTOl的双特异 性分子。已设计的蛋白序列的实例示于SEQ ID N0:136-145中。在这些实例序列中，很多已被构建。已构建了编码SEQ ID NO 136(融合到爱必妥 重链的C-末端上的CT01)、SEQ ID NO 144 (融合到爱必妥重链N-末端上的CT01)和SEQ ID NO 138 (融合到爱必妥轻链C-末端上的CT01)的DNA序列。已用基于PCR的克隆方法 构建所有这三种序列，并将其克隆到哺乳动物表达载体。下表22是已被设计和/或构建的 抗原结合蛋白的概述。表 22
99 用293fectin(Invitrogen，12347019)将编码 BPC1801、BPC1802、BPC1822、 BPC1823、BPC1812、BPC1813和BPC1818的重链和轻链表达质粒瞬时共转染到HEK 293-6E 细胞。在同一天或第二天将蛋白胨养料加入到各孔细胞培养物中，在初始转染约2-6天后 收获上清液物质。在某些情况下，在结合测定中用上清液材料作为测试物。在其它情况下， 用蛋白A柱纯化抗原结合蛋白，然后在结合测定中进行检测。17. 2 :rhIGF-lR 结合 ELISA用1 μ g/ml抗-his-标签抗体(Abcam，ab9108)的PBS溶液包被96孔高结合板， 并在4°C储存过夜。用含0. 05% Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。将200 μ L封 闭液(5% BSA/DPBS缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后进行另一个 洗涤步骤。将0. 4yg/mL的rhIGF-lR(R&D Systems)以每孔50 μ L加入到各孔中。让板在 室温孵育1小时，然后洗涤。用封闭液在板中对纯化的抗原结合蛋白质/抗体进行连续稀 释。1小时孵育后，洗涤板。用封闭液将山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体稀 释到1 μ g/mL，将50 μ L加入到各孔中。让板孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，将50 μ 1 的OPD (邻苯二胺二盐酸盐)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分钟后通过加入25 μ L 的3Μ硫酸终止反应。在490nm处用VersaMax Tunable微板读数器(Molecular Devices) 用碱性终点方案读取吸光度。图86显示IGF-IR结合ELISA的结果，并确证纯化的人单克隆抗体-adnectin双 特异性抗体(BPC1801和BPC 1802)以可比得上抗-IGF-IR单克隆抗体HOLO的水平结合重 组人IGF-IR0显示阴性对照抗体(Sigma 15154)不结合IGF-IR017. 3 :VEGFR2 结合 ELISA用0. 4 μ g/ml的VEGFR2 (R&D Systems)包被96孔高结合板，并在+4°C孵育过夜。 用含0. 05 %的Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。将200 μ L封闭液(5 % BSA/ DPBS缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后进行另一个洗涤步骤。用封闭液在板中对上清液或经纯化的抗体进行连续稀释。1小时孵育后，洗涤板。用封闭液将 山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体稀释到1 μ g/mL，将50 μ L加入到各孔中。 让板孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，将50μ 1的OPD (邻苯二胺二盐酸盐)SigmaFast 底物溶液加入到各孔中，15分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸终止反应。在490nm处用 VersaMaxTunable微板读数器(Molecular Devices)用碱性终点方案读取吸光度。图87显示VEGFR2结合ELISA的结果，并确证纯化的人单克隆抗体-adnectin双 特异性抗体(BPC1801和BPC1802)结合重组人VEGFR2。与此相反，显示抗-IGF-IR单克隆 抗体HOLO不结合人VEGFR2。图172显示VEGFR2结合ELISA的结果，并确证抗原结合蛋白BPC1818和BPC1813 结合重组人VEGFR2。与此相反，显示爱必妥不结合人VEGFR2。对于抗原结合蛋白BPC1813 和BPC1818而言，上清液中的抗体的量不能被定量，因此图172提供的数据表示为净上清液 材料稀释倍数。对于爱必妥而言，在测定中以2 μ g/ml的起始浓度使用纯化的材料，该起始 浓度相当于图172中的稀释倍数1。图175显示VEGFR2结合ELISA的结果，并确证抗原结合蛋白BPC1812结合重组人 VEGFR2。与此相反，显示爱必妥和阴性对照Sigma IgG 15154抗体不结合人VEGFR2。对于 抗原结合蛋白BPC1812而言，上清液中的抗体的量不能被定量，因此图175提供的数据表示 为净上清液材料稀释倍数。对于爱必妥和Sigma IgG 15154而言，在测定中以2 μ g/ml的 起始浓度使用纯化的材料，该起始浓度相当于图175中的稀释倍数1。17. 4 :IL~4 结合 ELISA用5μ g/ml人IL_4的PBS溶液包被96孔高结合板，并在4°C储存过夜。用含 0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。将200 μ L封闭液(5% BSA/DPBS缓 冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后进行另一个洗涤步骤。用封闭液 在板中对上清液或纯化的抗体/抗原结合蛋白进行连续稀释。1小时孵育后，洗涤板。用 封闭液将山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体稀释到1 μ g/mL，将50 μ L加入到 各孔中。让板孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，将50μ1的OPD(邻苯二胺二盐酸盐) SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸终止反应。在490nm 处用VersaMaxTunable微板读数器(Molecular Devices)用碱性终点方案读取吸光度。图88显示IL-4结合ELISA的结果，并确证人单克隆抗体-adnectin双特异性抗 体(BPC1823和BPC 1822)结合重组人IL-4。显示阳性对照抗-IL-4单克隆抗体帕考珠单 抗结合IL-4，显示阴性对照抗体(SigmaI5154)不结合IL-4。在本实验中重复HEK转染以获得具有较高抗体浓度的上清液材料。图88b显示通 过ELISA测定的该较高浓度的上清液人单克隆抗体-adnectin双特异性抗体(BPC1823)与 人IL-4的结合。对于抗原结合蛋白BPC1823和BPC1822而言，上清液中的抗体的量不能被定量，因 此图88和88b提供的数据表示为净上清液材料稀释倍数。对于帕考珠单抗和阴性对照抗 体(Sigma 15154)而言，在测定中以1 μ g/ml的起始浓度使用纯化的材料，该起始浓度相当 于图88和88b中的稀释倍数1。17. 5:TNF-α 结合 ELISA用0. 4 μ g/ml 重组人 TNF α (RnD Systems 210-TA-050/CF)的 PBS 溶液包被 96 孔高结合板，并在4°C储存过夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。 将200 μ L封闭液(5% BSA/DPBS缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然 后进行另一个洗涤步骤。用封闭液在板中对上清液或纯化的抗体进行连续稀释。1小时孵 育后，洗涤板。用封闭液将山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体(Sigma，A7164) 稀释到1 μ g/mL，将50 μ L加入到各孔中。让板孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，将50 μ 1 的OPD (邻苯二胺二盐酸盐)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，15分钟后通过加入25 μ L 的3Μ硫酸终止反应。在490nm处用VersaMax Tunable微板读数器(MolecularDeviees) 用碱性终点方案读取吸光度。图89显示TNF- α结合ELISA的结果，并确证人单克隆抗体-adneetin双特异性 抗体(BPC1823和BPC1822)结合重组人TNF- α。与此相反，显示抗-IL-4单克隆抗体帕考 珠单抗不结合重组人TNF- α。在本实验中重复HEK转染以获得具有较高抗体浓度的上清液材料。图89b显示通 过ELISA测定的该较高浓度的上清液人单克隆抗体-adneetin双特异性抗体(BPC1823)与 重组人TNF α的结合。显示IgG对照不结合重组人TNF- α。对于抗原结合蛋白BPC1822和BPC1823而言，上清液中的抗体的量不能被定量，因 此图89和89b提供的数据表示为净上清液材料稀释倍数。对于帕考珠单抗而言，在测定中 以1 μ g/ml的起始浓度使用纯化的材料，该起始浓度相当于图89和89b中的稀释倍数1。17. 6 :EGFR 结合 ELISA用0. 67 μ g/ml重组人EGFR蛋白的PBS溶液包被96孔高结合板，并在4°C储存过 夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水洗涤板2次。将200 μ L封闭液(5% BSA/ DPBS缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后进行另一个洗涤步骤。用 封闭液在板中对抗原结合蛋白质/抗体进行连续稀释。1小时孵育后，洗涤板。用封闭液将 山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体(Sigma，A7164)稀释到1 μ g/mL，将50 μ L 加入到各孔中。让板孵育1小时。在另一个洗涤步骤后，将50μ1的OPD (邻苯二胺二盐酸 盐)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，25分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸终止反应。在 490nm处用VersaMax Tunable微板读数器(Molecular Devices)用碱性终点方案读取吸光 度。图171显示EGFR结合ELISA的结果，并确证双特异性抗体BPC1818和BPC1813结 合重组人EGFR。还显示阳性对照抗体爱必妥结合重组人EGFR。与此相反，显示Sigma IgG 15154不结合重组人EGFR。对于双特异性抗体BPC1813和BPC1818而言，上清液中的抗体 的量不能被定量，因此图171提供的数据表示为净上清液材料稀释倍数。对于爱必妥和阴 性对照抗体(Sigma 15154)而言，在测定中分别以2 μ g/ml和1 μ g/ml的起始浓度使用纯 化的材料，该起始浓度相当于图171中的稀释倍数1。图176显示EGFR结合ELISA的结果，并确证双特异性抗体BPC1812结合重组人 EGFR0还显示阳性对照抗体爱必妥结合重组人EGFR。与此相反，显示Sigma IgG 15154不 结合重组人EGFR。对于双特异性抗体BPC1812而言，上清液中的抗体的量不能被定量，因 此图176提供的数据表示为净上清液材料稀释倍数。对于爱必妥和阴性对照抗体(Sigma 15154)而言，在测定中分别以2 μ g/ml和1 μ g/m的起始浓度使用纯化的材料，该起始浓度 相当于图176中的稀释倍数1。
103
实施例181；中“G和S”氨某酸残某R经被除去的IL-13/IL-4mAbdAb的结合活t牛数据18. 1.构津 mAbdAb构建了其中G和S氨基酸残基(紧挨接头序列)被除去的mAbdAb。用标准分子生 物学技术构建了表达质粒。这些mAbdAb如表23所述。将它们克隆，然后在HEK293-6E细 胞、CHOKl细胞或CHOEla细胞的一种或多种中表达，将它们纯化(分别如实施例1、1. 3和 1. 5所述)，并在多种IL-13和IL-4活性测定中进行分析。表 23 18. 2.表汰和纯化通过SEC和SDS PAGE纯化并分析这些mAbdAb。制备多个纯化的制备物，示于图 90-98中的SEC和SDS PAGE数据代表这些制备物。18. 3.在盲接结合ELISA中结合人IL_4在直接结合ELISA中如方法2所述检测纯化的除去GS的PascoH-474和 除去GS的PascoH-TVAAPS-474对人IL-4的结合(在该测定中还检测PascoH-474、 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-ELQLE-474 的结合)。完成这些分子的 多种ELISA测定，示于图99中的数据代表这些测定。除去GS 的 PascoH-474 和除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 二者都结合人 IL-4。在
104该测定中包括单独的纯化的抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为结合IL-4的阳性对照。包 括纯化的抗_人IL13mAb作为IL-4结合的阴性对照。除去GS的PascoH-474和除去GS的 PascoH-TVAAPS-474的结合活性与单独的纯化的抗_IL4mAb (帕考珠单抗)、PascoH-474、 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-ELQLE-474 相似。18. 4.在盲接结合ELISA中结合人IL-13在直接结合ELISA中如方法1所述检测纯化的除去GS的PascoH-474和除去GS 的PascoH-TVAAPS-474对人IL-13的结合(在该测定中还检测如实施例19所述产生的分 子PascoH-616和PascoH-TVAAPS_616的结合)。完成这些分子的多种ELISA测定，示于图 100中的数据代表所有测定。除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616全部都结合人IL-13。在该测定中包括单独的纯化的抗-人IL4mAb (帕 考珠单抗)作为IL-13结合的阴性对照。包括纯化的抗-人IL13mAb作为IL-13结合的阳 性对照。注意在该测定中没有检测单独的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因为该dAb不能 被第二检测抗体检测；取而代之的是，在该测定中使用抗-人IL13mAb作为阳性对照以证明 IL-13结合。18. 5.在首梓结合ELISA中结合猻猴IL-13还在直接结合ELISA (如方法17所述)中检测纯化的除去GS的PascoH-474、除 去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS_616mAbdAb 对猕猴 IL-13 的结 合。完成了这些分子的多种ELISA测定，示于图101中的数据代表所有测定。除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616全部都结合猕猴IL-13。在该测定中包括单独的纯化的抗-人 IL4mAb (帕考珠单抗)作为IL-13结合的阴性对照。包括纯化的抗-人IL13mAb作为猕 猴IL-13结合的阳性对照。注意在该测定中没有检测单独的抗-IL-13dAb(D0M10-53-474 和D0M10-53-616)，因为该dAb不能被第二检测抗体检测；取而代之的是，在该测定中使用 抗-人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。18. 6.结合人 IL-4 和人 IL-13 的 Biacore 分析用BIAcore TlOO在25°C (如方法4和5所述)检测纯化的mAbdAb对人IL-4和 人IL-13的结合。这些数据示于表24中。在实验1中，mAbdAb捕获水平达到大约600的相对响应单位，评估了 6个IL-13和 IL-4浓度曲线(256nM、64nM、16nM、4nM、InM和0. 25nM)。在实验1中对于mAb仅评估一个 IL-13(256nM)和 IL_4(256nM)浓度曲线。在实验2中，达到大约400相对响应单位的mAbdAb捕获水平，评估了 6个IL_4浓 度曲线(64nM、16nM、4nM、lnM、0. 25nM 禾口 0. 0625nM)和 6 个 IL-13 浓度曲线(256nM、64nM、 16nM、4nM、lnM和0. 25nM)。在实验2中，对于抗-IL13mAb仅评估一个IL-13浓度曲线 (256nM)，对于帕考珠单抗，评估5个IL-4浓度曲线(64nM、16nM、4nM、InM和0. 25nM)。在实验3中，达到大约700相对响应单位的mAbdAb或mAb捕获水平，评估了 6个 IL-4 浓度曲线(256nM、64nM、16nM、4nM、lnM 和 0. 25nM)和 6个 IL-13 浓度曲线(256nM、 64nM、16nM、4nM、InM 和 0. 25nM)。表 24
在实验1和2中，除去GS的PascoH-474和除去GS的PascoH-TVAAPS-474 二者都 以相似的结合亲和力结合IL-4，该结合亲和力与单独的抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)的结 合亲和力接近相等。除去GS的PascoH-474和除去GS的PascoH-TVAAPS-474还以相似的 结合亲和力结合IL-13。注意在该测定中没有检测单独的抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)，因 为不能将该dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯片上；取而代之的是，在该测定中 使用抗_人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。在实验3中，除去GS的586H-210和除去GS的586H-TVAAPS-210 二者都以相似的 结合亲和力结合IL-13，该结合亲和力与抗-人IL13mAb的结合亲和力接近相等。除去GS 的586H-210和除去GS的586H-TVAAPS-210也极为紧密地结合IL-4，然而由于正解离作用 和BIAcore 技术的灵敏度水平(*)，本方法不能测定其结合亲和力。注意在该测定中没有 检测单独的抗-IL-4dAb (D0M9-112-210)，因为不能将该dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包 被的CM5芯片上；取而代之的是，在该测定中使用抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为阳性对 照以证明IL-4结合。18. 7.结合猕猴IL-4和猕猴IL-13的Biacore分析用BIAcore TlOO在25°C (如方法24和23所述)检测纯化的mAbdAb对猕猴 IL-4和猕猴IL-13的结合。这些数据示于表25中。mAbdAb捕获水平达到大约600相对响 应单位，评估了 6个IL-13浓度曲线(256、64、16、4、1、0. 25nM)和5个IL-4浓度曲线(64、 16、4、1、0. 25nM)。表 25 除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、除去第二个 GS 的 PascoH-ASTKGPT-474、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474 和 PascoH-ASTKG-474 全部都以相 似结合亲和力结合猕猴IL-4。除去GS的PascoH-474、除去GS的PascoH-TVAAPS-474、除去 第二个 GS 的 PascoH-ASTKGPT-474、PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474 和 PascoH-ASTKG-474 全部也都以相似结合亲和力结合IL-13。还用BIAcore TlOO于25°C (如方法24和23所述)检测纯化的mAbdAb对猕猴 IL-4和猕猴IL-13的结合。这些数据示于表26中。mAbdAb捕获水平达到大约600相对响 应单位，评估了 6个IL13和6个IL-4浓度曲线(256、64、16、4、1和0. 25nM)。表 26 除去GS的586H-210和除去GS的586H-TVAAPS-210 二者都以相似的结合亲和力 结合猕猴IL-13 ；这些mAbdAb似乎结合IL13比结合抗-人IL13mAb更有效，然而在该mAb 情况中，仅完成一个浓度曲线，这固然不如全浓度范围评估精确。除去GS的586H-210和 除去GS的586H-TVAAPS-210也极为紧密地结合IL-4，然而由于正解离作用和BIAcore 技术的灵敏度水平(*)，本方法不能测定该结合亲和力。注意在该测定中没有检测单独的 抗-IL-4dAb (D0M9-112-210)，因为不能将该dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯 片上；取而代之的是，在该测定中使用抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)作为阳性对照以证明 IL-4结合。18. 8. IL-4结合mAb dAb对随后的IL-13结合动力学的影响及反之的Biacore分 析和IL-13结合mAbdAb对随后的IL-4结合动力学的影Π向及反少的Biacore分析也将IL-13和IL-4BIAcore 结合测定用于研究IL-4结合除去GS的PascoH-474 对随后的IL-13结合动力学的影响及反之；和IL-13结合586H-TVAAPS-210对随后的IL-4 结合动力学后影响及反之。用BIAcore TlOO设备于25°C用抗-人IgG捕获mAbdAb (或阳 性对照mAb)进行分析。简言之，按照制造商建议通过伯胺偶联将抗_人IgG偶联到CM5芯 片上。然后将mAbdAb构建体(或阳性对照mAb)捕获到该表面(以大约250-750RU)上，以 256nM使第一分析物(人IL-13或人IL-4)通过4分钟。然后以256nM、64nM、16nM、4nM、InM 和0. 25nM的浓度使第二分析物(分别为人IL-4或人IL-13)通过，并且为了双重参考，让缓冲注射液通过捕获抗体或mAbdAb表面。用评估软件在设备中分析(拟合成1 1结合 的模型)数据。然后用3M氯化镁再生该表面。将来自这些实验的数据示于表27和28中。
表 27 不管人IL-4是否结合除去GS的PascoH-474，该分子对人IL-13的结合亲和力都 相似。另外，不管人IL-4是否结合586H-TVAAPS-210，该分子对人IL-13的结合亲和力都相 似，并所述结合亲和力也类似于抗_IL13mAb对人IL-13的结合亲和力。获得的IL-4结合除去GS的PascoH-474和586H-TVAAPS-210的解离速率(kd)极 低，并且超出BIAcore TlOO的灵敏度范围，因此不能用作结合亲和力(数据未显示)的 精确测定。然而，数据确实表明所测的所有构建体对人IL-4结合极为紧密。因此，不管人 IL-13是否结合除去GS的PascoH-474，该分子对人IL-4的结合亲和力都极为紧密。另外， 不管人IL-13是否结合586H-TVAAPS-210，该分子对人IL-4的结合亲和力都极为紧密。18. 9. mAbdAb 效价通过ELISA如方法19所述检测mAbdAb对人IL-4结合人IL-4Rα的抑制。在 一个实验中检测示于表28的所有分子，然而，将数据绘制在两个图中以区分曲线图 (586H-TVAAPS-210进行2次，这在表25中被标为样品1和样品2)。这些数据示于图102 和 103.除去GS的PascoH-474与帕考珠单抗相似地抑制人IL-4与人IL4R α的结合。除去 GS 的 586Η-210、除去 GS 的 586H-TVAAPS-210、586H-TVAAPS-210、586H-210、586H-G4S_210 和586H-ASTKG-210全部都与D0M9-112-210相似地抑制人IL-4与人IL4Ra的结合。包括 帕考珠单抗和D0M9-112-210作为抑制IL-4结合IL4Ra的阳性对照。包括D0M10-53-474 和同种型-匹配的mAb (对不相关抗原具有特异性)作为抑制IL-4结合IL4Rci的阴性对 照。还用这些数据来测定各种分子的IC5tl值。IC5tl值是能够抑制人IL-4与人IL4Ra 结合到50 %的mAbdAb或mAb或dAb的浓度。IC5tl值示于表28中。
