并且用50%乙酸水溶液（3X30ml，分成多个部分）从树脂中提取产 物。HPLC分析显示在混合物中存在870mg(0.70毫摩尔）标题产物（96%纯度，在无梯度 HPLC系统上）。
[0096] D)H-D-β -Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2
[0097] 在氮气氛中，将得自步骤C的500mg(0. 40毫摩尔）肽溶于300ml4%乙酸中并加热 至约55°C。快速搅拌溶液，并且以一个部分添加碘在7. 7ml Me0H(0. 60毫摩尔）中的2%w/ V溶液。搅拌混合物约15分钟，接着通过用2%硫代硫酸钠溶液滴定至无色终点（?2ml) 而结束。将混合物冷却至室温并过滤。将粗混合物在C8填料（YMC，Inc.，Wilmington，NC) 上用0. 1乙酸铵/乙腈梯度缓冲液通过制备色谱提纯，在YMC C8填料上用0. 25N乙酸/乙 腈梯度脱盐，以及冻干，以得到350mg 99%纯度的所需的肽。
[0098] 从上面描述，本领域的技术人员能够容易地确定本发明的必要特征，并且在不偏 离其精神和范围的条件下，能够完成本发明的各种改变和修改以使它适应各种用途和条 件。因而，其它实施方案也落在权利要求内。
【主权项】
1. 一种用于制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽的方法，该肽具有N-端氨基酸、邻 近该N-端氨基酸的倒数第二个氨基酸和C-端氨基酸，其中所述方法包括如下步骤： (a) 通过酯键把第一氨基酸连到固体载体树脂上，以形成第一级偶联产物，其包括（i) 使碳酸铯的水溶液与第一氨基酸的醇溶液反应，以形成第一氨基酸的铯盐，（ii)获得第一 氨基酸的无溶剂铯盐，（iii)在干的极性非质子溶剂中使固体载体树脂与第一氨基酸的铯 盐反应，以形成第一级偶联产物； 其中第一氨基酸与肽的C-端氨基酸对应，第一氨基酸的非侧链氨基被Boc封闭并且第 一氨基酸没有需要保护的侧链官能团，以及固体载体树脂为氯甲基化的聚苯乙烯树脂； (b) 利用酸从第一级偶联产物中解封闭Boc，以形成第一级解封闭的偶联产物； (c) 任选地把下一个氨基酸偶联到第一级解封闭的偶联产物上，其包括在包含肽偶联 试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与第一级解封闭的偶联产物反应，以形成下一级封闭的 偶联广物， 其中下一个氨基酸具有被Boc封闭的非侧链氨基，并且如果下一个氨基酸具有一个或 更多个侧链官能团，那么侧链官能团不需要保护，或者侧链官能团具有对于分别用来解封 闭Boc和Fmoc的酸试剂和碱试剂稳定的保护基团； (d) 从下一级封闭的偶联产物中解封闭Boc，其包括使下一级封闭的偶联产物与酸反 应，以得到下一级解封闭的偶联产物； (e) 任选地重复步骤（c)和（d)，每个循环形成（X+1)级的下一级解封闭的偶联产物， 其中X为所需的循环重复次数； (f) 把下一个氨基酸偶联到得自（b)的第一级解封闭的偶联产物上，或者任选地偶联 到得自（e)的（X+1)级的下一级解封闭的偶联产物上，其包括在包含肽偶联试剂的有机溶 剂中使下一个氨基酸与所述第一级解封闭的偶联产物或所述（X+1)级的下一级解封闭的 偶联产物反应，以形成下一级封闭的偶联产物，其中下一个氨基酸具有被Fmoc封闭的非侧 链氨基，条件是如果下一个氨基酸具有一个或更多个侧链官能团，那么侧链官能团不需要 保护，或者侧链官能团具有对于用来解封闭Fmoc的碱试剂稳定的保护基团； (g) 从下一级封闭的偶联产物中解封闭Fmoc，其包括使下一级封闭的偶联产物与伯胺 或仲胺反应，以得到下一级解封闭的偶联产物； (h) 任选地重复步骤（f)和（g)，每个循环形成（X+1)级的下一级解封闭的偶联产物， 其中X为所需的循环重复次数，直到肽的倒数第二个氨基酸被偶联和解封闭； (i) 把N-端氨基酸偶联到（X+1)级的下一级解封闭的偶联产物上，其包括在包含肽偶 联试剂的有机溶剂中使N-端氨基酸与（X+1)级的下一级解封闭的偶联产物反应，以形成完 成的封闭的偶联产物，其中N-端氨基酸具有被Boc或Fmoc封闭的非侧链氨基； (j) 从完成的封闭的偶联产物中解封闭Boc或Fmoc基团，其包括在Boc的情况下使完 成的封闭的偶联产物与酸反应，或者在Fmoc的情况下与碱反应，以形成完成的肽-树脂产 物； (k) 如果侧链官能团存在于完成的肽-树脂产物上，那么任选地脱保护完成的肽-树脂 产物的侧链官能团，其包括使完成的肽_树脂产物与适当的脱保护试剂反应，以形成脱保 护的完成的肽-树脂产物；及 (l) 使肽与完成的肽-树脂产物或脱保护的完成的肽-树脂产物的固体载体树脂断裂， 以得到肽，其包括使完成的肽-树脂产物或脱保护的完成的肽-树脂产物与氨、伯胺或仲胺 反应，直到肽与树脂的断裂基本上完成， 条件是在肽的合成中，步骤（f)和（g)必须进行至少一次。
2. 根据权利要求1的方法，其中步骤⑴的氨、伯胺或仲胺在包含醇并且任选包含非质 子极性溶剂的溶剂中。
3. 根据权利要求1的方法，其中步骤（1)进一步包括下列步骤： (i) 从溶剂中沉淀出断裂的肽； (ii) 过滤固体载体树脂和沉淀出来的肽；及 (iii) 在酸溶液中提取肽，以离析肽。
4. 根据权利要求1的方法，其中第一氨基酸为Boc-L-Thr。
5. 根据权利要求4的方法，其中第一氨基酸为得到Boc-L-Thr-树脂作为第一级偶联产 物的Boc-L-Thr-铯盐，并且H-L-Thr-树脂为第一级解封闭的偶联产物。
