一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物技术和生物化工领域的一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌及其应用。本发明采用基因工程技术构建过表达跨膜蛋白YcxA的工程菌，强化了脂肽由细胞内向细胞外的跨膜运输，从而显著提高了脂肽的产量。本发明所得过表达脂肽载体蛋白YcxA的基因工程菌与出发菌株相比，表面活性素产量提高97％，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有良好的工业应用前景，发酵所得发酵液中脂肽产量平均为1-5g/L。
【专利说明】一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和生物化工领域，具体涉及一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌及其应用。
【背景技术】
[0002]脂肽(Iipop印tide)类生物表面活性剂是一种主要由芽孢杆菌、链霉菌等微生物合成的两性物质，由亲水的环状寡肽与疏水的脂肪酸碳链组成。不同的芽孢杆菌菌株合成脂肽的种类也不同，根据脂肽的分子结构主要可分为表面活性素(surfactin)、芬芥素(fengycin>plipastatin)伊枯草菌素(iturin、bacillomycin、mycosubtilin)等。不同种类的脂肽的区别主要在于氨基酸组成与成环方式。例如，非极性的缬氨酸与亮氨酸，以及极性的谷氨酸与天冬氨酸组成的7肽构成了表面活性素的环状寡肽部分；而芬芥素A则含有酪氨酸、脯氨酸、鸟氨酸等氨基酸。脂肽，尤其是表面活性素具有良好的表面活性与生物相容性，在生物防治、环境保护以及石油开采领域有着广阔的应用前景。但由于芽孢杆菌的脂肽合成水平低，与目前使用的化学表面活性剂相比成本劣势明显，因此脂肽的规模化生产和广泛应用还都没有实现。
[0003]目前，提高微生物脂肽生产水平的方法主要是通过优化培养条件与对菌株进行诱变。在培养条件方面，王德培等对发酵培养基成分、接种量、培养温度、通气量等因素进行了优化，枯草芽孢杆菌CGMCC M0.3412抗菌脂肽的产量达到I~2g/L (CN101892176)。牟伯中等通过向培养基中添加特定种类的氨基酸，实现了枯草芽孢杆菌脂肽产量的提高(CN101775427)。Yoneda等分别以麦芽糖与黄豆粉为主要的碳氮源，培养20-90小时，使表面活性素的产量提高至50g/L (W02002026961)。Fahim等分析了不同的发酵供氧条件对脂肽产量以及产物选择性的影响，其结果表明，k#在0.04~0.08s-1时表面活性素的产量最高(2g/L),而kLa在0.01s4时芬芥素的产量可达最高(0.3g/L) (BioresourceTechnology, 2012, 126:1-6)。在菌种诱变方面，对玫瑰孢链霉菌ATCC31568进行紫外诱变，脂肽A21978C的产量提高了 185% (CN101928677)。Carrera等使用亚硝基甲替尿烷(nitrosomethyl urethane,NMU)对枯草芽抱杆菌ATCC21332进行化学诱变，得到的突变菌株经过40到90小时的发酵后，发酵液中表面活性素的浓度为2.0-4.0g/L (US5227294)。Liu 等(Plasma Science and Technology, 2006，8 (4): 491)使用低能氮离子束注入进行了菌株诱变，突变菌株发酵液50与100倍稀释后的表面活性分别是出发菌株的5.6倍与17.4倍。
[0004]除优化培养条件与菌株诱变外，利用基因工程手段对生产菌株进行遗传改造从而提高脂肽产量也有部分报道。顾晓波等在枯草芽孢杆菌细胞中表达comA基因，脂肽产量提高了 50% (CN1554747)。卢兆新等在ATCC9943菌株中通过质粒超量表达脂肽抗性基因yerP，表面活性素与芬芥素产量分别是出发菌株的1.6与1.8倍(CN102220367)。通过将脂肽mycosubtilin合成酶的启动子进行替换,mycosubtilin的产量发生了 8-10倍的提升(Bioresource Technology, 2013, 145:264-270)。[0005]表面活性素在枯草芽孢杆菌细胞内合成，并被分泌到细胞外。脂肽跨膜运输载体蛋白则以主动运输的方式将细胞内合成并积累的表面活性素转移至细胞外。蛋白YcxA的基因ycxA在枯草芽孢杆菌基因组上位于表面活性素合成基因srfA下游，其表达产物根据二级结构预测分析为MFS家族跨膜蛋白，可能具有跨膜运输脂肽的功能(Molecular Microbiology, 1993, 8:821-831;Journal of Molecular Microbiology andBiotechnology, 2002，4:37-67)。未见有关于YcxA功能及其影响脂肽生产的研究结果。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌。
[0007]本发明的目的还在于提供上述高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌在制备脂肽类生物表面活性剂中的应用。
[0008]本发明的技术方案如下:[0009]一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌，其是将脂肽载体蛋白YcxA基因转化至原始菌株构建而成，其过表达脂肽载体蛋白YcxA。
[0010]所述脂肽类生物表面活性剂为表面活性素。
[0011]所述原始菌株为具有产脂肽类生物表面活性剂能力的野生菌及其诱变株、突变株或基因工程改造菌株。
[0012]所述原始菌株为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或假单胞菌。
[0013]优选的，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) THY-7，保藏号为CGMCC N0.8906。