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表 28 这些数据确证除去GS的PascoH-474的表现与帕考珠单抗相似，所有 586H-2IOmAbdAb “家族成员”的表现与 D0M9-112_210dAb 相似。18. 10.在TF-I细胞生物测定中mAbdAb对人和猕猴IL-13的中和在TF-I细胞生物测定(分别如方法8和方法20所述)中检测多种纯化的mAbdAb 对人和猕猴IL-13的中和。在这些测定中每种分子检测1-9次，没有显示所有图表，但图 104和105分别为显示对人IL-13和猕猴IL-13的中和数据的代表性图表。在本生物测定中包括 D0M10-53-474作为中和人或猕猴IL-13的阳性对照。在本生物测定中还包括对不相关抗原 具有特异性的dAb (阴性对照dAb)作为中和人或猕猴IL-13的阴性对照。在TF-I 细胞生物测定中，除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 和除去第二个 GS 的 PascoH-ASTKG-474 以及 PascoH-616、PascoH-TVAAPS-616 和 D0M10-53-616(它们如实施例19所述)完全中和人和猕猴IL-13 二者的生物活性。18. 11.在TF-I细胞生物测定中mAbdAb对人和猕猴IL-4的中和在TF-I细胞生物测定(分别如方法9和方法21所述)中检测多种纯化的mAbdAb 对人和猕猴IL-4的中和。在这些测定中每种分子检测2次，没有显示所有图表，但图106和 107分别为显示人IL-4和猕猴IL-4的中和数据的代表性图表(来自数据集)。在本生物测定中包括抗_IL13mAb作为中和人或猕猴IL-4的阴性对照，包括帕考珠单抗作为中和人或 猕猴IL-4的阳性对照。另外，在这些生物测定中还检测PascoH-474、PascoH-TVAAPS-474、 PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-G4S_474 对人和猕猴 IL-4 的中和。在TF-I细胞生物测定中，除去GS的PascoH-474和除去GS的PascoH-TVAAPS-474 完全中和人和猕猴IL-4 二者的生物活性。另外，在TF-I细胞生物测定中，PascoH-474, PascoH-TVAAPS-474、PascoH-ASTKG-474 和 PascoH-G4S_474 还完全中和人 IL-4 的生物活 性。基于从多种不同的实验获得的数据得出ND5tl值。ND5tl值是能够中和IL-13或IL_4 的生物活性到50%的mAbdAb或mAb或dAb的浓度。平均ND5tl值、标准偏差(SD)和所测次 数(η)示于表29中。表 29 在 TF-I 细胞生物测定中，除去 GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474和除去第二个GS的PascoH-ASTKGPT-474都完全中和人和猕猴IL-13的生物活性。 另夕卜，除去GS的PascoH-474、除去GS的PascoH-TVAAPS-474和除去第二个GS的 PascoH-ASTKGPT-474对人IL-13的中和效价(ND5tl值)都相似，并且在单独的纯化的 抗-IL13 dAb (D0M10-53-474)的 ND50 值的 1 倍内。在TF-I细胞生物测定中，除去GS的PascoH-474和除去GS的PascoH-TVAAPS-474 二者都完全中和人和猕猴IL-4的生物活性。另外，除去GS的PascoH-474和除去GS的 PascoH-TVAAPS-474对人IL-13和猕猴IL-13的中和效价(ND5tl值)都相似，并且在帕考珠 单抗的ND5tl值的1倍内。18. 12. mAbdAb抑制人IL-13与人IL_13Ra 2的结合的能力通过ELISA如方法22所述检测表30所列分子对人IL-13与人IL_13Ra 2结合的 抑制。在一个实验中检测所有分子。数据示于图108中。所测的所有mAbdAb抑制人IL-13与人IL13Ra 2的结合。抑制水平与 D0M10-53-474、D0M10-53-616和抗_IL13mAb的抑制水平相似。包括帕考珠单抗和阴性对 照dAb (对不相关抗原具有特异性)作为抑制IL-13结合IL13Rci 2的阴性对照。也用这些数据测定各种分子的IC5tl值。IC5tl值为能够抑制人IL-13与人IL13Ra 2 的结合到50 %的mAbdAb或mAb或dAb的浓度。IC5tl值示于表30中。表 30 这些数据确证除去GS 的 PascoH-474、除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH_616 和 PascoH-TVAAPS-616 的表现与 D0M10-53-474、D0M10-53-616 和抗-IL13mAb 相似。实施例19含有抗-IL13D0M10-53-616dAb的 mAbdAb19. 1.含有抗-IL13D0M10-53-616dAb 的 mAbdAb 的构津通过位点定向诱变如实施例1所述从现有载体克隆表31中所述的两种 抗-IL4mAb-抗 _IL13dAb。
表 31 19. 2.含有抗-IL13D0M10-53-616dAb 的 mAbdAb 的表汰和纯化如实施例1. 3所述在HEK293-6E细胞和CHOEla细胞中表达这些mAbdAb。通过SEC 和 SDS PAGE 纯化并分析 mAbdAb。制备了 PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616mAbdAb的多个纯化的制备物，示于图109 (关于PascoH-616的SEC曲 线)、110(关于 PascoH-TVAAPSJl6 的 SEC 曲线)、111 (关于 PascoH_616 的 SDS PAGE)和 112(关于？3800!1-1744 5-616的503 PAGE)中的SEC和SDS PAGE数据代表了这些制备物。19. 3.在盲接结合ELISA中mAbdAb与人IL-13的结合在直接结合ELISA (如方法1所述)中检测PascoH-616和PascoH-TVAAPS-616纯 化的mAb dAb对人IL-13的结合。这些数据示于图113中。纯化的PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616 二者都结合人 IL-13。在该测定 中包括单独的纯化的抗-人IL4mAb(帕考珠单抗)作为IL-13结合的阴性对照。包括 纯化的抗-人IL13mAb作为IL-13结合的阳性对照。注意在该测定中没有检测单独的 抗-IL-13dAb (D0M10-53-616)，因为该dAb不能被第二检测抗体检测；取而代之的是，在该 测定中使用抗_人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。19.4.对结合人IL-4和人IL-13的Biacore分析用BIAcore TlOO在25°C (如方法4和5所述)检测纯化的mAbdAb对人IL-4和 人IL-13的结合。这些数据示于表32中。在实验1中，mAbdAb捕获水平达到大约600相对响应单位，评估了 6个IL-13和 IL-4浓度曲线(256nM、64nM、16nM、4nM、InM和0. 25nM)。在实验1中对于mAb仅评估一个 IL-13(256nM)和 IL_4(256nM)浓度曲线。在实验2中，mAbdAb捕获水平达到大约400相对响应单位，评估了 6个IL_4 (64nM、 16ηΜ、4ηΜ、1ηΜ、0· 25ηΜ 和 0· 0625ηΜ)和 6 个 IL-13 浓度曲线(256nM、64nM、16nM、4nM、InM 和 0. 25nM)。在实验2中，对于抗_IL13mAb仅评估一个IL-13浓度曲线(256nM)，对于帕考珠 单抗，评估 5 个 IL-4 浓度曲线(64nM、16nM、4nM、lnM 和 0. 25nM)。表 32 PascoH-616和PascoH-TVAAPS-616 二者都以相似的结合亲和力结合IL-4，该 结合亲和力与单独的抗-人IL4mAb(帕考珠单抗)的结合亲和力相似。PascoH-616 和PascoH-TVAAPS-616 二者都结合IL-13。注意在该测定中没有检测单独的 抗-IL-13dAb (D0M10-53-616)，因为不能将该dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯 片上；取而代之的是，在该测定中使用抗_人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。19. 5.对结合称猴 IL-13 的 Biacore也用BIAcore TlOO在25°C (如方法30所述)检测纯化的mAbdAb对猕猴IL-13 的结合。这些数据示于表33中。mAbdAb捕获水平达到大约400相对响应单位，评估了 6个 IL-13浓度曲线(256、64、16,4,1和0. 25nM)。对于抗-IL13mAb仅有一个IL-13浓度曲线 (256nM)。表 33 PascoH-616和PascoH-TVAAPS-616 二者都以相似的结合亲和力结合猕猴IL-13。 注意在该测定中没有检测单独的抗_IL-13dAb (D0M10-53-616)，因为不能将该dAb捕获到 蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯片上；取而代之的是，在该测定中使用抗-人IL13mAb作 为阳性对照以证明IL-13结合。19. 6.在TF-I细胞牛物测定中mAbdAb对人和猕猴IL-13的中和在TF-I细胞生物测定(分别如方法8和方法20所述)中检测纯化的mAbdAb对人
114IL-13和猕猴IL-13的中和。在每一测定中对这些分子检测3次，图114为显示对人IL-13 的中和数据的代表性图表。图114a为显示对猕猴IL-13的中和数据的代表性图表。在本 生物测定中包括D0M10-53-616作为中和IL-13的阳性对照。在本生物测定中还包括对不 相关抗原具有特异性的dAb (阴性对照dAb)作为中和IL-13的阴性对照。平均ND5tl值、标准偏差(SD)和所测次数(η)示于表34中。表 34 在TF-I细胞生物测定中，PascoH-616和PascoH-TVAAPS-616 二者以及另外的 mAbdAb (除去GS的PascoH-TVAAPS_474和除去GS的PascoH_474)完全中和人和猕猴IL-13 的生物活性。另外，PascoH_616和 PascoH-TVAAPS_6l6 对人 IL-13 的中和效价(ND5tl 值)相似， 并且在单独的纯化的抗_IL13dAb (D0M10-53-616)的ND5tl值的2倍内。还通过ELISA 如方法 22 所述检测 PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616 对人 IL-13 结合人IL-13Ra 2的抑制。这些数据提供在实施例18. 12中。实施例20在人全血磷-STAT6生物测定中mAbdAb中和人IL-13或IL_4的能力如方法16所述在人全血磷-STAT6生物测定中检测mAbdAb中和人IL-13或IL_4 的能力。测定了2 种 mAbdAb 构建体(纯化的抗-IL13mAb-抗-IL4dAb、586H-TVAAPS_210 ； 和纯化的抗-IL4mAb-抗-IL13dAb、除去GS的PascoH_474)的IL-4或IL-13中和效价(即 抑制IL-4或IL-13生物活性)。在该测定中包括纯化的抗_人IL-4mAb (帕考珠单抗)和纯 化的抗_IL4dAb (D0M9-112-210)作为中和rhIL_4的阳性对照。包括纯化的抗-人IL_13mAb 和纯化的抗-IL13 dAb (D0M10-53-474)作为中和rhIL_13的阳性对照。包括与dAb混合的同种型匹配的mAb (二者都对不相关抗原具有特异性)作为中和rhIL-4或rhIL-13的阴性 对照。用来自不同供体的血对每种分子检测至少2次。图115-124为显示代表性数据的图表。纯化的mAbdAb完全中和rhIL-13和rhIL_4的生物活性。如方法16所述，将测试分子中和rhIL-13或rhIL_4生物活性的能力表示为中和 2ng/mL人IL-4或人IL-13到50%所需的分子(例如mAbdAb)的浓度(IC50)。这些数据示 于表35中。出示了关于每一种分子的来自所有供体的合并平均IC5tl连同标准偏差。表 35 IC50 值比较表明 586-TVMPS-210 与抗 _IL13mAb 和 D0M9-112-210 相似地抑制 IL-13 和IL-4诱导的pSTAT-6 (分别在IL-13和IL-4全血测定中)。IC5tl数据的比较还表明除去GS 的PascoH-474与D0M10-53-474和帕考珠单抗相似地抑制IL-13和IL-4诱导的pSTAT_6 (分 别在IL-13和IL-4全血测定中)。对照mAb显示在所有供体中在高达所测的最大浓度661nM 下无抑制，对照dAb显示在所有供体中在高达所测的最大浓度2291nM下不中和。实施例21双重靶向的抗-IL4/抗_IL13mAbdAb的大鼠PK研究在大鼠PK 研究(如表 35. 1 所概述)中评估 PascoH-G4S_474、PascoL-G4S_474、 586H-TVAAPS-210和586H-TVAAPS-154。简言之，以2mg/kg的目标剂量水平将mAbdAb单次 静脉内(i/v)给予雄性Sprague-Dawley大鼠(体重大约200克-220克)。在分配的时间 点(0小时到312小时)抽取1001血液样品，处理为血浆。在人IgG检测测定和/或IL-13配体结合测定和/或IL-4配体结合测定中，评估大鼠血浆样品中测试分子的存在情况。另 外，还评估血浆中帕考珠单抗(在大鼠中)的PK曲线在该情况下，在人IgG检测测定和 IL-4配体结合测定中评估帕考珠单抗在大鼠血浆样品中的存在情况。在第一个研究中，将帕考珠单抗给予4只大鼠。在第二个研究中，有4个治疗组 (2mg/kg PascoH-G4S-474、2mg/kg PascoL-G4S_474、2mg/kg 586H-TVAAPS-210 禾Π 2mg/kg 586H-TVAAPS-154)，每组 4 只大鼠。由血浆浓度-时间曲线数据(未显示)得出PK参数(示于表35. 1)。注意在这 些测定中不止一次分析某些血浆样品，并且仅从这些数据集之一得出表35. 1中的PK参数。 还要注意对于个别的动物剂量，没有将PK参数标准化，取而代之的是假定为2mg/kg的标称 剂量。注意在对PaSCOH-G4S-474的IgG PK测定中某些遇到技术困难，因此浓度可能估计 过高。另外，在某些情况下进行两次IgG血浆浓度-时间曲线分析(在表35. 1中被标注为 分析1和分析2)。仅在分析2中对产生自IL-13和IL-4配体结合PK测定的血浆浓度-时 间曲线数据进行分析。对PascoL-G4S-474和586H-TVAAPS-154的IL-13和IL-4配体结合 测定所产生的血浆浓度_时间曲线数据不用于获得这些分子的PK参数。表 35. 1 在对PascoH-G4S_474的IL-13和IL_4测定中产生的血浆浓度-时间曲线数据 (及随后获得的PK参数)趋向于类似；在对586H-TVAAPS-210的IL_13、IL_4和IgG PK测 定中产生的血浆浓度-时间曲线数据(及随后获得的PK参数)也是这种情况。这表明在 整个研究过程中这些mAbdAb在大鼠血浆中是“完好”的。获得的586H-TVAAPS-154的PK参 数比起任何其它mAbdAb，似乎与获得的帕考珠单抗的PK参数更相似。实施例22
猕猴PK研究在猕猴中进行PK研究。以lmg/kg的目标剂量水平单次静脉内给予动物。在分配 的时间点抽取500 μ 1血液样品，处理为血浆。然后在IL-13配体结合测定、IL-4配体结合 测定和IL-13/IL-4桥联测定(bridging assay)中，评估猕猴血浆样品中测试分子的存在 情况。来自这些研究的关于“除去GS 的 PascoH-474” 和 “586H-TVAAPS-210”mAbdAb 的 初始数据与上述大鼠PK数据一致，表明这些分子比mAb更快地从系统循环中清除，但比dAb
清除慢。实施例2323. 1.产牛双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb通过将dAb融合到mAb重链的C-末端来构建该双重靶向的mAbdAb。先前已构建 抗-EGFR mAb重链和轻链表达盒。用于克隆的限制性位点与由实施例10中所述的限制性 位点(Sail 和 HindIII) 一样。然后通过PCR(用编码SalI和HindIII端的引物)扩增编码抗-VEGF dAb (D0M15-26-593)的DNA，并将其插入到经修饰的3，编码区，在mAb和dAb之间产生接头 “STG” (丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸)。选择已验证序列的克隆(SEQ ID NO 164和243分别为轻链和重链)，按照制造商 方案用Qiagen Mega Prep试剂盒制备大规模DNA制备物。通过用瞬时转染技术共转染轻 链和重链(SEQ ID N0:165和137)在哺乳动物HEK293-6E细胞中表达mAbdAb。23. 2.双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的纯化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液纯化该双重靶向的 mAbdAb。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度测量值确定纯化的样品的浓度。纯 化的样品(命名为DMS4010)的SDS-PAGE分析(图128)显示未经还原的样品泳动至约 170kDa，而经还原的样品显示泳动至约25和约60kDa的两条带，其分别对应于轻链和融合 dAb的重链。为了进行大小排阻色谱(SEC)分析，将抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上样到预平衡的 S-20010/300GL柱(连接到HPLC系统)上，用PBS以Iml/分钟流动。SEC曲线显示作为对 称峰流动的单一物质(图129)。23. 3.双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的效价分别如方法12和13所述测定该分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism 分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。该mAbdAb (命名 为DMS4010)的抗-EGFR效价(图130)计算为4. 784nM，而对照抗-EGFR mAb给出的EC50 值为4. 214nM。在抗-VEGF受体结合测定(图131)中，该mAbdAb (命名为DMS4010)的EC50 为 58pM(0. 058nM)，而抗-VEGF 对照 mAb 产生的 EC50 为 214. IpM (0. 2141nM)。综上所述，测 定数据显示实施例23的构建体即双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb对两种抗原都有 效。23. 4.双重靶向的抗-EGFR/ 抗-VEGF mAbdAb 的 PK在将双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb (命名为DMS4010)给予猕猴后测定 其药代动力学曲线。以5mg/kg的剂量静脉内给予该化合物，通过在单独的ELISA测定中
118结合EGFR和VEGF 二者来测定给药后多个时间点药物的血清水平。图132显示该测定的 结果，其中将数据与业已产生的mAb西妥昔单抗(cetuximab)(抗-EGFR)和贝伐珠单抗 (bevacizumab)(抗-VEGF)的历史数据进行比较。进一步的详细资料示于表36中。表 36 23. 5.产牛备选抗-EGFR/ 抗-VEGF mAbdAb以与上面实施例11. 1所述相似方式构建备选抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb，用STG接 头将相同的抗-EGFR mAb在重链C-末端连接到VEGF dAb上。在该种情况下所用的抗-VEGF dAb为D0M15-10-11。通过用瞬时转染技术共转染轻链和重链(SEQ ID N0:165和186)在 哺乳动物HEK293-6E细胞中表达该分子，然而，与实施例23. 2所述分子的表达相比，得到显 著较低的表达水平。当在如实施例23. 3所述的同一 VEGF测定中检测效价时，发现在该测 定中抑制VEGF结合VEGF受体的水平不可检测。实施例2424. 1.不用接头产牛双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb制备在上述实施例23中的mAbdAb的衍生物，其中除去dAb和mAb的CH3结构域 之间的“STG”接头。SDM用于从编码重链的质粒删去编码STG接头的残基。选择已分别验 证轻链和重链序列(SEQID N0:243和SEQ ID NO 174)的克隆，用Qiagen Mega Pr印试剂 盒按照制造商方案制备大规模的DNA制备物。通过用瞬时转染技术共转染轻链和重链(SEQ ID NO 175和137)在哺乳动物HEK293-6E细胞中表达mAbdAb。24. 2.不含接头的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的纯化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液纯化该双重靶向的 mAbdAb。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度测量值确定纯化的样品的浓度。纯 化的样品(命名为DMS4011)的SDS-PAGE分析(图133)显示未经还原的样品泳动至约 170kDa，而经还原的样品显示泳动至约25和约60kDa的两条带，其分别对应于轻链和融合 dAb的重链。为了进行大小排阻色谱(SEC)分析，将抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上样到预平衡的 S-200 10/300GL柱(连接到HPLC系统)上，用PBS以Iml/分钟流动。SEC曲线显示作为 对称峰流动的单一物质(图134)。24. 3.不含接头的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的效价分别如方法12和13所述测定该分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism 分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。该mAbdAb (命名 为DMS4011)的抗-EGFR效价(图135)计算为3. 529nM，而对照抗-EGFR mAb给出的EC50 值为3. 647nM。在抗-VEGF受体结合测定(图136)中，该mAbdAb (命名为DMS4011)的EC50为 34209pM(0. 3429nM)，而抗-VEGF 对照 mAb 产生的 EC50 为 214. IpM(0. 2141nM)。综上所 述，测定数据显示实施例24的构建体即不含接头的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb 对两种抗原都有效。实施例2525. 1.产牛含较长接头的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb制备在上述实施例23中的mAbdAb的衍生物，其中通过将柔性的“GGGGS”基序的 一个或多个重复插入到编码重链的质粒来延长dAb和mAb的CH3结构域之间的接头。含SEQ ID NO 175中所述的重链序列的第一种分子具有该基序的一个重复，因此 具有接头“STGGGGGS”。含SEQ ID NO 177中所述的重链序列的第二种分子具有该基序的两个重复，因此 具有接头 “ STGGGGGSGGGGS ”。这两者都独立与实施例23 (SEQ ID NO 243)中所用的相同的轻链配对。选择已验证轻链和重链序列的克隆，用Qiagen Mega Pr印试剂盒按照制造商方案 制备大规模的DNA制备物。通过用瞬时转染技术共转染轻链和重链(命名为DMS4023的 SEQ ID NO 176 和 137 ；命名为 DMS4024 的 SEQ ID NO 178 和 137)在哺乳动物 HEK293-6E 细胞中表达mAbdAb。25. 2.含较长接头的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的纯化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液纯化这些双重靶向 的mAbdAb。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度测量值确定纯化的样品的浓度。纯 化的样品DMS4023和DMS4024的SDS-PAGE分析(图137)显示未经还原的样品泳动至约 170kDa，而经还原的样品显示泳动至约25和约60kDa的两条带，其分别对应于轻链和融合 dAb的重链。为了进行大小排阻色谱(SEC)分析，将抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上样到预平衡的 S-200 10/300GL柱(连接到HPLC系统)上，用PBS以Iml/分钟流动。DMS4023 (图138) 和DMS4024(图139) 二者的SEC曲线都显示具有稍微拖尾的峰的单一物质。25. 3.含有较长接头的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的效价分别如方法12和13所述测定该分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism 分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。mAbdAb DMS4023 的抗-EGFR效价(图140)计算为7. 066nM并且mAbdAb DMS4024的效价计算为6. 420nM,而 对照抗-EGFR mAb给出的EC50值为7. 29InM。在抗-VEGF受体结合测定(图141)中，mAbdAb DMS4023 的 EC50 为 91. 79ρΜ(0· 09InM)并且 mAbdAb DMS4024 的 EC50 为 90ρΜ(0· 0906ηΜ)， 而抗-VEGF对照mAb产生的EC50为463. 2pM(0. 4632nM)。综上所述，测定数据显示实施例 25的构建体即含较长接头的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb对两种抗原都有效。实施例2626. 1.产生双重靶向的抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb通过将dAb融合到mAb重链的C-末端来构建该双重靶向的mAbdAb。先前已构建 抗-VEGF mAb重链和轻链表达盒。用于克隆的限制性位点与由实施例10中所述的限制性 位点(Sail和HindIII)相同。然后通过PCR(用编码SalI和HindIII端的引物)扩增编码抗-EGFR
