作标准曲线。
[0015] ⑨样品中蛋白质含量的测定： 取0. 1mg/mL的样品溶液1血，按w上操作，测定其595皿处测定光吸收值A595皿， 根据标准曲线计算样品中的蛋白质含量。重复3次，结果取平均数。
[0016] 4、对本发明获得的黑果构杞多糖采用1-苯基-3-甲基-5-化挫咐酬（PMP)柱前衍 生化法进行组成单糖分析，经检测如图17所示，按峰面积定量，黑果构杞多糖由甘露糖、鼠 李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为1:0. 76:50. 82:1. 80:0. 46:3. 85。 具体方法如下： 山完全酸水解： 称取多糖样品2mg，加入含有2M肥1的无水甲醇溶液0. 5111以充肥封管，80°C水解 16h，空气吹干后，加入2MS氣己酸0. 5血，120°C水解1h，然后移入蒸发皿，45°C水浴， 反复加无水己醇赶除=氣己酸后干燥。
[0017] 口）1-苯基-3-甲基-5-化挫咐酬（PMP)衍生化； 向水解后得到的单糖样品中加入PMP试剂和0. 3M的化OH溶液各0. 5mL，充分溶解后 取0.1血于1.5血离屯、管中，水浴70°C反应30min。离屯、（5000 ;rpm，5min)后，加入0.3 M肥1 0.05血，充分混匀。加入1血氯仿，萃取多余的PMP试剂，离屯、（5000巧m，5min) 去除氯仿层，水层用0. 22ym滤膜过滤后，待HPLC检测。
[001引樹单糖-PMP衍生物的HPLC分析； 义用化imadzuHPLC系统化C-lOATvp累和SPD-lOAvp紫外检测器)，化im-packVP-ODS色谱柱（4. 6mmX150mm)，流动相为0. 1MpH7. 0磯酸盐缓冲液：己膳为82:18(v/v)， 流速为1. 0血/min,进样量为10uL，检测波长为245皿。
[0019] 5、对本发明获得的黑果构杞多糖进行体外抗衰老活性实验，其自由基产生必需中 间体妒-?清除效果的ICs。值为0. 72mg/mL，H2〇2清除效果的1C5。值为1. 57mg/mL，DPPH自 由基清除效果的ICs。值为0. 14mg/mL，哲基自由基（'OH)清除效果的1CW值为0. 21mg/mL。
[0020] (1)超氧负离子（妒-?)清除实验： 活性氧指的是一系列由氧产生的化学活性分子，大量研究表明其与人体的衰老W及多 种疾病(肿瘤、屯、脑血管等)密切相关。妒^?作为活性氧的一种，由氧分子在自然条件下得到 一个电子而产生，其活性并不很强。但是，它能够在自然条件或过氧化物歧化酶的作用下得 到一个电子成为&化，继而产生活性极强的'OH。本实验采用PMS-NADH-NBT体系测定黑果 构杞多糖的妒-?清除能力。
[002U 具体操作：取1血不同浓度样品溶液（0. 25-4mg/血)，加入1血氯化硝基四氮挫 NBT(300uM)，l血还原型烟酷胺腺嚷岭二核巧酸NA畑（936uM)，加入1血吩嗦硫酸二 甲醋PMS(120uM)启动反应，25 °C水浴反应5min后，测定其560皿处的吸光值（A560 nm)。0. 1MpH7. 4的磯酸盐缓冲液作为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。按下面公式计算 超氧负离子（旷?）清除率： 超氧负离子（02^0清除率=(1-As耐e/Awntw)X100%，其中As邮为测试样品的A日日0"，Accntrcl为空白对照的A日日。"。
[0022] 口) &〇2清除实验： &化也是活性氧的一种，虽属中等活性，但却是许多活性较强的自由基产生过程的中间 体，如&〇2在髓过氧化物酶的作用下，参与产生次氯酸（HC10)，在金属离子存在下，参与产 生哲自由基。因此，清除《2。2就阻止了自由基产生的链式反应。本实验采用辣根过氧化物酶 法测定黑果构杞多糖对&化的清除作用。
[002引具体操作：取1血不同浓度样品溶液（0. 25-4mg/血），加入0. 4血&02(5ml), 在室温下放置20min,再加入0.6血辣根过氧化物酶（HRpase300yg/mL，苯酪红4. 5ml 在100ml抑7. 4磯酸缓冲液中)，静置10min后，测定其610皿处的吸光值。按下 面公式计算&02清除率： &02清除率=(1 -Asample/AenntrJX100%，其中Asampie为测试样品的A日細，Aenntw为空白 对照的Aei。