[0014]所述高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌，优选枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) TS589，保藏号为CGMCC N0.8907，其是将脂肽载体蛋白YcxA基因转化至原始菌株构建而成，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) THY-7，保藏号为CGMCCN0.8906。
[0015]上述工程菌在制备脂肽类生物表面活性剂中的应用。
[0016]利用采用上述工程菌生产脂肽类生物表面活性剂，步骤如下:
[0017]I)将工程菌接入LB液体培养基中，在35-40°C、摇床转速为150-250rpm/min的条件下培养10-20小时，得到基因工程菌菌液；
[0018]2)按照1-20%的体积百分比将步骤I得到的工程菌菌液接入发酵培养基中，在35-40°C、摇床转速为150-250rpm/min的条件下培养20-40小时，得到含有脂肽的发酵液；所述发酵培养基的组成为:糖类30-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源0.5_3g/L，KH2PO40.1-lg/L, Na2HPO4.12H200.5_3g/L，MgSO4.7H200.05-0.3g/L, CaCl20.002-0.01g/L,MnSO4.H2O0.002-0.01g/L, FeSO4.7H200.002-0.01g/L, pH6.5-7.5。
[0019]所述糖类为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉或淀粉水解液。
[0020]所述无机氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠或硝酸钾。
[0021]所述有机氮源为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或大豆粉。
[0022]一种本发明的高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌的构建方法:
[0023]利用穿梭质粒，将脂妝载体蛋白YcxA基因ycxA在大肠杆菌中进行ycxA基因过表达载体的构建，然后转化至原始菌株中表达，最终获得脂肽产量提高的基因工程菌。[0024]所述脂肽载体蛋白YcxA基因ycxA具有SEQ ID NO:1所示DNA序列。
[0025]所述穿梭质粒可为pHT系列质粒。
[0026]构建的具体方法如下:
[0027]1.以ycxAFB和ycxARS为上下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，进行聚合酶链式反应，获得ycxA基因序列，如SEQ ID No:1所示。所述上游引物ycxAFB的碱基序列如SEQ ID No:2所示,所述下游引物ycxARS的碱基序列如SEQ ID No:3所示。
[0028]2.将ycxA基因以及枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒分别进行BamH I与Sma I双酶切，27-33°C反应过夜；然后将酶切产物纯化，使用T4DNA连接酶将两种酶切产物进行连接，反应温度15-25°C，反应时间12-16h，得到连接产物。
[0029]3.将连接产物转化E.coli宿主菌T0P10感受态细胞，涂布LB平板(含氨苄青霉素)，挑取抗性克隆进行培养，提取质粒进行PCR及酶切验证，得到带有ycxA基因的重组质粒 pHT-ycxA。
[0030]4.将重组质粒pHT-ycxA使用电转化方法转入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) THY-7 (于2014年3月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏登记号为CGMCC N0.8906)中，涂布LB平板(含氯霉素)，挑取抗性克隆进行培养，进行PCR验证，获得转化有pHT-ycxA质粒的基因工程菌TS589 (于2014年3月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏登记号为CGMCC N0.8907)。
[0031]步骤I中所述的枯草芽孢杆菌可以选择枯草芽孢杆菌1012wt (MoBiTec)、枯草芽抱杆菌 TU2( Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013，23:390-396)、THY_7(生物工程学报，2013，29(4):1-6), THY-8 (化工进展，2013，32:2952-2956)或携带 YcxA 基因的芽孢杆菌菌株。
[0032]步骤2中所述的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒可以选择购自MoBiTec公司的pHT系列衍生质粒pHTOl、pHT08或pHTIO等。
[0033]所述宿主菌的原始菌株是具有产脂肽类生物表面活性剂能力的野生菌及其诱变株、突变株或基因工程改造菌株，如枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、假单胞菌或其它产脂肽的微生物，优选指枯草芽孢杆菌。
[0034]其中原始菌株优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) THY-7CGMCC N0.8906。
