大小关系很大。范德华力越大，物质的熔点、沸点就越高。对于组成和结构相似的物 质，随着相对分子质量的增大，范德华力也会进一步增强。当原子间距离为0.4?0.6nm 时，就出现范德华力。从图2、3可以分析出，多肽与受体腔的相互作用中，原子或基团间接 触点很多，因此，在多肽与目标蛋白的结合中，范德华力是一种非常重要的作用力。
[0018] 静电相互作用有两种形式，即静电引力和静电斥力。静电相互作用对配体和受体 来说非常重要，因为从本质上来说，静电相互作用的本质是两种物质形成的化学键-离子 键。离子键为两个相反电荷的离子之间的静电引力。配体和受体分子中的极性共价键或杂 原子上的孤对电子有极化性，所形成的偶极与持久存在的电荷也能发生稳定的相互作用， 形成离子一偶极键。偶极一偶极相互作用是发生于两个偶极之间的一种非常弱的相互作 用。
[0019] 活性口 袋的静电分析表明，ASP220、THR221、ASN291、ASP318、ASP319、GLY317 等区 域的静电作用都比较强，在中性溶液中发生去质子化后可以形成较强的负电区域（图2中 的深色部分);多肽中的赖氨酸在中性溶液中会形成强烈的正电荷，因此多肽与HCV NS5B结 合过程中形成一定的静电相互作用。见图2。
[0020] 疏水相互作用是一种普遍存在于生物大分子之间的作用力，它是非极性分子之间 的一种弱的、非共价的相互作用。对大多数蛋白质的结构和性质来说，疏水相互作用提供了 主要推动力，使得蛋白质分子内部聚集疏水残基。但并不是所有的疏水基都聚集于蛋白质 的内部，约有三分之一的疏水基仍暴露于水中。降低温度使疏水相互作用变弱而氢键变强。 从结果可以看出活性口袋有较强的疏水作用（图3中的深色部分)，但与多肽的相关区域的 疏水性并不强，因此，疏水作用在多肽与蛋白对接过程并不是两者相互作用的主要力。结果 展示图见图3。
[0021] 氢键是永久偶极之间的一种分子间作用力，氢键发生在已经以共价键与其它原子 键结合的氢原子与另一个原子之间（X-H…Y)，通常发生氢键作用的氢原子两边的原子（X、 Y)都是电负性较强的原子。氢键既可作用于分子间，也可以作用于分子内部。氢键能约为 5-30kJ/mol，其最大值可达200kJ/mol ;氢键较一般的共价键和离子键键能要弱，但强于静 电引力。虽然氢键能较低，但其在分子中数量较多，因此氢键对于生物大分子来说显得比较 重要，它可部分维持蛋白质和核酸的二、三和四级结构。由于多肽配基和目标蛋白中含有大 量的负电性原子和与负电性原子相连接的氢原子，同样由于氢键的数量比较多，所以在配 基与目标蛋白之间的亲和力中氢键具有比较大的贡献。
[0022] 对接结果显示，活性口袋和多肽均可形成强烈的氢键区域(见图4,图中深色部 分)。对对接结果的分析可知，多肽与活性口袋可形成超过10处氢键作用（见图5,图中虚 线，），虽然氢键的作用力比较小，但是其作用数量多，因此，氢键也是多肽与蛋白相互作用 力中非常重要的一部分作用。
[0023] 实例2:多肽与融合表达蛋白的ELISA结合 本发明的多肤序列为Ile-Asn-Gln-Arg-Lys-Val-Trp。即表中的INQRKVW。
[0024] 本试验将多肽进行人工合成，将多肽与辣根过氧化物酶进行偶联，进而分别与融 合表达蛋白包被的酶标板进行反应，以测定合成多肽与融合表达蛋白的结合能力。通过此 次模式也可以借助本发明多肽来检测血液等样品中的HCV NS5B蛋白的含量，进而实施多肽 的检测应用。测定过程中，多肽-HRP均按500倍进行稀释，表达蛋白均按10 μ g/ml的量进 行包被。具体步骤如下： (1) 将表达蛋白用CBS分别稀释至10ug/mL、5ug/mL和lug/mL，加入到酶标板中，每孔 50 μ 1，混匀，4 °C条件下过夜； (2) 用PBST清洗酶标板4次，加入1%的BSA，50 μ 1/孔，37°C条件下作用Ih ; (3) 用PBST清洗酶标板4次，将稀释好的辣根过氧化物酶（HRP)标记多肽加入到准备 好的酶标孔中，37°C条件下作用Ih ; (4) 用PBST清洗酶标板4次，加入100 μ ITMB室温条件下显色lOmin，再加入50 μ I 2M 硫酸终止反应，于450nm下读取吸光值。