120dAb (D0M16-39-542)的DNA，并将其插入到经修饰的3’编码区，导致产生在mAb和dAb之间 的接头“STG”(丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸)。选择已验证序列的克隆(SEQ ID NO 179和181分别为轻链和重链)，按照制造商 方案用Qiagen Mega Prep试剂盒制备大规模DNA制备物。通过用瞬时转染技术共转染轻 链和重链(SEQ ID N0:180和182)在哺乳动物HEK293-6E细胞中表达mAbdAb。26. 2.双重靶向的抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb的纯化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液纯化这些双重靶向 的mAbdAb。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度测量值确定纯化的样品的浓度。 纯化的样品(命名为DMS4009)的SDS-PAGE分析(图142)显示未经还原的样品泳动至约 170kDa，而经还原的样品显示泳动至约25和约60kDa的两条带，其分别对应于轻链和融合 dAb的重链。为了进行大小排阻色谱(SEC)分析，将抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上样到预平衡的 S-20010/300GL柱(连接到HPLC系统)上，用PBS以Iml/分钟流动。该分子的SEC曲线显 示具有对称峰的单一物质(图143)。26. 3.双重靶向的抗-VEGF/抗-EGFR mAbdAb的效价分别如方法12和13所述测定该分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。该mAbdAb DMS4009的抗-EGFR效价(图144)计算为132. 4nM，而对照抗-EGFR mAb给出的EC50值为 6. 585nM。在抗-VEGF 受体结合测定(图 145)中，该 mAbdAb 的 EC50 为 539. 7ρΜ (0. 5397nM)， 而抗-VEGF对照mAb产生的EC50为380. 5pM(0. 3805nM)。综上所述，测定数据显示实施例 26的构建体即双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb对两种抗原都有效。实施例2727. 1.产生双重靶向的抗-EGFR/ 抗-IL_13mAbdAb通过将dAb融合到mAb重链的C-末端来构建该双重靶向的mAbdAb。先前已构建 抗-EGFR mAb重链和轻链表达盒。用于克隆的限制性位点与由实施例10中所述的限制性 位点(Sail 和 HindIII) 一样。然后通过PCR(用编码SalI和HindIII端的引物)扩增编码 抗-IL-13dAb (D0M10-53-474)的DNA，并将其插入到经修饰的3，编码区，导致产生在mAb和 dAb之间的接头“STG” (丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸)。选择已验证序列的克隆(SEQ ID NO 243和183分别为轻链和重链)，按照制造商 方案用Qiagen Mega Prep试剂盒制备大规模DNA制备物。通过用瞬时转染技术共转染轻 链和重链(SEQ ID N0:137和184)在哺乳动物HEK293-6E细胞中表达mAbdAb。27. 2.双重靶向的抗-EGFR/抗-IL_13mAbdAb的纯化和SEC分析按照已建立的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液纯化这些双重靶向 的mAbdAb。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度测量值确定纯化的样品的浓度。 纯化的样品(命名为DMS4029)的SDS-PAGE分析(图146)显示未经还原的样品泳动至约 170kDa，而经还原的样品显示泳动至约25和约60kDa的两条带，其分别对应于轻链和融合 dAb的重链。为了进行大小排阻色谱(SEC)分析，将抗-EGFR/抗-IL_13mAbdAb上样到预平衡
121的S-200 10/300GL柱(连接到HPLC系统)上，用PBS以0. 5ml/分钟流动。该分子的SEC 曲线显示具有对称峰的单一物质(图147)。27. 3.双重靶向的抗-EGFR/抗-IL_13mAbdAb的效价分别如方法13和25所述测定该分子中和EGFR和IL-13的能力。用GraphPad Prism分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。mAbdAb DMS4029的抗-EGFR效价(图148)计算为9. 033nM,而对照抗-EGFR mAb给出的EC50值 为8. 874nM。在基于IL-13细胞的中和测定(图149)中，该mAbdAb的EC50为1. 654nM，而 抗-IL-13对照mAb产生的EC50为0. 996nM。综上所述，测定数据显示实施例27的构建体 即双重靶向的抗-EGFR/抗-IL-13mAbdAb对两种抗原都有效。实施例2828. 1.产牛其中dAb位于轻链上的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb通过将dAb融合到mAb轻链的C-末端来构建双重靶向的mAbdAb。先前已构建 抗-EGFR mAb重链和轻链表达盒。为了引入用于将dAb插入到轻链的限制性位点，用mAb轻链表达载体作为模板使 用位点定向诱变来产生BamHI和HindIII克隆位点。然后通过PCR(用编码SalI和HindIII 端的引物)扩增编码抗-VEGFdAb (D0M15-26-593)的DNA，并将其插入到经修饰的3，编码 区，导致产生mAb和dAb之间的接头“GSTG”或“GSTVAAPS”。含SEQ ID NO 187中所述的轻链序列的第一种分子具有接头“GSTG”。含SEQ ID NO 189中所述的轻链序列的第二种分子具有接头“GSTVAAPS”。这两者都独立与SEQ ID NO 245重链配对。选择已验证轻链和重链序列的克隆，按照制造商方案用QiagenMega Pr印试剂盒 制备大规模DNA制备物。通过用瞬时转染技术共转染轻链和重链(SEQ ID N0:188和139 命名为DMS4013 ；禾口 SEQ ID NO 190和139命名为DMS4027)在哺乳动物HEK293-6E细胞中 表达 mAbdAb。28. 2.其中dAb位于轻链上的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb的纯化和SEC 分析按照已建立的方案用蛋白-A亲和色谱法从澄清的表达上清液纯化这些双重靶向 的mAbdAb。通过分光光度法根据在280nm处的光吸光度测量值确定纯化的样品的浓度。纯 化的样品DMS4013和DMS4027的SDS-PAGE分析(图150)显示未经还原的样品泳动至约 170kDa，而经还原的样品显示泳动至约38和约50kDa的两条带，其分别对应于融合dAb的 轻链和重链。为了进行大小排阻色谱(SEC)分析，将抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb上样到预平衡的 S-200 10/300GL柱(连接到HPLC系统)上，用PBS以Iml/分钟流动。DMS4013(图151) 和DMS4027(图152) 二者的SEC曲线都显示具有对称峰的单一物质。28. 3.其中dAb位于轻链上的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGFmAbdAb的效价分别如方法12和13所述测定该分子中和VEGF和EGFR的能力。用GraphPad Prism 分析测定数据。用S形剂量应答曲线测定效价，用最佳拟合模型拟合数据。mAbdAb DMS4013 的抗-EGFR效价(图153)计算为7. 384nM, mAbdAb DMS4027的效价计算为7. 554nM，而对照 抗-EGFR mAb给出的EC50值为7. 093nM。在抗-VEGF受体结合测定(图154)中，mAbdAb
122DMS4013 的 EC50 为 1. 179nM, mAbdAbDMS4027 的 EC50 为 0. 173 InM，而抗-VEGF 对照 mAb 产 生的EC50为0. 130nM。综上所述，测定数据显示实施例28的构建体即其中dAb位于轻链上 的双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb对两种抗原都有效。实施例29双重靴向的抗-EGFR/抗-VEGF 和抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb 的 Biacore 分析对在实施例11 (抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAb)和实施例 23、24、25 和 28 (抗-EGFR/ 抗-VEGF mAbdAb)中所述的mAbdAb进行BIAcore分析，以测定它们结合其相应抗原的动力 学结合常数及解离常数。在BIAcore 3000设备上进行分析。设备温度设定为25°C。将 HBS-EP缓冲液用作流动缓冲液。以设备最高可能比率采集实验数据。按照制造商说明书 用标准胺偶联化学用蛋白A包被研究级的CM5芯片上的一流动细胞，同样处理第二批流动 细胞，但用缓冲液代替蛋白A以产生参考表面。然后将用蛋白A包被的流动细胞用于捕获 mAbdAb。抗原如表37中所详述以2x系列稀释液注入。几种稀释液以一式二份来进行。单 独的缓冲注入液代替配体用于本底扣除。用设备软件自带的动力学Wizard以随机顺序注 入样品。在每一次循环结束时通过注入IOmM甘氨酸，pH 1.5来使表面再生。用BIA评估 软件4. 1来进行数据处理和动力学拟合。显示重复结果(来自同一次运作)平均值的数据 示于表37中。显示的DMS4010的多个值代表在单独场合的两次实验运作。因所分析的配 体的浓度，787nM的值可能高估了亲和力。表 37 实施例30包含融合到丨双特异+牛抗体骨架上的单一结构域抗体的寺异+牛抗体[1060]30. 1.构津用合适的限制性酶位点和所加的信号序列，从头构建了编码对IL-18和IL-12抗 原具有特异性的双特异性抗体分子的可变重链和轻链结构域的基因(进一步的资料参见 WO 2007/024715)。用标准分子生物学技术将可变重链结构域克隆到表达载体，所述表达载 体含有经由TVAAPS接头在恒定区的C-末端融合到抗-IL4结构域抗体D0M9-112-210 (SEQ ID NO 4)的IgGl重链恒定区。将轻链可变结构域同样地克隆到含有Ck恒定区序列的表 达载体中。已构建和表达的抗体列入表38中。表 38 30. 2表汰和纯化简言之，用先前与293fectin试剂(Invitrogen#51-0031)孵育的重链和轻链表 达质粒共转染25ml 1.5xl06细胞/ml的HEK293细胞。将其置于37°C、5% CO2和95% RH 的振荡培养箱中。24小时后，加入蛋白胨养分培养基，让细胞再生长48小时。通过离心收 获上清液，通过ELISA定量IgG水平。将得到的mAbdAb命名为BPC1616 (SEQID N0:193和 194)。30. 3. IL-12 结合 ELISA评估了转染的细胞上清液对重组人IL-12的结合。简言之，用抗-人IL_12(R&D Systems AF219NA)以2 μ g/ml包被ELISA板，并用封闭液(Tris缓冲的盐水中的4% BSA) 封闭。然后将封闭液中的25ng/ml重组人IL-12(P印rOTech#200-12)装入板中。在用 TBS+0. 05% Tween 20 (TBST)洗涤前让板在室温孵育1小时。加入在封闭液中稀释的各种 稀释度的细胞上清液以及不相关对照抗体(帕考珠单抗和同种型匹配的对照hlgG)。在用 TBST洗涤前让板在室温孵育1小时。通过加入在封闭液中以1/1000稀释的过氧化物酶标 记的抗人κ轻链抗体(SigmaA7164)来检测结合。在用TBST洗涤前让板在室温孵育1小 时。通过加入OPD底物(Sigma P9187)来使板显色，并通过加入3M H2SO4终止显色。用板 读数器在490nm处测量吸光度，作图确定平均吸光度。结果显示在图155中，其显示BPC1616结合重组人IL-12，而两种对照抗体显示不结合。30. 4. IL-IR 结合 ELISA评估了转染的细胞上清液对重组人IL-18的结合。简言之，用抗-人IL-18 (由GSK 制备)以1μ g/ml包被ELISA板，并用封闭液(Tris缓冲的盐水中的4% BSA)封闭。加入 在封闭液中稀释的各种稀释度的细胞上清液以及不相关抗体(帕考珠单抗和同种型匹配 的对照人IgG)。在用TBS+0. 05% Tween 20 (TBST)洗涤前让板在室温孵育1小时。通过加入在封闭液中以1/1000稀释的过氧化物酶标记的抗人κ轻链抗体(Sigma A7164)来检测 结合。在用TBST洗涤前让板在室温孵育1小时。通过加入OPD底物(Sigma P9187)来使 板显色，并通过加入3M H2SO4终止显色。在490nm处用板读数器测量吸光度，作图确定平均 吸光度。结果显示在图156中，其显示BPC1616结合重组人IL-18，而两种对照抗体显示不
社a
？口口。30. 5. IL-4 结合 ELISA评估了转染的细胞上清液对重组人IL-14的结合。简言之，用IL_4(由GSK制备) 以1 μ g/ml包被ELISA板，并用封闭液(Tris缓冲的盐水中的4% BSA)封闭。加入在封闭 液中稀释的各种稀释度的细胞上清液以及抗-IL-4单克隆抗体(帕考珠单抗)和不相关的 抗体(同种型匹配的对照hlgG)。在用TBS+0. 05% Tween 20 (TBST)洗涤前让板在室温孵育 1小时。通过加入在封闭液中以1/1000稀释的过氧化物酶标记的抗人K轻链抗体(Sigma A7164)来检测结合。在用TBST洗涤前让板在室温孵育1小时。通过加入OPD底物(Sigma P9187)来使板显色，并通过加入3M H2SO4终止显色。在490nm处用板读数器测量吸光度， 作图确定平均吸光度。结果显示在图157中，其显示BPC1616和帕考珠单抗结合重组人IL_4，而对照抗体 显示不结合。实施例31伺☆至丨_.秘C-纖白倾付一馳騰侧Ξ,鼎mAbdAb31. 1.构津构建了三种三特异性抗体(mAbdAb-dAb)，其中将两个单一结构域抗体线内(in line)融合到单克隆抗体重链的C-末端。简言之，通过PCR引入N-末端的BglII限制性位点和C-末端的BamHI限制性位 点，以使编码结构域抗体的DNA序列位于D0M10-53-474(SEQ ID NO :5)、D0M9_155_154 (SEQ ID NO 3)和 D0M9-112-210 (SEQ ID NO 4)的侧翼。然后将编码D0M10-53-474结构域抗体的DNA片段克隆到编码与抗IL_4结构域抗 体D0M9-112-210 (SEQ ID NO 71)融合的抗IL-5单克隆抗体重链的哺乳动物表达载体的 BamHI位点。将编码D0M9-155-154和D0M9-112-210结构域抗体的DNA片段二者都独立克 隆到编码与抗IL-13结构域抗体D0M10-53-474(SEQ ID NO :116)融合的抗-CD20单克隆 抗体重链的哺乳动物表达载体的BamHI位点。得到的表达载体编码含融合到C-末端的两 个单一结构域抗体的重链。重链的蛋白质序列示于表39中所述的SEQ ID NO 195、196和 197。表39为业已构建的mAbdAb的概述。表 39 31. 2.表达和纯化用293fectin 试剂(Invitrogen, 12347019)将编码 BPC1008、BPC1009 和 BPC1010
重链和轻链的表达质粒共转染到HEK 2936E细胞中。第二天将蛋白胨养料加入到细胞培养 物中，从初始转染约2-6天后收获上清液物质。在用结合测定检测前用蛋白A柱纯化抗体。31. 3. IL-4 结合 ELISA用包被缓冲液(0. 05M碳酸氢盐pH9. 6，Sigma C-3041) 3中的5 μ g/ml人 IL-4 (GSK)包被96孔高结合板，并在4°C储存过夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-缓 冲的盐水(TBST)洗涤板2次。将100 μ L封闭液(含1 % BSA的TBST缓冲液)加入到各 孔中，让板在室温孵育至少1小时。用封闭液在板中连续稀释纯化的抗体。孵育1小时后， 将板洗涤3次。将山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体(SigmaA7164)在封闭 液中以1 2000稀释，将50 μ L加入到各孔中。让板孵育1小时。将板洗涤3次，然后将 OPD (邻苯二胺二盐酸盐)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，5分钟后通过加入25 μ L的3Μ 硫酸使反应终止。用碱性终点方案用VersaMax Tunable微板读数器(MoleCularDevices) 在490nm处读取吸光度。ELISA结果示于图158中，其确证抗体BPC1008、1009和BPC1010结合重组人IL-4。 还显示阳性对照帕考珠单抗结合重组IL-4，然而显示阴性对照抗IL-13mAb和美泊利单抗
126不结合IL-4。也在单独的实验中检测抗体BPC1009和BPC1010，其给出与图158所示相似
的结果。31. 4. IL-5 结合 ELISA用包被缓冲液(0. 05M碳酸氢盐ρΗ9· 6)中的5. 9 μ g/ml人IL-5 (GSK)包被96孔 高结合板，并在4°C储存过夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水(TBST)洗涤 板2次。将100 μ L封闭液(含BSA的TBST缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至 少1小时。用封闭液在板中连续稀释纯化的抗体。孵育1小时后，将板洗涤3次。将山羊 抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体(Sigma A7164)在封闭液中以1 2000稀释，将 50 μ L加入到各孔中。让板孵育1小时。将板洗涤3次，然后将OPD (邻苯二胺二盐酸盐) SigmaFast底物溶液加入到各孔中，5分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸使反应终止。用碱 性终点方案用VersaMax Tunable微板读数器(Molecular Devices)在490nm处读取吸光 度。图159显示ELISA结果，其确证抗体BPC1008结合重组人IL-5，而BPC1009和 BPC1010显示不结合IL-5。也显示阳性对照帕考珠单抗结合重组IL-5，然而显示阴性对照 抗IL-13mAb和美泊利单抗不结合IL-5。IL-13 结合 ELISA用包被缓冲液(0. 05M碳酸氢盐pH9. 6，Sigma C-3041) 3中的5 μ g/ml人 IL-13 (GSK)包被96孔高结合板，并在4°C储存过夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-缓 冲的盐水(TBST)洗涤板2次。将100 μ L封闭液(1 % BSA的TBST缓冲液)加入到各孔中， 让板在室温孵育至少1小时。用封闭液在板中连续稀释纯化的抗体。孵育1小时后，将板 洗涤3次。将山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体(SigmaA7164)在封闭液中以 1 2000稀释，将50 μ L加入到各孔中。让板孵育1小时。将板洗涤3次，然后将OPD (邻 苯二胺二盐酸盐)SigmaFast底物溶液加入到各孔中，5分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸 使反应终止。用碱性终点方案用VersaMax Tunable微板读数器(MolecularDevices)在 490nm处读取吸光度。ELISA结果示于图160中，其确证抗体BPC1008、1009和BPC1010结合重组人 IL-13。还显示阳性对照抗IL-13mAb结合重组IL-13，然而显示阴性对照帕考珠单抗和美泊 利单抗不结合IL-13。也在单独的实验中检测抗体BPC1009和BPC1010，其给出与图160所 示相似的结果。实施例32含融合到单价骨架的单一结构域抗体的mAbdAb32. 1. mAbdAb 的构建如下构建包含单价抗体(进一步资料参见W02006015371和W02007059782)和结 构域抗体D0M-15-26-293融合体的双特异性抗体。用基于PCR的策略接着位点定向诱变 构建编码抗-c-MetKnob-into-hole重链(SEQ ID NO :202和203)的DNA序列。用基于 PCR的策略接着通过基于PCR的方法除去铰链区构建了编码抗-C-MetUnibody重链(SEQ ID NO 204)的DNA序列。另外，对于融合构建体，在重链表达盒的C-末端包括BamHI和 EcoRI限制性位点，以促进作为来自现有载体的BamHI-Ec0RI片段的抗VEGF-A结构域抗体 (D0M-15-26-593)DNA序列(编码SEQ ID NO :75的455-570位氨基酸)的随后克隆。得到的表达载体编码经由GS接头融合到重链C-末端的抗-VEGFA结构域抗体(SEQ ID NO 198, 199和201)。通过基于PCR的策略已构建编码抗-c-Met轻链(SEQ ID NO 200)的DNA序 列。BPC1604的构建如实施例14所述。下表40为业已产生并表达的单价骨架mAbdAb 和抗体的概述。表 40 32. 2.表达和纯化用293fectin(Invitrogen, 12347019)将编码 BPC1017、BPC1018 和 BPC1020 重链 的表达质粒共转染到HEK 2936E细胞中。第二天将蛋白胨养料加入到细胞培养物中，从初 始转染约2-6天后收获上清液物质。在用结合测定检测前用蛋白A柱纯化抗体。32. 3. HGF 受体结合 ELISA用包被缓冲液(0. 05M碳酸氢盐ρΗ9· 6，Sigma C_3041)3中的5 μ g/ml重组人HGF R(c-MET)/Fe嵌合体(R&D system，货号358_MT/CF)包被96孔高结合板，并在4°C储存过夜。用含0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水(TBST)洗涤板2次。将100 μ L封闭液 (含1 % BSA的TBST缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少30分钟。将板洗涤3 次。然后用封闭液在板中连续稀释纯化的抗体。在室温孵育1小时后，将板洗涤3次。将 山羊抗-人κ轻链特异性过氧化物酶缀合抗体(Sigma A7164)在封闭液中以1 2000稀 释，并加入到各孔中。让板孵育1小时。将板洗涤3次，然后将OPD (邻苯二胺二盐酸盐) SigmaFast底物溶液加入到各孔中，5分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸使反应终止。用碱 性终点方案用VersaMax Tunable微板读数器(Molecular Devices)在490nm处读取吸光 度。ELISA结果示于图161中，其确证mAbdAb BPC1017和BPC1018以可比得上 抗体BPClO 19和BPC1020的活性结合重组人c_MET。显示阴性对照帕考珠单抗和 BPC1604(IGF-1R/VEGF mAbdAb)不结合 c-MET。32. 4. VEGF 结合 ELISA用PBS中的0.45 PgAilAVEGF(GSK)包被96孔高结合板，并在4°C孵育过夜。用 含0. 05%的Tween-20的Tris-缓冲的盐水(TBST)洗涤板2次。将100 μ L封闭液(含1 % BSA的TBST缓冲液)加入到各孔中，让板在室温孵育至少1小时。然后进行另一次洗涤步 骤。用封闭液在板中连续稀释纯化的抗体。室温孵育1小时后，洗涤板。将山羊抗-人κ 轻链特异性过氧化物酶缀合抗体在封闭液中以1 2000稀释，并加入到各孔中。让板在室 温孵育1小时。在另一洗涤步骤后，将OPD (邻苯二胺二盐酸盐)SigmaFast底物溶液加入 到各孔中，5分钟后通过加入25 μ L的3Μ硫酸使反应终止。用碱性终点方案用VersaMax Tunable微板读数器(Molecular Devices)在490nm处读取吸光度。图162显示ELISA结果，其确证抗体mAbdAb BPC1017和BPC1018结合重组人VEGF。 还显示阳性对照BPC1604结合重组人VEGF，然而显示帕考珠单抗、BPC1019和BPC1020不结 合 VEGF。实施例33含有抗~IL13dAb D0M10-53~546dAb 和 D0M10-53-567 的 mAbdAb33. 1.构津、表汰和纯化对示于表41的抗-IL4mAb-抗-IL13dAb进行克隆并在HEK2936E细胞中瞬时表达， 纯化(分别如实施例1、1. 3和1. 5所述)。表41