6. 根据权利要求5的方法，其中步骤（j)中用来解封闭Boc基团的酸为TFA。
7. 根据权利要求6的方法，其中有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或二甲基甲酰胺，并且肽偶 联试剂为二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺或N-乙基-N' -(3-二甲基-氨基丙基）碳 二亚胺。
8.根据权利要求7的方法，其包括在式H-L-Thr-树脂的第一级解封闭的偶联产物形成 之后，进行步骤（f)和（g)六次，其中按照这样的顺序偶联下列氨基酸：Fm〇C-L-CyS(Acm)、 Fmoc-L-Val、Fmoc-L-Lys(Boc)、Fmoc-D-Trp、Fmoc-L-Tyr(〇-t_Bu)和Fmoc-L-Cys(Acm)，以 形成H_Cys (Acm) -Tyr (〇-t_Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Thr-树脂。
9. 根据权利要求8的方法，其包括根据步骤⑴把Boc-D-13 -Nal偶联到!^^^!]!)-Tyr (〇-t_Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Thr-树脂上，以形成 Boc_D- 0 -Nal-Cys (Acm )-Tyr (〇-t_Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Thr-树脂。
10. 根据权利要求9的方法，其包括根据步骤（j)同时解封闭B〇C-D-f3-Nal-CyS(Acm )-Tyr (〇-t_Bu) -D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys (Acm) -Thr-树脂的封闭 D- 0 -Nal 的 Boc 基团、保 护 Tyr 的 0_t_Bu 基团和保护 Lys 的 Boc 基团，以得到式 H_D_ 0 -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp -Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-树脂的完成的肽-树脂产物。
11. 根据权利要求10的方法，其包括通过使H-D- 0 -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Va 1-Cys (Acm) -Thr-树脂与氨在包含醇并且任选包含非质子极性溶剂的溶剂中反应直到断裂 基本上完成，使肽，H-D-0 -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Th;r 与固体树脂 断裂，以得到 H-D- 0 -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr_NH2。
12. 根据权利要求11的方法，其中醇为甲醇并且极性非质子溶剂为二甲基甲酰胺。
13.根据权利要求12的方法，其包括通过使H-D- 0 -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Va l-CyS(ACm)-Thr-NH2与碘在醇中的溶液反应直到脱保护和环化基本上完成，同时脱保护保 护Cys的Acm基团并环化所得到的式H-D- 0 -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm )-Thr-NH2的完成的肽-树脂产物的脱保护的Cys残基，以得到H-D-0 -Nal-[Cys-Tyr-D-T rp-Lys-Val-Cys] -Thr-NH2〇
14. 根据权利要求 1 的方法，其中肽为H-D-0 -Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val_Cys]-Th r-NH2〇
15. 根据权利要求1的方法，其中肽为生长抑素类似物。
16. 根据权利要求1的用于制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽的方法，该肽具有 N-端氨基酸、邻近该N-端氨基酸的倒数第二个氨基酸和C-端氨基酸，该方法基本上如以上 所描述和例示。
【专利摘要】本发明公开了一种利用Boc和Fmoc保护的氨基酸两者及氯甲基化的聚苯乙烯树脂合成包含三个或更多个氨基酸残基的肽的固相方法。
【IPC分类】C07K1-10, C07K1-06, C07K7-06, C07K1-04
【公开号】CN104530190
【申请号】CN201410791044
【发明人】凯瑟琳·菲奥纳·多尔顿, 约翰·斯图尔特·艾农, 史蒂文·艾伦·杰克逊, 加里·亚历山大·西夫吕克
【申请人】爱尔兰伊普森制造有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2007年8月31日
【公告号】CA2670209A1, CA2670209C, CN101541824A, EP2084176A2, US8383770, US9090654, US20100160604, US20130338337, WO2008062391A2, WO2008062391A3