[0077] 然后，将解封闭的AA1-树脂任选地与任何所需数量的氨基酸偶联。如果随后的 氨基酸在α-氨基上被Fmoc保护（Fmoc-AA x),那么侧链基团必须或者不需要保护（如 Fmoc-Gly、Fmoc-Ala、Fmoc-Phe或Fmoc-苏氨酸），或者侧链必须由耐碱除去的基团保 护。利用在DCM/DMF混合物中的肽偶联试剂（如二异丙基碳二亚胺（DIC))，将摩尔过量的 Fmoc-AAx(其中X为肽中氨基酸的序号，从C-端计数）与解封闭的AA1-树脂偶联约60分 钟。偶联的树脂用DMF、醇和DCM漂洗，以得到Fm 0c-AAx-AA1-树脂。能够通过Kaiser茚三酮 方法检查偶联。Fmoc-AA x-AA1-树脂然后用DMF漂洗一次，接着用碱在有机溶剂中（如哌啶 在DMF中）的溶液解封闭，以得到AA x-AA1-树脂。AAx-AA1-树脂然后用DMF漂洗，接着用醇 (如MeOH)和DCM两者漂洗几次。AA x-AA1-树脂用DMF漂洗一次约3分钟，用异丙醇（IPA) 漂洗三次优选每次约2分钟，以及用DCM漂洗三次优选每次约2分钟。然后使树脂准备好 与如上所述的Fmoc保护的氨基酸或如下所述的Boc氨基酸进一步偶联。
[0078] 同样地，如果，选定了在α-氨基（Boc-AAx)上有Boc保护的待偶联到脱保护 的AA 1-树脂上的任何随后的氨基酸，那么侧链基团也必须或者不需要保护（如Boc-Gly、 Boc-Ala、Boc-Phe或Boc-苏氨酸），或者侧链必须由耐被酸和碱两者除去的基团如 Boc-Cys(S-Acm)保护。如果选择，那么Boc-AAx利用与上文所述的Fmoc氨基酸相同的试剂 和溶剂进行偶联并且能够通过Kaiser茚三酮方法检查偶联的完成。B0c-AAx-AA 1-树脂然 后用酸在有机溶剂中如TFA在DCM中的溶液解封闭，以得到CF3COTrAA x-AA1-树脂。该树脂 然后用氯化的溶剂如DCM和醇如MeOH漂洗几次，并用在DCM中的非亲质子性碱如三乙胺中 和，接着用氯化的溶剂如DCM再漂洗几次，以得到AA x-AA1-树脂。然后使树脂准备好与如上 所述的Boc或Fmoc保护的氨基酸进一步偶联。
[0079] 依据想得到的肽序列和所使用的α -氨基封闭的氨基酸类型，不管Fmoc保护或 Boc保护，执行前述偶联步骤的适当组合直到在序列中需要侧链具有保护基团的氨基酸， 该保护基团能够或者被用来解封闭在α -氨基上的Fmoc的碱或者被用来解封闭在α -氨 基上的Boc的酸除去。这种受保护的氨基酸可以为N-a -Boc-N' - ε -Fmoc-赖氨酸或 N-a -Fmoc-N' - ε -Boc-赖氨酸。一旦这种情况出现，选取的所有随后的氨基酸的α -氨基 封闭基团必须与直到N-端氨基酸的那个位置所选取的侧基保护适合。即，侧链保护基团必 须对于用来解封闭随后的α-氨基封闭基团的解封闭试剂稳定。对于N-端氨基酸来说，或 者Boc或者Fmoc能够用作α -氨基封闭基团，因为N-端氨基酸的解封闭能够同时脱保护 某些受保护的侧链，而对于肽的合成策略没有不利影响，因为将不会添加其它氨基酸。
[0080] 然后，必须将仍然连在树脂上的完成的肽链脱保护和解封闭。为了除去N-端氨基 酸的任何碱稳定的保护基团和α -氨基封闭基团，如果适用的话，用在有机溶剂中的酸如 TFA在DCM中处理肽-树脂。为了除去N-端氨基酸的任何酸稳定的保护基团和α -氨基封 闭基团，如果适用的话，肽-树脂用有机碱如哌啶在DMF中处理。或者能够将酸稳定的基团 留住，以在随后肽的断裂中被氨或胺碱除去。脱保护的肽-树脂然后用氯化的溶剂如DCM 和醇如MeOH漂洗，并且在降低的压力下干燥至恒定重量。
[0081] 使肽与树脂断裂，并且通过在3: IMeOH/DMF中悬浮肽-树脂而将C-端转化成酰 胺。在氮气中，把悬浮液冷却至约<l〇°C，并将无水氨气添加到溶剂表面下方直到溶液饱和， 同时把温度保持在低于约l〇°C。使浆料小心地混合约24小时，同时使温度升至约20°C。在 取决于肽的适当的条件下，通过用HPLC监视甲基酯中间体的消失，来检查反应完成。将反 应冷却，并且根据需要添加更多无水氨，直到在HPLC上甲基酯的面积低于所需产物峰的面 积的10%。把浆料冷却至约低于l〇°C，并且继续混合过夜，以使肽沉淀出来。将沉淀物和 树脂过滤并用冷MeOH漂洗。在降低的压力下干燥沉淀物和树脂，并且用乙酸水溶液从树脂 中提取产物。
[0082] 如果肽在其序列内包含受保护的Cys残基，则Cys的硫醇基团能够根据下列步骤 脱保护和环化。在氮气氛中，将具有Acm-保护的Cys基团的肽溶于乙酸水溶液中。快速搅 拌溶液，并且以一个部分添加碘在醇中的溶液。搅拌混合物并通过HPLC检测脱保护的完 成，接着通过用2%硫代硫酸钠溶液滴定至无色终点而结束。将粗混合物在C8填料上用0. 1 乙酸铵/乙腈梯度缓冲液通过制备色谱提纯，在C8填料上用0. 25N乙酸/乙腈梯度脱盐， 以及冻干，而得到所需的肽。
【具体实施方式】
[0083] 提供下列实施例来举例说明本发明的方法并且不应当将其解释为限制本发明的 范围。