129 通过大小排阻色谱(SEC)和在还原条件下的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDS PAGE)分析纯化的 PascoH-TVAAPS-546 和 PascoH-TVAAPS-567mAbdAb。SEC 和 SDS PAGE数据示于图163、164、165和166中。33. 2.与 IL-13 和 IL-4 结合的 Biacore 分析用BIAcore TlOO 于 25°C (如方法 4 和 5 所述)检测纯化的 PascoH-TVAAPS-546 和PascoH-TVAAPS-567对人IL-13和人IL-4的结合。这些数据示于表42中。表42 在该测定中所测的二种mAbdAb都以极高亲和力(注意对于PascoH-TVAAPS-567 其亲和力超出了设备的灵敏度)结合IL-4，且所述结合亲和力与单独的抗-人IL4mAb (帕 考珠单抗)的结合亲和力相似。PascoH-TVAAPS-546和PascoH-TVAAPS-567 二者都结合 IL-13。注意在该测定中没有检测单独的抗-IL-13dAb (D0M10-53-546和D0M10-53-567)，因 为不能将该dAb捕获蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯片上；取而代之的是，在该测定中用 抗-人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。还用BIAcore TlOO于25°C (如方法23所述)检测这些mAbdAb对猕猴IL-13的 结合。这些数据示于表43中。mAbdAb捕获水平达到500和750相对响应单位之间，对于 mAbdAb 和抗-IL13mAb 二者都评估 6 个 IL-13 浓度曲线(256、64、16、4、1 和 0. 25nM)。表43[1124] PascoH-TVAAPS-546和PascoH-TVAAPS_567 二者都以相似的结合亲和力结合猕猴 IL-13。注意在该测定中没有检测单独的抗-IL-13dAb (D0M10-53-546和D0M10-53-567)，因 为不能将该dAb捕获到蛋白A或抗-人IgG包被的CM5芯片上；取而代之的是，在该测定中 用抗-人IL13mAb作为阳性对照以证明IL-13结合。33. 3.在TF-I细胞牛物测定中人IL-13和猕猴IL-13的中和在TF-I细胞生物测定(分别如方法8和方法20所述)中检测纯化的 PascoH-TVAAPS-546 和 PascoH-TVAAPS-567 对人 IL-13 和猕猴 IL-13 的中和。图 167 和 168 分别显示对人IL-13和猕猴IL-13(在TF-I细胞生物测定中)的中和数据。在这些生物测 定中包括D0M10-53-616作为中和IL-13的阳性对照。还包括对不相关抗原具有特异性的 dAb(阴性对照dAb)作为中和IL-13的阴性对照。另外，在这些测定中还检测PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616。在TF-I 细胞生物测定中，PascoH-TVAAPS-546 和 PascoH-TVAAPS-567 二者都完全 中和人和猕猴IL-13的生物活性。从数据集计算ND5tl值。ND5tl值是能够中和IL-13的生物活性到50%的mAbdAb或 mAb或dAb的浓度。平均ND5tl值、标准偏差(SD)和所测次数(η)示于表44中。表44 实施例34含IgG2、IrG4 和 ISG4PE 重链恒定区的 mAbdAb34. 1. mAbdAb 的构建[1135]通过PCR从现有构建体扩增人抗体同种型IgG2、IgG4和变体IgG4(IgG4PE)的重 链恒定区基因，并用标准分子生物学技术克隆到编码PascoH-GS-474重链(SEQ ID NO 48) 的表达载体。已设计并检测的mAbdAb抗体列入表45中。表45 34. 2.表汰表达了表45 中所述的 mAbdAb 连同命名为 BPC1000 的 PascoH-GS-474(SEQ ID NO: 48和15)。简言之，用先前与293fectin试剂(Invitrogen#51-0031)孵育的重链和轻链表 达质粒共转染含1. 5xl06细胞/ml的750 μ 1的ΗΕΚ293细胞。将这些置于37°C、5% CO2和 95% RH的震荡培养箱中。1小时后，加入蛋白胨养分培养基，让细胞再生长72小时。通过 离心收获上清液。34. 3. IL-4 结合 ELISA评估了含这些mAbdAb的上清液对重组人IL-4的结合。简言之，用人IL_4(由GSK 制备)以lPg/ml包被ELISA板，并用封闭液(Tris缓冲的盐水中的4% BSA)封闭。加入 各种稀释度的细胞上清液、抗IL-4单克隆抗体(帕考珠单抗)和不相关特异性的抗体(586 抗IL-13)。所有样品都用封闭液稀释。在用TBS+0.05% Tween 20 (TBST)洗涤前让板在室 温孵育1小时。通过加入在封闭液中以1/1000稀释的过氧化物酶标记的抗人κ轻链抗体 (Sigma A7164)来检测结合。在用TBST洗涤前让板在室温孵育1小时。通过加入OPD底 物(Sigma P9187)来使板显色，并通过加入3M H2SO4终止显色。在490nm处用板读数器测 量吸光度，作图确定平均吸光度。在图169中提供的结果显示含有备选同种型的mAbdAb都结合人IL-4。对于mAbdAb BPC1000、BPC1617、BPC1618和BPC1619而言，不能定量测定上清液中的抗体的量，因此，图 169提供的数据代表洁净上清液物质稀释倍数。对于抗-IL4和IL-13对照抗体而言，在该 测定中使用纯化的物质，所用的起始浓度分别为ι μ g/ml和1 μ g/ml (其等同于图169中的 稀释倍数1)。34. 4. IL-13 结合 ELISA评估了含这些mAbdAb的上清液对重组人IL-13的结合。简言之，用人IL-13 (由
GSK制备)以5μ g/ml包被ELISA板，并用封闭液(Tris缓冲的盐水中的4% BSA)封闭。加
入各种稀释度的细胞上清液、抗IL-13单克隆抗体(586)和不相关特异性的抗体(帕考珠单抗抗IL-4)。所有样品都用封闭液稀释。在用TBS+0. 05% Tween 20 (TBST)洗涤前让板 在室温孵育1小时。通过加入在封闭液中以1/1000稀释的过氧化物酶标记的抗人κ轻链 抗体(Sigma A7164)来检测结合。在用TBST洗涤前让板在室温孵育1小时。通过加入OPD 底物(Sigma P9187)来使板显色，并通过加入3M H2SO4终止显色。在490nm处用板读数器 测量吸光度，作图确定平均吸光度。在图170中提供的结果显示含有备选同种型的双特异性抗体都结合人IL-13。对 于双特异性抗体BPC1000、BPC1617、BPC1618和BPC1619而言，不能定量测定上清液中的抗 体的量，因此，图170提供的数据表示为净上清液物质稀释倍数。对于抗-IL4和IL-13对 照抗体而言，在该测定中分别以1 μ g/ml和1 μ g/ml的起始浓度(其等同于图170中的稀 释倍数1)使用纯化的物质。实施例35备诜抗-IL-13/IL-4mAbdAb35. 1.含备诜可变区序列的抗-IL-13/IL_4mAbdAb的构津用标准分子生物学技术将编码命名为“Cl”和“D1”的备选重链可变区 抗-IL-13mAb的DNA序列，从现有构建体转移到含有编码经由TVAAPSGS接头在恒定区c_末 端融合到抗IL-4结构域抗体(D0M9-112-210)的hlgGl恒定区的DNA的表达载体。从头开 始组装编码命名为“M0”和“NO”的IL-13mAb的备选轻链可变区的DNA序列，并克隆到含有 人Ck恒定区的表达载体。这些备选重链和轻链抗体可变区包含与SEQ ID N0:12和13所 述的抗-IL-13抗体相同的CDR区，但含有备选的人源化可变构架区。35. 2.用抗 IL-13mAb “656” 可变区构津 mAbdAb用标准分子生物学技术将编码人源化抗IL-13mAb “656”重链可变区的DNA序列， 从现有构建体转移并克隆到含有编码经由TVAAPS接头在恒定区C-末端融合到抗IL-4结 构域抗体(D0M9-112-210)的hlgGl恒定区的DNA的表达载体。将编码可变轻链区的DNA 序列从现有构建体转移并克隆到含有人Ck恒定区的表达载体。35. 3. mAbdAb 的表汰简言之，用先前与293fectin试剂(Invitrogen#51-0031)孵育的重链和轻链表达 质粒共转染25ml 1. 5xl06细胞/ml的HEK293细胞。将其置于37°C、5% CO2和95% RH的 振荡培养箱中。24小时后，加入蛋白胨养分培养基，让细胞再生长72小时。通过离心收获 上清液，并通过ELISA定量IgG水平。已构建并表达的抗体列举在表46中。表46 35. 4. mAbdAb 与 IL-13 的结合通过ELISA评估mAbdAb与IL-13的结合活性。简言之，将5μ g/ml大肠杆菌表达 的重组人IL-13(由GSK制备并纯化)包被到96孔ELISA板。于室温封闭孔2小时，然后 用滴定法测量板中的mAbdAb构建体。用1 1000稀释的抗-人κ轻链过氧化物酶缀合 抗体(货号A7164，Sigma-Aldrich)检测结合。图177显示所有测试分子都能够结合人IL-13。尽管在该ELISA中BPC1615显示结合，但不可能准确定量该分子的浓度，因此，在图177中未标出该分子的IL-13结合ELISA数据。在独立的Biacore测定(表47)中， BPC1615也显示具有与IL-13结合的高亲和力。35. 5.通过 BIAcorea 测定抗-IL13mAb_ 抗 _IL4dAb 与 IL-13 的结合也用BIAcore 于25°C (如方法4所述)检测来自HEK细胞转染的细胞上清液对 大肠杆菌表达的重组人IL-13的结合。BPC1601作为纯化的蛋白质被检测。表47所提供的 结合亲和力确证所有抗体显示与IL-13结合的高亲和力。表47 Kappa = κ，& =和实施例36产牛对人IL-5和人IL-13具有特异件的mAbdAb36. 1. mAbdAb的构津和表汰在HEK2936E细胞中表达了具有SEQ ID NO 65中所述的重链和SEQ ID NO 72中 所述的轻链的mAbdAb分子。其被命名为美泊利单抗L-G4S-474或BPC1021。36. 2.抗-IL5mAb-抗 _IL13dAb 与 IL-5 和 IL-13 的结合在直接结合ELISA(如方法1所述)中检测该mAbdAb (在细胞上清液中)对人 IL-13的结合。这些数据示于图173中。样品以一式二份被转染并检测，其被标注为样品A和样品B。该mAbdAb结合IL-13。在该测定中包括单独的纯化的抗-人IL13mAb作为IL-13 结合的阳性对照。包括纯化的抗_人IL-4mAb (帕考珠单抗)和抗-人IL-5mAb (美泊利单 抗)作为IL-13结合的阴性对照。还在直接结合ELISA (如实施例31. 4所述)中检测该mAbdAb对人IL_5的结合。 这些数据示于图174中。美泊利单抗L-G4S-474结合IL_5。包括纯化的抗-人IL4mAb (帕考珠单抗)和纯 化的抗人13mAb作为结合IL-5的阴性对照。在该测定中使用纯化的抗_人IL5mAb (美泊 利单抗)作为阳性对照以证明IL-5结合。序列表49:
1186]附图f1187]图I-'1 抗原结合构建体实例。1188]图8 :mAbdAb构建体示意图。1189]图9 PascoH-G4S-474 的 SEC 和 SDS Page 分析。1190]图10:PascoL-G4S-474 的 SEC 和 SDS Page 分析。1191]图11:PascoH-474 的 SEC 和 SDS Page 分析。1192]图12:PascoHL-G4S-474 的 SEC 和 SDS Page 分析。1193]图13在J[接结合ELISA中mAbdAb上清液对人IL-13的结合。1194]图14在J[接结合ELISA中mAbdAb上清液对人IL-4的结合。1195]图15在J[接结合ELISA中纯化的mAbdAb对人IL-13的结合。1196]图16在J[接结合ELISA中纯化的mAbdAb对人IL-4的结合。1197]图17在J[接结合ELISA中mAbdAb上清液对人IL-4的结合。1198]图18在J[接结合ELISA中mAbdAb上清液对人IL-13的结合。1199]图19在J[接结合ELISA中纯化的mAbdAb对人IL-4的结合。1200]图20A 在:直接结合ELISA中纯化的mAbdAb对人IL-13的结合。1201]图20B 在:直接结合ELISA中纯化的mAbdAb对猕猴IL-13的结合[1202]图21 用BIAcore 的mAbdAb对IL-4的结合动力学。图22 用BIAcore 的mAbdAb对IL-4的结合动力学。图23 用BIAcore 的mAbdAb对IL-13的结合动力学。图24 在TF-I细胞生物测定中纯化的抗-IL13mAb_抗_IL4dAb中和人IL-13的 能力。图25 在TF-I细胞生物测定中纯化的抗-IL13mAb_抗_IL4dAb中和人IL-4的能 力。图26 在 TF-I 细胞生物测定中纯化的抗-IL4mAb_ 抗-IL13dAbPascoH-G4S_474、 PascoH-474, PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 中和人 IL-4 的能力。图27 在 TF-I 细胞生物测定中纯化的抗-IL4mAb_ 抗-IL13dAb、PascoH-G4S_474、 PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 中和人 IL-13 的能力。图28 在双重中和TF-I细胞生物测定中纯化的抗-IL4mAb_抗_IL13dAb、 PascoH-G4S-474、PascoH-474、PascoL-G4S-474 和 PascoHL-G4S_474 同时中和人 IL-4 和人 IL-13的能力。图 29 :D0M10-53-474SEC-MALLSo图 30 :D0M9-112-210SEC-MALLSo图 31 :D0M9-155-25SEC-MALLS。图32 所有三种信号的D0M9-155-25SEC-MALLS重叠。图 33 :D0M9-155-147SEC-MALLS图 34 :D0M9-155-159SEC-MALLS用于通过SEC-MALLS确定MW的对照BSA。 三特异性mAbdAb分子的示意图。在直接结合ELISA中三特异性mAbdAb IL18mAb-210-474(上清液)对人图 35图 36图 37
IL-18的结合。图38 在直接结合ELISA中三特异性mAbdAb IL18mAb-210_474(上清液)对人 IL-13的结合。图39 在直接结合ELISA中三特异性mAbdAb IL18mAb-210_474(上清液)对人 IL-4的结合。
的结合。 [1222]
的结合。 [1229]
图40 在直接结合ELISA中三特异性mAbdAb Mepo-210-474 (上清液)对人IL-13
图41 在直接结合ELISA中三特异性mAbdAb M印ο_210_474 (上清液)对人IL-4
图 42 抗-TNF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的克隆。 图 43 抗-TNF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的 SDS-PAGE 分析。 图 44 抗-TNF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的 SEC 曲线(实施例 10)。 图45 实施例10的抗-EGFR活性。 图46 实施例10的抗-TNF活性。
图 47 抗-TNF/ 抗-VEGF mAb-dAb 的 SDS-PAGE 分析(实施例 11)， 图 48 抗-TNF/ 抗-VEGF mAb-dAb 的 SEC 曲线(实施例 11)。[1230]图49实施例11的抗-VEGF活性。[1231]图50实施例11的抗-TNF活性。[1232]图51抗-VEGF/抗-ILlRl dAb-延伸的-IgG的克隆(实施例12)。[1233]图52抗-TNF/抗-VEGF dAb-延伸的IgG A的SDS-PAGE分析(实施例12)[1234]图53抗-TNF/抗-VEGF dAb-延伸的IgG B的SDS-PAGE分析(实施例12)[1235]图54抗-TNF/抗-VEGF dAb-延伸的IgG A的SEC曲线(实施例12)。[1236]图55抗-TNF/抗-VEGF dAb-延伸的IgG B的SEC曲线(实施例12)。[1237]图56实施例12 (DMS2091)的抗-VEGF活性。[1238]图57实施例12 (DMS2090)的抗-VEGF活性。[1239]图58实施例12(DMS2090)的抗-ILlRl活性。[1240]图59实施例12(DMS2091)的抗-ILlRl活性。[1241]图60抗-TNF/ 抗-VEGF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的克隆(实施例 13)。[1242]图61抗-TNF/ 抗-VEGF/ 抗-EGFR mAb-dAb 的 SDS-PAGE 分析(实施例 13)。[1243]图62实施例13的抗-VEGF活性。[1244]图63实施例13的抗-TNF活性。[1245]图64实施例13的抗-EGFR活性。[1246]图65纯化的双特异性抗体 BPCl6O3 (A) ,BPC1604 (B) ,BPC1605 (C) ,BPC1606 (D)SEC分析。[1247]图66双特异性抗体与固定化的IGF-IR的结合。[1248]图67双特异性抗体与固定化的VEGF的结合。[1249]图68不同双特异性抗体对配体介导的受体磷酸化的抑制。[1250]图69不同双特异性抗体对配体介导的受体磷酸化的抑制。[1251]图70用抗-CD20/IL-13双特异性抗体进行ADCC测定。[1252]图71用抗-CD20/IL-13双特异性抗体进行ADCC测定。[1253]图72用较短的剂量范围用抗-CD20/IL-13双特异性抗体进行ADCC测定。[1254]图73用较短的剂量范围用抗-CD20/IL-13双特异性抗体进行ADCC测定。[1255]图74用抗-CD20/IL-13双特异性抗体进行CDC测定。[1256]图75用抗-CD20/IL-13双特异性抗体进行CDC测定。[1257]图76在重组人IGF-IR ELISA中BPC1803和BPC1804的结合。[1258]图77在重组VEGF结合ELISA中BPC1803和BPC1804的结合。[1259]图78在重组人IGF-IR ELISA中BPC1805和BPC1806的结合。[1260]图79在重组人HER2 ELISA中BPC1805和BPC1806的结合。[1261]图80在重组人IGF-IR ELISA中BPC1807和BPC1808的结合。[1262]图81在重组人HER2 ELISA中BPC1807和BPC1808的结合。[1263]图82在重组人IL-4ELISA中BPC1809的结合。[1264]图83在RNA酶A ELISA中BPC1809的结合。[1265]图84在重组人IL-4ELISA中BPC1816的结合。[1266]图85在 HEL ELISA 中 BPC1816 的结合。[1267]图86在重组人IGF-IR ELISA中BPC1801和BPC1802的结合。[1268]图87 [1269]图88 [1270]图88b[1271]图89 [1272]图89b[1273]图90 [1274]图91 [1275]图92 [1276]图93 [1277]图94 [1278]图95 的 SDS PAGE。[1279]图96
=还原条件]。
1280]图 97
1281]图 98
除去GS的PascoH-474的SEC曲线。
除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 的 SEC 曲线。
除去第二个 GS 的 PascoH-GS-ASTKGPT-474 的 SEC 曲线。
除去GS的586H-210的SEC曲线。
除去 GS 的 586H-TVAAPS-210 的 SEC 曲线。
除去 GS 的 PascoH-474 (B 泳道)和除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 (Α 泳道) 除去第二个 GS 的 PascoH-GS-ASTKGPT-474 的 SDS PAGE [A =非还原条件，B
除去 GS 的 586H-210 的 SDS PAGE (Α 泳道)。 除去 GS 的 586H-TVAAPS-210 的 SDS PAGE (Α 泳道)。
1282]图99 在人IL-4ELISA中纯化的除去GS的PascoH-474和除去GS的 PascoH-TVAAPS-474 的结合。
1283]图100 在人IL-13ELISA中纯化的除去GS的PascoH-474和除去GS的 PascoH-TVAAPS-474 的结合。
1284]图101 在猕猴IL-13ELISA中纯化的除去GS的PascoH-474、除去GS的 PascoH-TVAAPS-474、PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616 的结合。
1285]图102 通过ELISA测定mAbdAb抑制人IL-4与人IL_4Ra的结合。
1286]图103 通过ELISA测定mAbdAb抑制人IL-4与人IL_4Ra的结合。
1287]图104 在TF-I细胞生物测定中mAbdAb中和人IL-13。
1288]图105 在TF-I细胞生物测定中mAbdAb中和猕猴IL-13。
1289]图106 在TF-I细胞生物测定中mAbdAb中和人IL-4。
1290]图107 在TF-I细胞生物测定中mAbdAb中和猕猴IL_4。
1291]图108 :mAbdAb抑制人IL-13结合人IL_13Ra 2的能力。
1292]图 109 :PascoH-616 的 SEC 曲线。
1293]图 110 :PascoH-TVAAPS_616 的 SEC 曲线。
1294]图111 :PascoH-616的SDS PAGE[El =非还原性条件，E2 =还原性条件]。
1295]图112 :PascoH-TVAAPS-616 的 SDS PAGE[A =非还原性条件，B =还原性条件]。
1296]图 113 在人 IL-13ELISA 中纯化的 PascoH-616 和 PascoH-TVAAPS-616 的结合。
1297]图114 在TF-I细胞生物测定中mAbdAb中和人IL-13。
1298]图114a 在TF-1细胞生物测定中mAbdAb中和猕猴IL-13。
1299]图115 除去 GS 的 PascoH-474 抑制 IL-4 活性。
1300]图116 除去 GS 的 PascoH-474 抑制 IL-13 活性。
1301]图 117 :586-TVAAPS-210 抑制 IL—4 活性。[1302]图118:586-TVAAPS-210 抑制 IL-13 活性。[1303]图119帕考珠单抗抑制IL-4活性。[1304]图120:D0M9-112-210 抑制 IL-4 活性。[1305]图121抗-IL13mAb抑制IL-13活性。[1306]图122:D0M10-53-474 抑制 IL-13 活性。[1307]图123在IL-4全血测定中对照mAb和dAb的活性。[1308]图124在IL-13全血测定中对照mAb和dAb的活性。[1309]图125通过针对TNF及EGFR 二者的ELISA评估在给药后不同时间点的药物残留浓度。[1310]图126通过针对TNF及VEGF 二者的ELISA评估在给药后不同时间点的药物残留浓度。[1311]图127通过针对ILlRl及VEGF 二者的ELISA评估在给药后不同时间点的药物残留浓度。[1312]图128纯化的 DMS4010 的 SDS-PAGE。[1313]图129纯化的DMS4010的SEC曲线。[1314]图130:DMS4010 的抗-EGFR 效价。[1315]图131抗-VEGF受体结合测定。[1316]图132双重靶向的抗-EGFR/抗-VEGF mAbdAb的药代动力学曲线。[1317]图133纯化的DMS4011的SDS-PAGE分析。[1318]图134纯化的DMS4011的SEC曲线。[1319]图135:DMS4011 的抗-EGFR 效价。[1320]图136在抗-VEGF受体结合测定中的DMS4011。[1321]图137纯化的样品DMS4023和DMS4024的SDS-PAGE分析。[1322]图138:DMS4023 的 SEC 曲线。[1323]图139:DMS4024 的 SEC 曲线。[1324]图140 :mAbdAb DMS4023 的抗-EGFR 效价。[1325]图141在抗-VEGF受体结合测定中的DMS4023和DMS4024。[1326]图142纯化的DMS4009的SDS-PAGE分析。[1327]图143:DMS4009 的 SEC 曲线。[1328]图144 :mAbdAb DMS4009 的抗-EGFR 效价。[1329]图145抗-VEGF受体结合测定中的DMS4009。[1330]图146纯化的DMS4029的SDS-PAGE分析。[1331]图147:DMS4029 的 SEC 曲线。[1332]图148 :mAbdAb DMS4029 的抗-EGFR 效价。[1333]图149在基于IL-13细胞的中和测定中的DMS4029。[1334]图150纯化的样品DMS4013和DMS4027的SDS-PAGE分析。[1335]图151:DMS4013 的 SEC 曲线。[1336]图152:DMS4027 的 SEC 曲线。[1337]图153 :mAbdAb DMS4013 的抗-EGFR 效价。1338]图154 在抗-VEGF受体结合测定中的DMS4013。
