石仙桃多糖在制备保肝药物中的应用的制作方法

本发明属于中医药领域，具体是石仙桃多糖的制备及其在制备保肝药物中的应用。

背景技术：

肝脏是腹腔内最大的实质性器官，担负人体的重要生理功能。目前肝脏疾病成为威胁人类健康的常见疾病之一。肝损伤是肝脏疾病共有的病理状态，其治疗直接影响肝病治疗预后。近年来肝损伤治疗备受关注，特别是中药治疗研究取得了很大进展。很多中药具有明显的保肝护肝作用，无论是中药化学成分还是中药复方都是通过调节免疫、提高抗氧化能力、降低组织细胞中自由基等，维护肝细胞膜完整，减缓肝细胞凋亡。从目前研究来看，清热解毒、活血化瘀中药多能保护肝组织、修复肝组织。其所含化学成分多糖、黄酮类化合物、苷类、生物碱等又各有不同的作用。中药多糖成分尤其能调节免疫功能，黄酮类化合物和苷类成分主要能抗氧化，清除自由基等。总之，能保肝护肝的中药成分都具有维持细胞膜完整，减缓肝细胞凋亡的作用，对CCl₄ 所致肝损伤都有一定的保护作用。

中药石仙桃为兰科石仙桃属植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.，以假鳞茎或全草入药，全年可采，鲜用或开水烫后晒干备用。分布于广布于华东、华南和西南大部分地区。具有养阴润肺，清热解毒，利湿，消瘀之功效。常用于肺热咳嗽，咳血，吐血，眩晕，头痛，梦遗，咽喉肿痛，风湿疼痛，湿热浮肿，痢疾，白带，疳积，瘰疬，跌打损伤。 至今，已公开的与石仙桃有关的文章有300多篇，但以中药石仙桃提取物制备保肝药物的药物及其制备方法，则未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供中药石仙桃多糖在制备保肝药物中的应用及其制备方法，以及对该药物进行抗肝纤维化动物实验的方法和结果。

实现本发明目的的技术方案是：

一、石仙桃多糖的制备方法：

将新鲜采集的石仙桃以其假鳞茎或全草阴干粉碎，得到石仙桃粗粉，按1:10的料液比加入水，沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液进行浓缩，用氯仿与正丁醇的比例4:1，采用Sevag法多次萃取，得到除去蛋白质的上清液，加95%乙醇使醇含量达到80%，将其置于4℃冰箱中醇沉 12 h，抽滤，滤渣依次用乙醚、丙酮、无水乙醇洗涤，即得石仙桃粗多糖；将石仙桃粗多糖溶于水中，加样到经pH =7.5的磷酸盐缓冲液前处理的 DE52 型树脂层析柱中，静止过夜，用流速为1.2 ml/min的蒸馏水洗脱，合并洗脱液，冷冻干燥得到石仙桃多糖。

二、石仙桃多糖的制备方法制得的石仙桃多糖。

三、石仙桃多糖用于制备保肝的药物。

四、石仙桃多糖制备保肝的药物，以石仙桃多糖为有效成分，余量为药剂成型辅料。可制备成供口服的中药制剂，如片剂、口服液、颗粒剂等，其制法与现有的相应剂型的制法通用。

五、石仙桃多糖在制备保肝药物的药效学实验方法及结果。

石仙桃药材资源丰富，制备石仙桃多糖工艺简单、成本低，具有良好的开发价值。此外，本发明发掘了石仙桃多糖具有保肝护肝作用，制备保肝药物或保健品具有良好的药用价值，并为石仙桃多糖进一步深入开发提供研究基础。

附图说明

图1. 对肝组织病理形态学的影响(HE, ×200)；

A：正常对照；B：模型对照；C：石仙桃多糖（500 mg/kg）；D：石仙桃多糖（300 mg/kg）；E：石仙桃多糖（100 mg/kg）；F：联苯双酯（120 mg/kg）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的内容作进一步的说明，但并不是对本发明的限定。

石仙桃多糖在制备保肝药物的药效学实验方法及结果：

1 材料与方法

1.1 供试药品的制备 石仙桃为兰科石仙桃属植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.，以假鳞茎或全草入药，采自广西药用植物园。称取干燥的石仙桃1500 g，加入15000 ml水，沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液，浓缩至220 ml，用（Sevag法）氯仿-正丁醇（4:1）多次萃取，得到除去蛋白质的上清液，加95%乙醇使醇含量达到80%，将其置于4℃冰箱中醇沉 12 h。抽滤，滤渣依次用乙醚、丙酮、无水乙醇洗涤，即得石仙桃粗多糖。将石仙桃粗多糖溶于水中，加样到经pH =7.5的磷酸盐缓冲液前处理的 DE52 型树脂层析柱中，静止过夜，用流速为1.2 ml/min的蒸馏水洗脱，合并洗脱液，冷冻干燥得到石仙桃多糖。采用DE52型树脂层析柱，上样量0.3 g，上样体积40 ml，先以蒸馏水进行洗脱，然后用0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/ml NaCl 溶液梯度洗脱。洗脱液用苯酚- 硫酸试剂显色后，在λ= 488 nm处测其吸光度。按吸光度和洗脱液体积作图，按峰面积计算，测得其纯度≥87.36%。