[0035] 本发明的优点和有益效果:本发明采用分子生物学方法和技术，在产脂肽枯草芽孢杆菌细胞中扩增并过表达了跨膜蛋白YcxA，强化了脂肽由细胞内向细胞外的跨膜运输，从而显著提高了脂肽的产量。本发明所得过表达脂肽载体蛋白YcxA的基因工程菌与出发菌株相比，表面活性素产量提高97%，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有良好的工业应用前景，发酵所得发酵液中脂肽产量平均为l_5g/L。
[0036]生物材料保藏说明
[0037]分类命名:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
[0038]菌株编号:THY-7
[0039]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0040]保藏机构简称:CGMCC
[0041]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0042]保藏日期:2014年3月11日[0043]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.8906。
[0044]分类命名:枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)
[0045]菌株编号:TS589
[0046]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0047]保藏机构简称:CGMCC
[0048]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0049]保藏日期:2014年3月11日
[0050]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.8907。
【专利附图】
【附图说明】[0051]图1为携带脂肽载体蛋白基因ycxA的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pHT-ycxA的构建示意图。
[0052]图2为含有ycxA基因的重组质粒pHT-ycxA的PCR与酶切验证图；泳道I为DNA分子量标准，由上至下第四条带为1.2kb ;泳道2为重组质粒pHT-ycxA使用引物ycxAFB与ycxARS进行PCR扩增的结果,可得到约1.2kb的条带；泳道3为重组质粒pHT-ycxA进行BamH I/Sma I双酶切的结果，可得到约8kb+l.2kb的条带；泳道4为DNA分子量标准，由上至下第三条带为7.5kb。
[0053]图3为过表达脂肽载体蛋白YcxA基因工程菌TS589的PCR验证图；泳道I为DNA分子量标准，由上至下第四条带为1.2kb ;泳道2为TS589使用引物ycxAFB与ycxARS进行PCR扩增的结果，可得到约1.2kb的条带。
[0054]图4为出发菌株THY-7与基因工程菌TS589发酵产物中表面活性素浓度的比较结
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【具体实施方式】
[0055]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如为特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员书中的常规手段。
[0056]实施例1
[0057]携带脂肽载体蛋白基因ycxA的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒的构建
[0058]挑取枯草芽孢杆菌1012wt (购自MoBiTec公司)单菌落，接种于LB液体培养基中，在温度为37°C、摇床转速为200rpm的条件下培养16小时，12000rpm离心5min收集菌体沉淀，使用Omega公司的细菌基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌1012wt基因组DNA。以上述所得枯草芽孢杆菌1012wt基因组DNA为模板，使用上游引物ycxAFB (序列如SEQ IDNo: 2所示)与下游引物ycxARS (序列如SEQ ID No: 3所示)进行PCR基因扩增。引物由钼尚生物技术(上海)有限公司合成，用无菌水溶解，并稀释至ΙΟμΜ备用。PCR扩增所用聚合酶、缓冲液、dNTP购自TaKaRa公司。PCR扩增反应体系为:
[0059]基因组DNA溶液1μ￡
引物 ycxAFBIpL
引物 ycxARSI μL
dNTP2μL
反应缓冲液2,5 μL.Pyrobest 聚合酶Ο.2
无菌水17.3 μL
总体积25 μL
[0060]热循环条件为94°C 3min ；94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 2min, 35 个循环；72°C，IOmin0扩增产物经测序验证为枯草芽孢杆菌ycxA基因(序列如SEQ ID No:1所示)。扩增产物与枯草芽孢杆菌_大肠杆菌穿梭质粒pHT08 (Biomega公司)进行BamH I/Sma I (TaKaRa公司)双酶切，37°C下反应过夜；所得酶切产物通过DNA纯化试剂盒(Biomega公司)进行纯化，然后使用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)在16°C下连接过夜；连接产物转化E.coli宿主菌TOPlO感受态细胞(TianGen)，涂布LB固体平板(含50mg/L卡那霉素);挑选抗性克隆，小量提取质粒，得到含有ycxA基因的重组质粒pHT-ycxA，构建过程如图1所示。进行PCR验证与酶切验证(使用上游引物ycxAFB与下游引物ycxARS可扩增出约1.2kb条带，BamH I/Sma I双酶切可得到约8kb+l.2kb条带),验证结果如图2所示。
[0061]实施例2
[0062]过表达脂肽载体蛋白YcxA基因工程菌的构建