1339]图155 在重组人IL-12ELISA中的BPC1616的结合。
1340]图156 在重组人IL-18ELISA中的BPC1616的结合。
1341]图157 在重组人IL-4ELISA中的BPC1616的结合。
1342]图 158 在重组人 IL-4ELISA 中的 BPC1008、1009 和 BPC1010 的结合。
1343]图159 在重组人IL-5ELISA中的BPC1008的结合。
1344]图 160 在重组人 IL-13ELISA 中的 BPC1008U009 和 BPC1010 的结合。
1345]图 161 在重组人 c-MET ELISA 中的 BPC1017 和 BPC1018 的结合。
1346]图162 在重组人VEGF ELISA中的BPC1017和BPC1018的结合。
1347]图 163 :PascoH-TVAAPS-546 的 SEC 曲线。
1348]图 164 :PascoH-TVAAPS-567 的 SEC 曲线。
1349]图 165 :PascoH-TVAAPS-546 的 SDS PAGE [A =非还原性条件，B =还原性条件]。
1350]图 166 :PascoH-TVAAPS-567 的 SDS PAGE [A =非还原性条件，B =还原性条件]。
1351]图167 在TF-I细胞生物测定中对人IL-13的中和数据。
1352]图168 在TF-I细胞生物测定中对猕猴IL-13的中和数据。
1353]图169 在人IL-4ELISA中含有备选同种型的mAbdAb的结合。
1354]图170 在人IL-13ELISA中含有备选同种型的mAbdAb的结合。
1355]图 171 在重组人 EGFR ELISA 中 BPC1818 和 BPC1813 的结合。
1356]图 172 在重组人 VEGFR2ELISA 中 BPC1818 和 BPC1813 的结合。
1357]图 173 在 IL-13ELISA 中抗-IL5mAb-抗-IL13dAb 的结合。
1358]图 174 在 IL-5ELISA 中抗-IL5mAb-抗-IL13dAb 的结合。
1359]图 175 在重组人 VEGFR2ELISA 中 BPC1812 的结合。
1360]图176 在重组人EGFR ELISA中BPC1812的结合。
1361]图 177 在人 IL-13ELISA 中 mAbdAb 的结合。
1362]1.结构域抗体
1363]SEQ ID NO 1 = D0M9-155-25
1364]DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTLDSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGffGPPTFGQGTKVEIKR
1365]SEQ ID NO 2 = D0M9-155-147
1366]DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLYEGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGffGPPTFGQGTKVEIKR
1367]SEQ ID NO 3 = D0M9-155-154
1368]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCLQEGffGPPTFGQGTKVEIKR
1369]SEQ ID NO 4 = D0M9-112-210
1370]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSS
1371]SEQ ID NO 5 = D0M10-53-474
1372]GVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 60 = D0M9-155-147 的 DNA 序列(蛋白质=SEQ IDNO 2)GACATCCAGATGACCCAATCACCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTtG CCGGGCAAGTCGCCCCATtAGCGACTGGTTACATtGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCCAAGCTCCTGATC GCCTGGGCGtCCTCGTTGTACGAGGGGGtCCCATCACGtTTCAGTGGCAGTGGGTCGGGGACAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCTGCAACCCGAAGATTTCGCTACGTACTACTGTTTGCAGGAGGGGTGGGGTCCTCCGACGTTC GGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGSEQ ID NO 61 = D0M9-155-154 的 DNA 序列(蛋白质=SEQ IDNO 3)GACATCCAGATGACCCAATCACCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTG CCGGGCAAGTCGCCCCATTAGCGACTGGTTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCCAAGCTCCTGATC GCCTGGGCGTCCAGCTTGCAGGGGGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGGTCGGGGACAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCTGCAACCCGAAGATTTCGCTACGTACTACTGTTTGCAGGAGGGGTGGGGTCCTCCGACGTTC GGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
1377]2.接头
1378]SEQ ID NO 6 = G4S 接头
1379]GGGGS
1380]SEQ IDNO :7=接头
1381]TVAAPS
1382]SEQ IDNO :8=接头
1383]ASTKGPT
1384]SEQ IDNO :9=接头
1385]ASTKGPS
1386]SEQ ID NO 10 =接头
1387]EPKSCDKTHTCPPCP
1388]SEQ ID NO :11 =接头
1389]ELQLEESCAEAQDGELDG
1390]3.单克隆抗体
1391]SEQ ID NO :12 =抗-人 IL 13mAb(H 链)
1392]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRV TITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGKSEQ ID NO 13 =抗-人 IL13mAb (L 链)DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISDRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[1395]SEQ ID NO 14 =帕考珠单抗(H 链)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 15 =帕考珠单抗(L 链)DIVLTQSPSSLSASV⑶RVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO 65 =美泊利单抗(H 链)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNSALMSRLSI SKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 66 =美泊利单抗(L 链)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNVHSFPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO :67 =抗-人 IL_18mAb (H 链)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGEISTGYYFHWVRQAPGKGLEWMGRIDPEDDSTKYAERFKDRV TMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTWRIYRDSSGRPFYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLYKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGKSEQ ID NO :68 =抗-人 IL_18mAb (L 链)DIQMTQSPSSVSASV⑶RVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC4.双特异性 mAbdAb注意，序列“粗体”文字的下划线部分对应于接头。“GS”氨基酸残基(其DNA编码 序列用作BamHI克隆位点)不以“粗体”文字表示，但下划线。SEQ ID NO 16 = 586H-25 (H 链)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K^gDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKRSEQ ID NO :17 = 586H-147(H 链)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K^gDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLYEGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKRSEQ ID NO 18 = 586H_154(H 链)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K^gDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASRPISDWLHWYQQKPGKAPKLLIAWASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCLQEGWGPPTFGQGTKVEIKRSEQ ID NO 19 = 586H_210(H 链)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 20 = 586H-G4S-25 (H 链)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV 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PascoL-TVAAPS-474 (L 链)DIVLTQSPSSLSASV⑶RVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTVAAP SGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 57 = PascoL-ASTKG-474 (L 链)DIVLTQSPSSLSASV⑶RVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECASTKG PTGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEffVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 58 = PascoL-EPKSC-474 (L 链)DIVLTQSPSSLSASV⑶RVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGIPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR
161EAKVQWKVDNALQSGNSQESV／EQDSKDS／YSLSS／L／LSKADYEKHKVYACEV／HQGLSSPV／KSFNRGEC旦￡丝巨，塑丝工旦工，￡￡，￡巨巨GVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAwYDMGwV尺QA尸GKGLEwVSS工DwHGEVTYYADSVKGRF／I SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYwGQGTLVTVSS[1495] SEQ工D N。59一PascoL—ELQLE一474(L链)[1496] D工VLTQSPSSLSASVGDRVT工TCKASQSVDYDGDSYMNwYQQKPGKAPKLL工YAASNLESG工PSRFSGSGSG／DF／F／ISSLQPED工ATYYCQQSNEDPPTFGQGTKVE工KRTVAAPSVF工FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV／EQDSKDS／YSLSS／L／LSKADYEKHKVYACEV／HQGLSSPV／KSFNRGEC旦LQL旦旦巨，A旦AQ塑巨旦L塑巨巨巨GVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAwYDMGwV尺QA尸GKGLEwVSS工DwHGEVTYYADSVKGRF／I SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYwGQGTLVTVSS[1497] 巨细胞国王[1498] SEQ工D N。62一工L一4(白介素一4)[1499] HKCDITLQEI工KTLNSLTEQKTLCTELTVTD工FAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKD[1500] TRCLGATAQQFHRHKQL工RFLKRLDRNLwGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKT工MREKY[1501] SKCSS[1502] SEQ工D N。63一工L—13(白介素一13)[1503]GPVPPSTALREL工EELVN工TQNQKAPLCNGSMVwS工NLTAGMYCAALESL工NVSGCSA工EKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTK工EVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN[1504] 巨值号庄型[1505] SEQ工D N。64一哺乳动物氨基酸信号序列[1506] MGWSCI工LFLVATATGVHS[1507] zI巨E二1旦结合，塑旦[1508] SEQ工D 80一VH CDR3[1509] w工LYYGRSKwYFDV[15]0] SEQ工D 8l—VH CDR2[15]]]N工NPNNGGTNYNQKFKD[15]2] SEQ工D 82一VH CDRl[15]3] DYYMN[15]4] SEQ工D 83一VL CDRl[15]5]RSSQS工VQSNGDTYLE[1516] SEQ工D 84一备选VL CDR2[15]7] RISNRFS[15]8] SEQ工D 85一VL CDR3[15]9] FQGSHVPY／[1520] SEQ工D 86一VL CDR2[1521] RVSNRFS[1522] 旦三挂昼性mAl)d丛GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GKGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGffVRQAPGKGLEffVSffllSSGTETYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 70 = IL18mAb-G4S-D0M10-53_474 (L 链)DIQMTQSPSSVSASV⑶RVTITCLASEDIYTYLTWYQQKPGKAPKLLIYGANKLQDGVPSRFSGSGSGT DYTLTISSLQPEDFATYYCLQGSKFPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGVQL LESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 71 = IL-5mAb-G4S_D0M9-112-210 重链QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNNSALMSRLS ISKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGG SEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 72 = IL-5mAb-G4S-D0M10-53_474 轻链DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKS SQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRF SGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNVHSFPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGG GGSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS 9.双重靶向的抗-TNF/ 抗-EGFR mAbdAbSEQ ID NO :73 =抗-TNFmAb (L 链)DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO :74 =抗-TNFmAb-D0M16-39_542 (H 链)EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTG
163DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQWIGNLLDWYQQKPGKAPKLLIYYASFLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQANPAPLTFGQGTKVEIKR10.双重靶向的抗-TNF/ 抗-VEGF mAbdAbSEQ ID NO :75 =抗-TNFmAb-DOMl5-26-593 (H 链)EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSTG EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSS11.双重靶向的抗-IL1R1/抗-VEGF dAb-延伸的IgGSEQ ID NO 76 = DOM 15-26_593_VH 假体(H 链) EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSY GAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 77 = D0M4-130-54_Vk 假体(L 链)DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQDIYLNLDWYQQKPGKAPKLLINFGSELQSGVPSRFSGSGYGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQPSFYFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSY LNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPNTFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC12.三重靶向的抗-TNF/ 抗-EGFR/ 抗-VEGF mAbdAbSEQ ID NO 78 = DOM 15-26-抗-TNFmAb (H 链)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLS CAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 79 = DOM 16-39-542-抗-TNFmAb (L 链)[1548]DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQWIGNLLDWYQQKPGKAPKLLIYYASFLQSGVPSRFSGSGYGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQANPAPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNY LAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQ ID NO 87 =除去 GS 的 586H_210(H 链)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGWVRQAPGKGLEWVSWIISSGTETYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 88 =除去 GS 的 586H-TVAAPS-210 (H 链)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KTVAAPSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGffVRQAPGKGLEffVSffllSSGTETYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 89 =两个 GS 都除去的 586H-ASTKGPT-210 (H 链)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KASTKGPTEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGffVRQAPGKGLEffVSffllSSGTETYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 90 =两个 GS 都除去的 586H-ASTKGPS-210 (H 链)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPANGNTKYVPKFQGRVT ITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
165GKASTKGPSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNFGMGffVRQAPGKGLEffVSffllSSGTETYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSLGRFDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 91 =除去 GS 的 PascoH_474(H 链)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGVQ LLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 92 =除去 GS 的 PascoH-TVAAPS-474 (H 链)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTVA APSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 93 =两个 GS 都除去的 PascoH-ASTKGPT-474 (H 链)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAST KGPTGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEffVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 94 =两个 GS 都除去的 PascoH-ASTKGPS-474 (H 链)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAST KGPSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEWVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 95 =除去第二个 GS 的 PascoH-ASTKGPS-474 (H 链)[1566]QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSA STKGPSGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEffVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 96 =除去第二个 GS 的 PascoH-ASTKGPT-474 (H 链)QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRL TISKDTSRNQWLTMT匪DPVDTATYYCARRETVFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSA STKGPTGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAWYDMGWVRQAPGKGLEffVSSIDffHGEVTYYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATAEDEPGYDYWGQGTLVTVSS