[0084] 实施例I
[0085] H2-D-β -Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2
[0086] A) Boc-L-Thr-树脂
[0087] 将2. 58克碳酸铯在2. 5ml水中的溶液缓慢添加到溶于7ml甲醇的3. 48克 Boc-L-苏氨酸（Bachem California，Torrance，CA)的溶液中。在室温下搅拌所得到的 混合物约1小时，然后在降低的压力下除去所有甲醇和水，得到Boc-L-苏氨酸的铯盐干 粉末。用二氯甲烷（DCM)、甲醇（MeOH)和二甲基甲酰胺（DMF)(均为2X70ml)漂洗10 克Merrifield树脂（氯甲基化聚苯乙烯；200?400目，氯化物引入为1. 3毫当量/克， Advanced ChemTech，Louisville，Kentucky)。将 Boc-L-苏氨酸铯盐粉末溶于 60ml 干 DMF 中，并且将溶液与上面洗涤过的树脂结合。在氮气氛中，在约50°C?60°C下，使浆料轻轻地 混合约85?90小时。将树脂过滤并用DMF、去离子水以及最后是MeOH充分漂洗。在降低 的压力下，在约40°C下，干燥Boc-苏氨酸树脂（苏氨酸引入=0· 85±0. 15毫当量/克干树 脂）。
[0088] B) H-D- β -Nal-Cys (Acm) -Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys (Acm) -Thr-树脂
[0089] 将得自步骤A的2. 0克Boc-苏氨酸树脂添加到具有粗糙烧结的玻璃过滤底板的 50ml玻璃反应器中（批次规模=1. 74毫摩尔）。树脂用DCM(20ml)漂洗两次每次约5分 钟，用25% TFA/DCM(30ml)解封闭一次约2分钟且一次约25分钟，用DCM(20ml)、异丙醇 (IPA) (20ml)和DCM(20ml)漂洗三次约2分钟，用10%三乙胺/DCM(20ml)中和两次约5分 钟，用DCM漂洗三次约2分钟，以及用DMF (20ml)漂洗一次约5分钟。
[0090] 将解封闭的树脂与在14ml 2:1DCM/DMF中的L 8克（4. 35毫摩尔，2. 5当量） Fmoc-L-半胱氨酸（Acm) (Bachem，CA)和683 μ 1 (4. 35毫摩尔，2. 5当量）二异丙基碳二亚 胺（DIC)偶联约1小时。偶联的树脂用DMF(20ml)漂洗一次约3分钟，用异丙醇（IPA)漂洗 三次约2分钟，以及用DCM(20ml)漂洗三次约2分钟。通过Kaiser茚三酮方法检查偶联。
[0091] 偶联的树脂然后用DMF漂洗一次，接着用哌啶在DMF中的溶液解封闭。然后用DMF 漂洗解封闭的偶联的树脂，以及用MeOH和DCM两者漂洗几次。偶联的树脂用DMF(20ml)漂 洗一次约3分钟，用异丙醇（IPA) (20ml)漂洗三次约2分钟，以及用DCM (20ml)漂洗三次每 次约2分钟。通过Kaiser茚三酮方法检查偶联。
[0092] 如上所述按照下列顺序，利用在DMF/DCM中的DIC，使下列受保护的氨基酸的每一 种与漂洗过的树脂偶联并解封闭：Fmoc-L-缴氨酸、Fmoc-L-赖氨酸（Boc) ,Fmoc-D-色氨酸、 Fmoc-L-酷氛酸（〇-t_Bu)和 Fmoc-L-半I光氛酸（Acm)(所有均得自 Bachem California)、 Boc-D-2-萘丙氨酸（Synthetech，Albany，OR)。
[0093] 完成的肽链用75:20:roCM/TFA/苯甲醚（30ml)解封闭和脱保护两次约2分钟和 约25分钟，用DCM(20ml)、IPA(10ml)和DCM(20ml)漂洗三次每次约2分钟，用10%三乙胺 /DCM(20ml)中和两次约5分钟，以及用DCM(20ml)和MeOH(20ml)漂洗三次约2分钟。在降 低的压力下干燥树脂。干重=3. 91克（理论值的103% )。
[0094] C)H-D-β -Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH2
[0095] 将得自步骤B的2. 93克负载肽的树脂（1. 3毫摩尔当量）悬浮在50ml 3: IMeOH/ DMF中。在氮气中，把悬浮液冷却至约<10°C，以及使无水氨气鼓泡直至饱和，同时把温度保 持在低于约l〇°C。使浆料轻轻地混合约24小时，同时使温度升至约20°C。通过用HPLC (在 VYDAO?上，对于甲基酯来说室温（Rt.)?14分钟对（vs.)对于酰胺产物来说室温? 9. 3 分钟，5 μ 100 A，利用 26% CH3CNA). 1% TFA 无梯度（Isocratic)的 C18, Iml/ 分钟， 220nm)监视甲基酯中间体的消失，来检查反应完成。将反应冷却，并且添加更多无水氨，直 到在HPLC上甲基酯的面积低于产物峰的10%面积。把浆料冷却至约低于10°C，并且继续 混合过夜，以使肽沉淀出来。将沉淀物和树脂过滤并用15ml冷MeOH漂洗。在降低的压力 下干燥沉淀物和树脂，