[0063]将实施例1中构建的携带脂肽载体蛋白基因ycxA的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pHT-ycxA以电穿孔法转化枯草芽孢杆菌THY-7的感受态细胞，可得过表达脂肽载体蛋白YcxA的基因工程菌TS589。其中，枯草芽孢杆菌THY-7感受态细胞的制备采用Xue等(Journal of Microbiological Methods, 1999，34:183-191)的方法。向一个 1.5mL 离心管中加入2.5 μ L重组质粒pHT-ycxA以及50 μ L枯草芽孢杆菌ΤΗΥ-7感受态细胞，混匀后加入
0.1cm电转杯，冰浴30min ;调节电转仪电压为1.25kV，将电转杯装入电转仪，按下电击键；电击结束后，向电转杯内加入ImL复苏培养基(配方见Xue等,Journal of MicrobiologicalMethods, 1999，34:183-191)，重悬细胞，转入 1.5mL 离心管，37°C、200rpm 震荡培养 4h ;取100 μ L菌液涂布于LB固体培养基(含5 μ g/mL氯霉素)，置入37°C培养箱中倒置培养12小时，挑取单菌落，使用上游引物ycxAFB与下游引物ycxARS进行PCR验证，可扩增出约1.2kb条带，验证结果如图3所示，即获得过表达脂肽载体蛋白YcxA基因工程菌TS589。
[0064]实施例3
[0065]使用基因工程菌TS589生产脂肽类表面活性剂一表面活性素
[0066]将实施例2所得过表达脂肽载体蛋白ycxA基因工程菌TS589接种于LB液体培养基(含5μ g/mL氯霉素)中，37°C、200rpm下培养16小时，以5%的比例接入发酵培养基中，37°C、200rpm下培养4h，加入IPTG (终浓度ImM)，继续培养至24h，即得含脂肽的发酵液。取步骤I所得发酵液100 μ L，加入900 μ L去离子水，混匀，经0.22 μ m滤膜过滤，上样进行HPLC 分析。采用 ShimadzuLC20A 色谱系统，色谱柱为 0DS-SP250X4.6mm (GL Sciences),流动相为乙腈: 水:三氟乙酸=93:7:0.1，流速0.8111171^11，上样量2(^1^。HPLC分析结果表明，出发菌株THY-7表面活性素的产量为0.515g/L，过表达脂肽载体蛋白ycxA的基因工程菌TS589表面活性素的产量为1.014g/L，是出发菌株的1.97倍(如图4)。
【权利要求】
1.一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌，其是将脂肽载体蛋白YcxA基因转化至原始菌株构建而成，其过表达脂肽载体蛋白YcxA。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述脂肽类生物表面活性剂为表面活性素。
3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述原始菌株为具有产脂肽类生物表面活性剂能力的野生菌及其诱变株、突变株或基因工程改造菌株。
4.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或假单胞菌。
5.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) THY-7，保藏号为 CGMCC N0.8906。
6.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，其分类属枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) TS589，保藏号为CGMCC N0.8907，其是将脂肽载体蛋白YcxA基因转化至原始菌株构建而成，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) THY-7，保藏号为CGMCCN0.8906。
7.权利要求1-6所述的工程菌在制备脂肽类生物表面活性剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用采用权利要求1-6所述工程菌生产脂肽类生物表面活性剂，步骤如下: 1)将工程菌接入LB液体培养基中，在35-40°C、摇床转速为150-250rpm/min的条件下培养10-20小时，得到工程菌菌液； 2)按照1-20%的体积百分比将步骤I得到的工程菌菌液接入发酵培养基中，在35-40°C、摇床转速为150-250rpm/min的条件下培养20-40小时，得到含有脂肽的发酵液；所述发酵培养基的组成为:糖类30-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源0.5_3g/L，KH2PO40.1-lg/L, Na2HPO4.12H200.5_3g/L，MgSO4.7H200.05-0.3g/L, CaCl20.002-0.01g/L,MnSO4.H2O0.002-0.01g/L, FeSO4.7H200.002-0.01g/L, pH6.5-7.5。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述糖类为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉或淀粉水解液。
10.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述无机氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠或硝酸钾；所述有机氮源为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或大豆粉。
【文档编号】C12N1/21GK103898038SQ201410124438
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】于慧敏, 李煦, 杨欢, 李雪, 沈忠耀 申请人:清华大学