1569]SEQ ID NO97 =CDRH11570]GYSITSDFAWN1571]SEQ ID NO98 =CDRH21572]GYISYSGNYNPSLK1573]SEQ ID NO99 =CDRH31574]VTAGRGFPY1575]SEQ ID NO100 ==CDRL11576]HSSQDINSNIG1577]SEQ ID NO101 ==CDRL21578]HGINLDD1579]SEQ ID NO102 ==CDRL31580]VQYAQFPWT1581]SEQ ID NO103 ==EGFR表1582]CGADSYEMEEDGVRKC1583]SEQ ID NO104 ==CDRH11584]SDFAWN1585]SEQ ID NO105 ==CDRH21586]YISYSGNYNPSLK1587]SEQ ID NO106 ==CDRH31588]AGRGFPY1589]SEQ ID NO107 ==CDRH21590]YISYSGNYNPSLKS
167[1591]SEQ ID NO :108 =在 C-末端用 TVAAPSGS 接头与 D0M15-26-593 融合的抗-IGF-1R 抗体H0L0重链QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRV TMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KTVAAPSGSEVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEffVSEISPSGSYTYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 109 =在 C_ 末端用 GS 接头与 D0M15-26-593 融合的抗-IGF-1R 抗体 H0L0重链QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVT MTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP 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172CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSA RVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDASYALGSTCWYRKKSGEGNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDG GTYRCGLGVAGGYCDYALCSSRYAEC⑶GTAVTVNSEQ ID NO 132 抗 IL-4 重链-TVAAPSGS-抗 TNF_a adnectinCAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG 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186GACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAAGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGCGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCT GCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTCGACCGGTGACATCCAGA TGACCCAGAGCCCTTCAAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCCAGTGGATC GGCAACCTGCTGGACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCAGCTTCCTGCA GAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTACGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCG AGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGCCAACCCTGCCCCCCTGACCTTCGGCCAGGGTACCAAGGTGGAAATC AAACGGSEQ ID NO: 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189CCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCGGATCCACGGTGGCCGCCCCCAGCGAGGTGCAGCTGTTGGTGT CTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTAT CCGATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTTTCAGAGATTTCGCCTTCGGGTTCTTATAC ATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGA ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGTTAGACTACTGGGGTCAGGGA ACCCTGGTCACCGTCTCGAGCSEQ ID NO: 190DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGT DFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSTVAAPSE VQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 191QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQPPGKGLEWLGVIWASGGTDYNSALMSRLSI SKDTSRNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARDPPSSLLRLDYWGRGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO 192 :586H-ASTKG_210 重链CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAG GCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGG CACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGATGAGA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATC TACGACGACTACCACTACGACGACTACTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGC CAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCT GCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC TTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCAC CCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTG ACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACA GCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTG TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTAC ACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAG CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCG ATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCC GTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCAGCCAGCAC CAAGGGCCCCACGGGATCCGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGC
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GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC TAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGA GGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGA GCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTAT GATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGAC CTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGC CAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 216 :PascoH-TVAAPS_474 重链CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC TAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG
197TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGA GGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCG GCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGC TTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGA CTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACA CCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCC GGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO 217 :PascoL_474 轻链
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTTCCCTGAGCGCAAGCGTGGGCGATAGGGTGACC ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTAC CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAGTCA GGCATTCCCAGCAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACAATCAGC AGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCTCCC ACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTG ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGTGGATCC GGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTG AGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCC CCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTAC GCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTAC CTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAG GACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC SEQ ID NO 218 :PascoL-TVAAPS_474 轻链
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCTCTTCCCTGAGCGCAAGCGTGGGCGATAGGGTGACC ATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAGCGTGGACTACGACGGCGACAGCTACATGAACTGGTAC CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTCGAGTCA GGCATTCCCAGCAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACAATCAGC AGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCAACGAGGACCCTCCC ACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTG ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCACCGTG GCCGCCCCCTCGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCC[1840] GGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATG [1841 ] GGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCC TGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO :219 :IL-5mAb-G4S-D0M9-112_210 重链CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACACAGACCCTCACTCTGACCTGCACC GTGAGCGGCTTCAGCCTGACCTCCTACAGCGTCCACTGGGTGAGGCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGG CGTGATCTGGGCAAGCGGCGGCACCGACTACAACAGCGCCCTGATGAGCAGGCTCTCCATCAGCAAGGACACCAGCC GGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCCACCTATTACTGCGCCAGGGACCCTCCC TCTAGCCTGCTGAGGCTGGACTACTGGGGCAGGGGAACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAG CGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACT TCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAG AGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAA CGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCC CCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATG ATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCT GCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAG AGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG TACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCT GCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGGCGGCGGATCCGAAGTGCAGCTCCTGG AGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAAC TTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGA GACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGA TGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGACAG GGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO :220 :IL-5mAb-G4S-D0M10-53_474 轻链GACATCGTGATGACCCAGTCTCCCGATTCACTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTCCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC [1851 ] TGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTATGGCGCCTCCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCAGACAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGTCCACAGCTTCCCCTTCACCTTCGGCGGGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTG[1857]CAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGC[1858]CTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGT[1859]GAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC[1860]GGCGGCGGCGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGC[1861]GGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGC[1862]TGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGG[1863]GAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGC[1864]AAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTAC[1865]TGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGG[1866]GCCAGGGCACCCTGGTGACT[1867]GTGAGCAGC[1868]SEQ ID NO 221 :586H_210 重链(除去 GS)[1869]CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAG
GCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGG CACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGATGAGA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATC TACGACGACTACCACTACGACGACTACTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGC CAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCT GCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC TTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCAC CCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTG ACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACA GCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTG TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTA CACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGC GATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTC CGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGAAGTGCAGCTCC TGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGG AACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCAC CGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGC AGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGA CAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 222 :586H-TVAAPS_210 重链(除去 GS)CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAG GCCTCCGGCTTCTACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTCAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGG CACTATCGACCCCGCCAACGGCAACACCAAGTACGTGCCCAAGTTCCAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGATGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGAGCATC TACGACGACTACCACTACGACGACTACTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTGTCTAGCGC CAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCT GCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC TTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCAC CCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTG ACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAG CCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACA GCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTG TCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTA CACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGC GATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTC CGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCC CCTCGGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCT AGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTG GATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCA AGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGC AGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGC
1872
1873
1874
1875
1876
1877
1878
1879
1880 1881 1882
1883
1884
1885
1886
1887
1888
1889
1890
SEQ ID NO 223 :PascoH_474 重链(除去 GS)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT
201GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC
ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT
GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA
TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC
ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGA
GGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTC
GCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCC
AGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACC
ATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAG
GACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGC
CAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGC
SEQ ID NO 224 :PascoH-TVAAPS_474 重链(除去 GS)
CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTG
ACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGG
CAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGG
TACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG
GTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG
GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCC
AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGC
GGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG
TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGC
AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG
ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAG
CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGA
GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACC
CCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAAC
TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC
AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGC
AAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATC
AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT
GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGAC
ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT
GTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA
TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTAC
ACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGCGTGCAG
CTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCC
GCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAG
GGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGC
GTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATG[1930]AACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 225 :PascoH-ASTKGPT_474 重链(除去第二个 GS)CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGGGAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTG [1941 ]TCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT [1951 ]GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCAGCCAGCACCAAGGGCCCCACGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO :226 在 C-末端用 TVAAPSGS 接头与 D0M15-26-593 融合的抗-IGF-1R 抗体HOLO的重链CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC
203CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC CTACATCTgTAaCgTgAACcACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGG GATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCT AGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGA GATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCA AGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGG AAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO :227 :IGFlRmAb-GS-D0M15-26_593 重链CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC CTACATCTgTAaCgTgAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGAGGTGCAGCTCC 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CTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGSEQ ID NO :229 用 TVAAPSGS 接头在 C-末端与 D0M15-26-593 融合的抗-IGF-1R 抗体HOLO的轻链GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGC AGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCC CCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCG ACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCC TACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAG CGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGC AGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCA CCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAGG TGCAGCTCCTGGTCAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTC ACCTTCAAGGCCTACCCCATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCC CAGCGGCAGCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCC TGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGAC TATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO :230 用 GS 接头在 C-末端与 D0M15-26-593 融合的抗-IGF-1R 抗体
205HOLO的轻链GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGC AGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCC CCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCG ACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCC TACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAG CGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGC AGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCA CCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGTGGATCCGAGGTGCAGCTCCTGGTCAGCG GCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGAGGCTCACTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAAGGCCTACCCC ATGATGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGTCTGAGATCAGCCCCAGCGGCAGCTACACCTA CTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACT CTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACCCCAGGAAGCTGGACTATTGGGGCCAGGGCACT CTGGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO 231 抗-IGF-1R 抗体轻链GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGC AGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCC CCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCG ACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCC TACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAG CGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGC AGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACC TACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCA CCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCSEQ ID NO 232 抗-IGFlR 重链-GS-TLPCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC CTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC
206AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGACGGCGGCGGCA TTAGGAGGAGCATGAGCGGCACCTGGTACCTGAAGGCCATGACCGTGGATAGGGAGTTCCCCGAGATGAACCTGGAG AGCGTGACCCCCATGACACTGACCCTGCTCAAGGGCCACAACCTGGAGGCCAAGGTCACCATGCTGATCTCAGGCAG GTGCCAGGAGGTGAAGGCAGTGCTGGGCAGGACCAAGGAGAGGAAGAAGTACACCGCCGACGGGGGCAAGCACGTGG CCTATATCATCCCCAGCGCCGTGAGGGACCACGTGATCTTCTACAGCGAGGGCCAGCTCCACGGAAAGCCCGTGAGA GGCGTGAAGCTGGTGGGCAGGGACCCCAAGAACAACCTGGAGGCCCTGGAGGACTTCGAAAAAGCCGCAGGCGCCAG GGGCCTGTCCACTGAGAGCATCCTGATCCCTAGGCAGAGCGAGACCTGCAGCCCCGGCSEQ ID NO :233 抗-IGFlR 重链-GS-CTOl adnectinCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC CTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGAGGTGGTGGCCG CCACCCCCACCAGCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTACTACAGGATCACCTACGGCGAG ACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGCCACCATCAGCGGCCTCAAGCC CGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCA TCAACTACAGGACCSEQ ID NO 234 抗-IGF IR 重链-TVAAPSGS-TLPCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC
CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG
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AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT
GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGG
GATCCGACGGCGGCGGCATTAGGAGGAGCATGAGCGGCACCTGGTACCTGAAGGCCATGACCGTGGATAGGGAGTTC
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AAAAGCCGCAGGCGCCAGGGGCCTGTCCACTGAGAGCATCCTGATCCCTAGGCAGAGCGAGACCTGCAGCCCCGGC SEQ ID NO 235 抗-IGFlR 重链-GS-AFFI CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA GCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATC CTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCAC CAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCC GCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGAC CTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGA CCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAG GACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCT ACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAAC AAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCT GCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGC AGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGTGGACAACAAGTTCAACAAGGAGCTGAGGCAGGCCTACTGGGAGATCCAGGCCCTGCCCAATCTGAACTGGACCCAGAGCAGGGCCTTC ATCAGGAGCCTGTACGACGACCCCAGCCAGAGCGCTAACCTCCTGGCCGAGGCCAAAAAGCTGAACGACGCCCAGGC CCCCAAGSEQ ID NO 236 抗-IGF1R 重链-TVAAPSGS-AFFICAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGG CAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCA 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210GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC TAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC 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212CGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGT CTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGCCCTGCCT GCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAG AGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTG TACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCT GCACAATCACTACACCCAGAAGAGTCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAGAGATCCGAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCA GCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTACTACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAAC AGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGCCACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTA CACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGCTGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGA CCSEQ ID NO 243 爱必妥轻链GACATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTGAGCGTGAGCCCTGGCGAGAGAGTGAGCTTCAGCTGC CGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAA 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adnectin-GSTG-爱必妥重链GAGGTGGTGGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATTTCCTGGAGGCACCCCCACTTCCCCACACGCTAC TACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGC CACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGC TGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACCGGATCCACCGGCCAGGTGCAGCTGAAGCAGAGCGGCCCTGGC CTGGTGCAGCCCTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGTACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCAATTACGGCGTGCATTG GGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGTCCGGCGGCAACACCGACTACAACACCC CCTTCACCAGCAGACTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGC AACGACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCAC CCTGGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCG GCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCC CTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGT GCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAAGTGGACAAGA 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214TACAGGATCACCTACGGCGAGACCGGCGGCAACAGCCCCGTGCAGGAGTTCACCGTGCCCCTGCAGCCTCCCACTGC CACCATCAGCGGCCTCAAGCCCGGCGTGGACTACACCATCACCGTGTACGCCGTCACCGACGGAAGGAACGGCAGGC TGCTGAGCATCCCCATCAGCATCAACTACAGGACGTCGACCGGTGACATCCTGCTGACCCAGAGCCCCGTGATCCTG AGCGTGAGCCCTGGCGAGAGAGTGAGCTTCAGCTGCCGGGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCA GCAGCGGACCAACGGCAGCCCCAGGCTGCTGATCAAGTACGCCAGCGAGTCCATCAGCGGCATCCCCAGCCGGTTCA GCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGATATCGCCGACTACTACTGC CAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAG CGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTCAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCT ACCCCCGGGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAG CAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGT GTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCSEQ ID NO 248 (PascoH-616 重链)CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTG [2011 ] 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ID NO 249 (PascoH-TVAAPS-616 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217[2082]CCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGTGTTCCCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGAAGGGGGGCAAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ 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ID NO 255 (PascoH_567_ 重链)CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACCTTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATACCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG[2138]GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAA 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220GGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAASEQ ID NO 257 抗 IL-5 重链-G4S-dAb474-TVAAPSGS_dAb210CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACACAGACCCTCACTCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCTCCTACAGCGTCCACTGGGTGAGGCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGCAAGCGGCGGCACCGACTACAACAGCGCCCTGATGAGCAGGCTCTCCATCAGCAAGGACACCAGCCGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCCACCTATTACTGCGCCAGGGACCCTCCCTCTAGCCTGCTGAGGCTGGACTACTGGGGCAGGGGAACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGCGGCGGCGGATCTGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTG[2199]GGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 258 抗 CD-20 重链-TVAAPSGS-dAbl54-TVAAPSGS_dAb474CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTCGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCCGGCAACGGCGACACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTCTGGGGCGCCGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAG [2211 ]ACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATTACCTGCAGGGCCAGCAGGCCCATCAGCGACTGGCTGCACTGGTACCAACAGAAGCCCGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCGCCTGGGCCAGCAGCCTGCAGGGAGGCGTGCCCAGCAGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACCATCTCTTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGGAGGGCTGGGGGCCCCCTACTTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 259 抗 CD-20 重链-TVAAPSGS-dAb210-TVAAPSGS_dAb474CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAATG
222[2238]TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCAGGGGCCTCGAGTGGATCGGAGCTATCTACCCCGGCAACGGCGACACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTCTGGGGCGCCGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCTGAAGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGGAACTTCGGCATGGGCTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCAGCTGGATCATCAGCTCCGGCACCGAGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAGAGCCTGGGCAGGTTCGACTACTGGGGACAGGGGACCCTGGTGACTGTGAGCAGCACCGTGGCCGCCCCCTCGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ 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225[2333]TATTGGGGCCAGGGCACTCTGGTGACCGTGAGCAGCSEQ ID NO 264 抗 cMET 5D5V2 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TGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCC ATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGA AATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAA CCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAGGCC TGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGCTGG GTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGCCGA CAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGG CCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTG GTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 268 :PascoH IgG4_GS_474 重链CAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACAC CTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCA GCTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC AGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGC TCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGA 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228CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACAC CTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCC CCTGCCCTGCCCCCGAGTTCGAGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC AGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGC TCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGA AGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTAC AGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGGGATCCGGCGTGCAGCTCCTGGAGAGCGGCGGAG GCCTGGTCCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGCCTGGTATGATATGGGC TGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATCGACTGGCACGGGGAGGTGACCTACTACGC CGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGA GGGCCGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCGCCACCGCCGAGGACGAACCCGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACC CTGGTGACTGTGAGCAGCSEQ ID NO 270 抗 IL-4 重链-GS-抗 TNF_a adnectinCAGGTGACCCTGAGGGAGAGCGGCCCCGCCCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACC TTCAGCGGCTTTAGCCTCAGCACCTCCGGCATGGGCGTGAGCTGGATCAGGCAGCCACCCGGCAAAGGCCTGGAGTG GCTGGCCCACATCTACTGGGACGACGACAAGAGGTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCAGCAAGGATA CCAGCAGGAACCAGGTGGTGCTGACCATGACCAACATGGACCCCGTGGACACCGCTACCTACTACTGCGCCAGGAGG GAGACCGTCTTCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGAAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTG CTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACAT CTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACA CCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACC CTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCC TAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGA GGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGGGATCCGTGAGCGACGTGCCAAGGG ACCTCGAGGTGGTGGCAGCCACTCCCACCTCTCTGCTGATCAGCTGGGACACACACAACGCCTACAACGGCTACTAC AGGATCACCTACGGAGAGACCGGCGGCAATAGCCCCGTGAGGGAGTTCACCGTGCCCCACCCCGAGGTGACCGCCAC CATTAGCGGCCTGAAGCCCGGCGTGGACGATACCATCACCGTCTACGCCGTGACCAACCACCACATGCCCCTGAGGA TCTTCGGCCCCATCAGCATCAACCATAGGACC
229
权利要求
抗原结合构建体，所述抗原结合构建体包含连接到一个或多个表位结合结构域的蛋白质骨架，其中所述抗原结合构建体具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个来自表位结合结构域，并且其中至少一个来自配对的VH/VL结构域。
2.抗原结合构建体，所述抗原结合构建体包含至少一个包含两个或更多个式I结构的 同型二聚体 其中X代表包含重链恒定结构域2和重链恒定结构域3的抗体恒定区；R1、R4、R7和R8代表独立选自表位结合结构域的结构域；R2代表选自重链恒定结构域1和表位结合结构域的结构域；R3代表选自配对的VH和表位结合结构域的结构域；R5代表选自轻链恒定结构域和表位结合结构域的结构域；R6代表选自配对的VL和表位结合结构域的结构域；η代表独立选自以下的整数0、1、2、3和4 ；m代表独立选自以下的整数0和1 ；其中重链恒定结构域1与轻链恒定结构域相连接；并且其中存在至少一个表位结合结构域；当R3代表配对的VH结构域时，R6代表配对的VL结构域，由此两个结构域一起能够结 合抗原。
3.权利要求2的抗原结合构建体，其中R6代表配对的VL并且R3代表配对的VH。
4.权利要求3的抗原结合构建体，其中R7和R8中的任一个或两个代表表位结合结构域。
5.权利要求2-4中任一项的抗原结合构建体，其中R1和R4中的任一个或两个代表表 位结合结构域。
6.权利要求2-4中任一项的抗原结合构建体，其中存在R4。
7.权利要求2-6中任一项的抗原结合构建体，其中R1R7和R8代表表位结合结构域。
8.权利要求2-6中任一项的抗原结合构建体，其中R1R7和R8、和R4代表表位结合结构域。
9.前述权利要求中任一项的抗原结合构建体，其中至少一个表位结合结构域为dAb。
10.权利要求9的抗原结合构建体，其中所述dAb为人dAb。
11.权利要求9的抗原结合构建体，其中所述dAb为骆驼dAb。
12.权利要求9的抗原结合构建体，其中所述dAb为鲨鱼dAb(NARV)。
13.权利要求1-8中任一项的抗原结合构建体，其中至少一个表位结合结构域源自选 自以下的骨架CTLA-4 (Evibody)；脂质运载蛋白；源自蛋白A的分子，例如蛋白A的Z-结构 域(Affibody，SpA)、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白，例如 GroEl 和 GroES ；转 铁蛋白(trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连凝集 素)；人Y-晶体蛋白和人泛素(affilin) ；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂蝎毒素kimitz型 结构域；和纤连蛋白(adnectin)。
14.权利要求13的抗原结合构建体，其中所述表位结合结构域来源于选自Affibody、 锚蛋白重复蛋白(DARPin)和adnectin的骨架。
15.权利要求1-8中任一项的抗原结合构建体，其中所述表位结合结构域选自dAb、 Affibody、锚蛋白重复蛋白(DARPin)和 adnectin。
16.前述权利要求中任一项的抗原结合构建体，其中所述结合构建体对不止一种抗原 具有特异性。
17.前述权利要求中任一项的抗原结合构建体，其中所述第一结合位点对抗原上的第 一表位具有特异性，所述第二结合位点对同一抗原上的第二表位具有特异性。
18.前述权利要求中任一项的抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体能够结合 IL-13。
19.前述权利要求中任一项的抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体能够结合两 种或更多种选自IL-13、IL-5和IL-4的抗原。
20.权利要求19的抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体能够同时结合IL-13和 IL-4。
21.前述权利要求中任一项的抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体能够结合两 种或更多种选自VEGF、IGF-IR和EGFR的抗原。
22.前述权利要求中任一项的抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体能够结合TNF。
23.权利要求22的抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体能够结合TNF和IL1-R。
24.权利要求1或9-23中任一项的抗原结合构建体，其中所述蛋白质骨架为Ig骨架。
25.权利要求24的抗原结合构建体，其中所述Ig骨架为IgG骨架。
26.权利要求25的抗原结合构建体，其中所述IgG骨架选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。
27.权利要求1或9-26中任一项的抗原结合构建体，其中所述蛋白质骨架包括单价抗体。
28.权利要求25-27中任一项的抗原结合构建体，其中所述IgG骨架包含抗体的所有结 构域。
29.权利要求9-12或15-28中任一项的抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体包 含四个结构域抗体。
30.权利要求29的抗原结合构建体，其中两个结构域抗体对同一抗原具有特异性。
31.权利要求29的抗原结合构建体，其中所有结构域抗体对同一个抗原具有特异性。
32.前述权利要求中任一项的抗原结合构建体，其中至少一个单一可变结构域通过接 头直接连接到Ig骨架，所述接头包含1-150个氨基酸。
33.权利要求32的抗原结合构建体，其中至少一个单一可变结构域通过接头直接连接 到Ig骨架，所述接头包含1-20个氨基酸。
34.权利要求33的抗原结合构建体，其中至少一个表位结合结构域通过接头直接连接 到所述Ig骨架，所述接头选自以下任一种SEQ ID N0:6-ll中所述的接头或“GS”或其任 思组合。
35.前述权利要求中任一项的抗原结合构建体，其中至少一个表位结合结构域结合人 血清白蛋白。
36.权利要求21-33中任一项的抗原结合构建体，所述抗原结合构建体包含在轻链的 N-末端连接到Ig骨架的表位结合结构域。
37.权利要求21-33中任一项的抗原结合构建体，所述抗原结合构建体包含在重链的 N-末端连接到Ig骨架的表位结合结构域。
38.权利要求21-33中任一项的抗原结合构建体，所述抗原结合构建体包含在轻链的 C-末端连接到Ig骨架的表位结合结构域。
39.权利要求21-33中任一项的抗原结合构建体，所述抗原结合构建体包含在重链的 C-末端连接到Ig骨架的表位结合结构域。
40.权利要求1或2的抗原结合构建体，所述抗原结合构建体具有4个抗原结合位点并 能够同时结合4个抗原。
41.用于药物的前述权利要求中任一项的抗原结合构建体。
42.用于制备治疗癌症或诸如哮喘、风湿性关节炎或骨关节炎等炎性疾病的药物的前 述权利要求中任一项的抗原结合构建体。
43.治疗罹患癌症或诸如哮喘、风湿性关节炎或骨关节炎等炎性疾病的患者的方法，所 述方法包括给予治疗量的前述权利要求中任一项的抗原结合构建体。
44.用于治疗癌症或诸如哮喘、风湿性关节炎或骨关节炎等炎性疾病的前述权利要求 中任一项的抗原结合构建体。
45.编码权利要求1-40中任一项的抗原结合构建体的重链的多核苷酸序列。
46.编码权利要求1-40中任一项的抗原结合构建体的轻链的多核苷酸。
47.经转化或转染的重组宿主细胞，所述宿主细胞包含一个或多个编码前述权利要求 中任一项的抗原结合构建体的重链和轻链的多核苷酸序列。
48.用于制备权利要求1-40中任一项的抗原结合构建体的方法，所述方法包括培养权 利要求47的宿主细胞和分离所述抗原结合构建体的步骤。
49.药用组合物，所述药用组合物包含权利要求1-38中任一项的抗原结合构建体和可 药用载体。
全文摘要
本发明涉及抗原结合构建体、制备所述构建体的方法及所述构建体的用途，所述抗原结合构建体包含连接一个或多个表位结合结构域的蛋白质骨架，其中所述抗原结合构建体具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个来自表位结合结构域，其中至少一个来自配对的VH/VL结构域。
文档编号C07K16/24GK101932608SQ200880126310
公开日2010年12月29日 申请日期2008年11月28日 优先权日2007年11月30日
发明者A·路易斯, C·阿什曼, F·侯赛因, J·H·艾利斯, L·耶斯珀斯, M·A·奥雷基亚, M·N·伯登, M·斯图尔德, P·A·汉布林, R·M·德威尔德特, R·夏, S·J·克莱格, T·巴图万加拉 申请人:葛兰素集团有限公司