1.2 动物 昆明种SPF级小鼠60只，体重19-22 g，雌雄各半，由桂林医学院SPF实验动物中心提供（许可证号：SCXK2007-0001）。

1.3 试剂 丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；TNF-α，IL-6及IL-1β试剂盒购于Elabscience公司；NF-κB购于英国Abcam公司；四氯化碳（CC1₄）购于广东汕头市西陇化工厂，批号：0710262；联苯双酯滴丸购于浙江万邦药业有限公司，批号：A02140101。

1.4 仪器 TGL-16K台式高速冷冻离心机，湖南湘仪离心机厂；AU600全自动生化检测仪，奥林巴斯生产；0lymPus BX51显微镜，奥林巴斯生产；BS1105电子天平，德国sartorius公司。恒温水浴锅XMTD-6000，上海长风仪器厂；THZ-C-1 台式冷冻恒温振荡器，太仓市实验设备厂；eppendorf移液器，德国eppendorf股份公司；Epoch酶标仪，美国 Bio-tek。

1.5 方法^[7] 60只小鼠随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯组（120 mg/kg）和石仙桃多糖组（500 mg/kg，300 mg/kg，100 mg/kg），每组10只。除正常对照组及模型组外，各治疗组按20 ml/kg剂量灌胃给药，每天按时1次，共7天。末次给药后，除正常对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射0.12% CC1₄花生油（10 ml/kg）。禁食不禁水24 h，眼球取血，离心分离（4000 rpm ,10 min），取血清。采血后，迅速解剖，在同一位置取肝组织，部分肝组织置于-80℃冰箱保存，用于肝组织指标检测，剩余肝组织固定于4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋、切片、HE染色，观察肝组织病理学变化；生化法测定血清中ALT、AST、MDA、SOD及GSH-Px的活性或含量；酶联免疫吸附法（ELISA）检测肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO含量。

2.1 对血清中ALT、AST和肝组织中NO含量的影响 与正常组相比，模型组血清中ALT、AST和肝组织中NO含量显著升高。与模型组相比，联苯双酯组和石仙桃多糖剂量组血清中ALT、AST含量呈现不同程度降低，肝组织中NO含量显著降低，见表1。

表1对小鼠血清中ALT、AST和肝组织中NO含量的影响（±s,n=10）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 对血清中SOD、GSH-Px及MDA活性或含量的影响 与正常组相比，模型组血清中SOD、GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著升高。与模型组相比，联苯双酯组及石仙桃多糖剂量组血清中SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低，见表2。

表2 对血清中SOD、GSH-Px及MDA活性或含量的影响（ ± s, n = 10）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 对肝组织中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平的影响 与正常组相比，模型组肝组织中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平显著升高。与模型组相比，联苯双酯组及石仙桃多糖剂量肝组织中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平不同程度下降，见表3。

表3对肝组织中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平的影响（ ± s, n = 10）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 对肝组织病理形态学的影响 从肝脏的整体形态可见，正常组小鼠肝脏色泽红润，富有弹性，且表面光滑细腻。而CC1₄致小鼠肝损伤模型组小鼠肝脏表面泛黄粗糙，肝脏体积有所增大，表面呈现大量颗粒状。石仙桃多糖剂量组小鼠肝脏表面稍显粗糙，但无明显泛黄，体积略有增大较模型组小，损伤明显减轻。在高倍显微镜下观察：正常组小鼠肝脏肝小叶结构清晰，结构纹理完整，肝细胞以中央静脉为中心呈现放射状排列，大小均匀，无坏死、变性等病理变化，未见炎症细胞浸润等。CC1₄致小鼠肝损伤模型组的肝脏肝小叶结构被严重破坏，肝细胞严重坏死，可见炎细胞浸润。石仙桃多糖剂量组小鼠肝脏肝小叶结构较完整，肝细胞坏死程度明显减轻，炎症细胞明显减少，肝组织炎症得到显著改善，结果见图1。

综上所述，本发明首次对石仙桃多糖在制备保肝药物进行了抗肝损伤的研究，通过动力实验表明，仙桃多糖具有较好的保护肝损伤的药理作用，作用机制可能与仙桃多糖通过降低相关炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的水平表达从而逆转肝损伤密切相关。可用于制备片剂、口服液、颗粒剂等剂型的治疗肝损伤的中药制剂。