[0024]樹DPPH自由基清除实验； DPPH是一种稳定的有机自由基，其己醇溶液呈紫红色，在可见光区最大吸收峰为517nm。当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其逐渐消失，其稱色程度与所接受的 电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。利用DPPH的W上特性，用分光光 度法测定加入胶巧螺多糖后混合溶液517nm波长处的吸光值（A517nm)的变化程度可W 反映其对有机自由基的消除能力。
[002引具体操作：取4血不同浓度的多糖溶液（0. 5-4mg/血)，与0. 1MDPPH甲醇溶液 1mL混合，剧烈振荡，于暗处静置15min,再于室温下静置20min。蒸馈水作为空白对照， 抗坏血酸为阳性对照。用分光光度计测定反应溶液的A517nm。按照下面的公式计算DPPH 的清除率； DPPH清除率=(1 -Asampie/AcontrJX1000/0,其中A_ple为测试样品的A日17Acontw为空白 对照的
[0026] (4婚基自由基（.OH)清除实验： 哲基自由基（'OH)是代谢过程中产生的非常活泼的自由基，毒性很大，能够造成蛋白 质、核酸、脂类等生物大分子的损伤，从而导致体内代谢素乱，引起许多病理变化。本研究采 用脱氧核糖-铁体系法对黑果构杞多糖的哲基自由基（'OH)清除能力进行测定。
[0027] 具体操作；依次向试管中加入50ml抑7. 5的磯酸盐缓冲液0. 4血，0. 5-10mg/ 血的样品溶液0.1血（对照用蒸馈水)，1ml的邸TA溶液0.1血，10mmol/L的&化0.1 血，2ml的抗坏血酸溶液0.1血，60ml的脱氧核糖溶液0.1血（样品空白不加)，1ml的 化CI3溶液0. 1血，各管最终体积为1. 0血，37 °C水浴1h，取出后迅速加入10%的S氯己 酸1. 0血终止反应，再加入1%硫代己比妥酸1. 0血，沸水浴反应15min后立即冷却，于 532nm波长处测定吸光值（Aw2")，按下式计算清除率： 哲基自由基（'OH)清除率=(1 - 4日_。1。人。。,"1)X100%，其中为测试样品的A日32 "，Acontrol为空白对照的As32 ?。
[00測 脚统计方法： 所获得数值型实验数据WSPSS13. 0软件进行统计分析，半数抑制浓度（ICg。，mg/mL)采用概率单位回归计算得出，多组样本之间的两两比较采用方差分析q检验。检验水准 口 =0. 01。
[0029] 黑果构杞多糖的抗衰老效果如表1所示。ICg。值可W体现天然产物的抗衰老能力， 是抗衰老功能评价的一个常用指标，该值没有一个界限值，通常数值越小表明抗衰老能力 越强。从上述结果可W看出，黑果构杞多糖的抗衰老能力显著优于阳性对照物香茹多糖的 抗衰老能力。因此，可W看出本方法提取得到的多糖具有良好的抗衰老活性。
[0030] 表1黑果构杞多糖抗衰老活性评价结果
注；与阳性对照组市售香茹多糖相比，a/^ < 0. 01。
【附图说明】
[0031] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0032] 图1为本发明提取时间与微波功率对多糖提取率影响的响应面=维图。
[0033] 图2为本发明提取时间与微波功率对多糖提取率影响的响应面二维图。
[0034] 图3为本发明浸泡时间与微波功率对多糖提取率影响的响应面=维图。
[0035] 图4为本发明浸泡时间与微波功率对多糖提取率影响的响应面二维图。
[0036] 图5为本发明料液比与微波功率对多糖提取率影响的响应面S维图。
[0037] 图6为本发明料液比与微波功率对多糖提取率影响的响应面二维图。
[003引图7为本发明浸泡时间与提取时间对多糖提取率影响的响应面S维图。
[0039] 图8为本发明浸泡时间与提取时间对多糖提取率影响的响应面二维图。
[0040] 图9为本发明料液比与提取时间对多糖提取率影响的响应面S维图。
[0041] 图10为本发明料液比与提取时间对多糖提取率影响的响应面二维图。
[0042] 图11为本发明料液比与浸泡时间对多糖提取率影响的响应面S维图。
[0043] 图12为本发明料液比与浸泡时间对多糖提取率影响的响应面二维图。
[0044] 图13为本发明微波功率变化对多糖产率影响图。
[0045] 图14为本发明提取时间变化对多糖产率影响图。
[0046] 图15为本发明浸泡时间变化对多糖产率影响图。
[0047] 图16为本发明料液比变化对多糖产率影响图。
[0048] 图17为本发明抗衰老黑果构杞多糖的组成单糖分析图。
【具体实施方式】
[0049] 利用响应曲面法优化黑果构杞多糖的复合酶微波提取方法，包括W下步骤： (1)样品制备： 将黑果构杞果实洗净，在25~30°C温度下烘干48~7化后粉碎至40~80目，按20~40血/g料液比加入体积浓度为80%的己醇溶液，在25°C~35°