，得到粗品。
[0028]2.2将粗品3mg溶于3mL纯水中，过0.45 μ m膜，取ImL滤液置于安瓿瓶中，加入4mol/L三氟乙酸lmL，充队后封管，110°C条件下反应2h，冷却至室温，减压蒸干后向安瓿瓶中加入500 μ L甲醇再次蒸干，重复操作3次，除去残留的三氟乙酸，用ImL纯水复溶，过0.45 μ m膜，得样品液备用。
[0029]2.3标准溶液配制分别配制浓度均为6mmol/L的葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖6种单糖标准品组成的标准储备液，4°C条件下保存备用，标准品工作液由储备液进一步稀释得到6个浓度，过0.45 μ m膜后进行HPLC分析。
[0030]2.4取250 μ L混合标准品溶液、样品液，置于5mL具塞试管中，加入0.3mol/L NaOH溶液250 μ L，0.5mol/L PMP甲醇溶液250 μ L，混匀后70°C水浴反应2h，反应结束后试管冷却至室温，用250 μ L 0.3mol/L HCl中和反应体系，加入ImL氯仿充分震荡，静置，弃去下层有机相，重复3次，除去反应体系中未反应的PMP，W 100 μ L水稀释后过0.45 μπι滤膜后进行液相色谱分析。
[0031]2.5多糖中单糖种类鉴定及定量分析条件流动相为20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.7)-乙腈(83: 17)，流速为lmL/min，检测波长245nm，柱温30°C，进样量20yL，检测时间:30min。
[0032]本试验中，由于杂峰少且分离效果较好，可根据出峰时间及出峰顺序鉴定不同单糖种类(图1)。不同单糖的定量可利用每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标(Y)与标准溶液的浓度为横坐标(X)所分别建立的标准校正曲线检测实际样品时，根据样品所得的相对响应值，然后分别从标准曲线中读出样品中多糖中各种单糖含量。对结果利用统计学软件SPSS进行多重比较分析，结果显示两个品种在梨皮组织发育过程即花后不同时期均有差异。
[0033]本实例含量测定结果中(图2)，两个品种的果皮发育形成过程中均有差异且多数多糖中不同单糖含量在盛花后50d或75d差异最大，说明该时期为‘锈酥’果皮褐色的形成关键时期，该时期果皮细胞壁结构发生明显改变。
【主权项】
1.一种梨果皮组织多糖中单糖含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)称取定量果皮，用石油醚提取，过滤，收集滤渣，残渣用去离子水热提取，上清液减压浓缩至初始体积的1/3，加入无水乙醇，混匀，静置24h，离心得沉淀；沉淀配成水溶液，加入Sevage试剂震荡，离心，经真空冷冻干燥，得样品I ; 2)将样品I溶于纯水中，过0.45 μ m膜，取滤液置于安瓿瓶中，加入三氟乙酸，充队后封管，100-120°C条件下反应0.5-5h，冷却至室温，减压蒸干后向安瓿瓶中加入甲醇再次蒸干，重复操作2-5次，用纯水复溶，过0.45 μ m膜，得样品II备用； 3)取样品II，置于容器中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液，混匀后反应，反应结束后试管冷却至室温，用HCl中和反应体系，加入氯仿充分震荡，静置，弃去下层有机相，重复2-5次，加水稀释后过0.45 μ m滤膜后进行HPLC分析。
2.权利要求1所述的测定方法，还包括标准溶液配制步骤，具体为分别配制葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖6种单糖标准品组成的标准储备液，4°C条件下保存备用，标准品工作液由储备液进一步稀释得到6个浓度，过0.45 μπι膜后进行HPLC分析。
3.权利要求1所述的测定方法，其中HPLC的分析条件为流动相为20mmol/L磷酸盐缓冲液-乙腈，体积比为83: 17，流速为lmL/min，检测波长245nm，柱温30°C，进样量20 μ L，检测时间:30min。
4.权利要求1所述的测定方法，所述的梨为砀山酥梨和锈酥。
5.权利要求1所述的测定方法，所述步骤I)中石油醚提取的温度为70°C。
6.权利要求1所述的测定方法，所述步骤I)中热提取的温度为80°C。
7.权利要求1所述的测定方法，所述步骤I)为，称取定量果皮，用4-8倍体积的石油醚70°C提取l_4h，过滤，收集滤渣，残渣用8-12倍体积的去离子水进行热提取2-5次，水浴温度80°C，每次提取时间l_4h，提取液离心、合并上清液，置旋转蒸发仪40-60°C减压浓缩至初始体积的1/3，加入2-5倍浓缩液体积的无水乙醇，混匀，静置24h，离心得沉淀，沉淀配成5%的水溶液，加入1/3体积的Sevage试剂，震荡25min，离心，经真空冷冻干燥，得样品I。
8.权利要求1所述的检测方法，所述步骤I)为，称取定量果皮，用6倍体积的石油醚70°C提取2h，过滤，收集滤渣，残渣用10倍体积的去离子水进行热提取3次，水浴温度80°C，每次提取时间2h，提取液离心、合并上清液，置旋转蒸发仪50°C减压浓缩至初始体积的1/3，加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，混匀，静置24h，离心得沉淀，沉淀配成5%的水溶液，加入1/3体积的Sevage试剂，震荡25min，离心，经真空冷冻干燥，得样品I。
9.权利要求1所述的测定方法，所述步骤2)为，将样品I溶于纯水中，过0.45 μπι膜，取滤液置于安瓿瓶中，加入4mol/L三氟乙酸，充队后封管，110°C条件下反应2h，冷却至室温，减压蒸干后向安瓿瓶中加入甲醇再次蒸干，重复操作3次，用纯水复溶，过0.45 μ m膜，得样品II备用。
10.权利要求1所述的测定方法，所述步骤3)为，取样品II，置于5mL具塞试管中，加入0.3mol/L NaOH溶液，0.5mol/L PMP甲醇溶液，混匀后70°C水浴反应2h，反应结束后试管冷却至室温，用0.3mol/LHCl中和反应体系，加入氯仿充分震荡，静置，弃去下层有机相，重复3次，加水稀释后过0.45 μ m滤膜后进行HPLC分析。
【专利摘要】本发明涉及一种梨果皮组织多糖中单糖含量的测定方法，该方法包括称取定量果皮，用石油醚提取，残渣用去离子水热提取，过0.45μm膜，取滤液置于安瓿瓶中，加入三氟乙酸，充N2后封管，反应0.5-5h，加入NaOH溶液、PMP甲醇溶液混匀后反应等制备待测样品的步骤以及制备标准单糖溶液的步骤，并采用高效液相色谱法定性定量分析果皮多糖中不同单糖组分的含量，可用于比较多糖中不同单糖组分在水果不同时期果皮中的变化规律。该方法所需样品量少，能有效提高多糖中单糖组分含量的提取率，而且准确度高、重复性。
【IPC分类】G01N33-88
【公开号】CN104714037
【申请号】CN201510093050
【发明人】衡伟, 朱立武, 程召阳, 叶振风, 贾兵, 刘莉, 刘普
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月2日