[0025] 图6列出了多肽与融合蛋白结合的结果，结果显示，设计的多肽均能与表达蛋白 相结合，而且多肽与NS5B表达蛋白的结合能力随着多肽浓度增加而变强。试验结果表明 (表1 )，设计多肽均可与表达蛋白相结合，完全可以用此多肽对HCV NS5B蛋白的含量进行评 价。
[0026] 表1多肽与融合蛋白结合的结果
【主权项】
1. 一种和丙型肝炎病毒NS5B RNA聚合酶活性位点特异结合的多肽，其特征是，该序列 核心为Ile-Asn-Gln-Arg-Lys-Val-Trp〇
2. 根据权利要求1所述的多肽在抗丙型肝炎的药物或制剂的应用。
3. 根据权利要求1所述的多肽在制备检测HCV及其NS5B蛋白中的应用。
4. 根据权利要求1所述的多肽在建立HCV NS5B的定性或定量检测试剂盒的应用。
5. 利用HCV NS5B RNA聚合酶活性评价体系进行多肽筛选的方法，其特征是，该方法包 括以下步骤： (1) 取100即/1111的？〇17(六)磁珠5111，加入尺似81110.5111，同时加入5111的10\1?隱 Buffer、25mM的Mg2+离子4ul，加水补充至50 iil，于37°C条件下水浴30min ; (2) 将所有合成备筛选的多肽均溶解于0. 5%的DMSO中；取10mM的合成多肽15 yl与 15iU NS5B相应表达蛋白于37°C反应30min，然后取lOiil用于下一步反应； (3) 加入 ImM 的 Bio-ll-UTP 0.5iil、10mM 的 rUTP 5111，于371：条件下水浴3〇111111; 阴性对照组仅加入10mM的rUTP 5 yl，同时加入10 yl NS5B相应的表达蛋白作为阳性对 昭. (4) 将反应后的溶液置于磁力架上，吸附5min，然后加入2XSSC溶液200 iil，清洗三 次； (5) 加入FAM标记的1000倍稀释的链霉亲和素100 iil，于37°C条件下水浴30min ; (6) 将反应后的溶液置于磁力架上吸附5min，然后加入2XSSC的溶液200iil清洗三 次，加入50iil灭菌水，于Abs/Em=492/518nm条件下读值，以三次测定的平均值为最终结 果； (7) 以（多肽反应组的荧光计数值-阴性荧光值）/(阳性荧光值-阴性荧光计数值）的 比值高低，判定多肽对NS5B表达蛋白的酶活抑制性。
【专利摘要】本发明设计了一系列不同长度的多肽组合库，利用分子对接软件，将多肽与HCV NS5B RNA聚合酶上特定的抑制性位点进行分子对接，对结果进行综合分析，筛选出具有抑制HCV NS5B RNA聚合酶活性的多肽，为进一步研发抗HCV药物奠定基础。修饰多肽与NS5B表达蛋白的结合实验结果表明：设计的多肽能与表达蛋白结合，表达融合蛋白测定结果和虚拟对接结果之间有相关性，本发明多肽可以用来对HCV NS5B蛋白进行检测，利用HCV NS5B RNA聚合酶体外活性鉴定体系进行多肽抑制筛选的结果表明，本发明的多肽对HCV NS5B蛋白的聚合酶活性均有显著抑制作用，其IC50可达9.85μM，可作为HCV抑制的潜在药物。
【IPC分类】A61P31-14, A61K38-08, G01N33-569, C07K7-06, G01N33-68
【公开号】CN104530189
【申请号】CN201410775233
【发明人】王春峰, 张连峰, 王方雨, 吕军, 姚建宁, 程鹏, 高冰
【申请人】郑州大学第一附属医院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月16日