用于产后子痫诊断的标志物及其检测试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于产后子痫诊断的标志物及其检测试剂。
【背景技术】
[0002] 子痫是指孕妇妊娠晚期或临产时或新产后，眩晕头痛，突然昏不知人，两目上视， 手足抽搐，全身强直、少顷即醒，醒后复发，甚至昏迷不醒的疾病，被称为"子痫"，又称"妊娠 痫征"。妊娠子痫是由先兆子痫症状和体征加剧发展而来的。子痫可发生于妊娠期、分娩期 或产后24小时内，被分别称为产前子痫、产时子痫和产后子痫，是产科四大死亡原因之一。 一旦发生，母儿并发症及死亡率明显增加，故应特别重视，紧急处理。孕妇一旦发生子痫，凶 多吉少，死亡率极高。
[0003] 子痫已成为当今全球性的医学社会问题之一，如何有效地实现早期预测和/或诊 断仍是非常棘手的问题。目前对于产后子痫的诊断还没有有效的分子。这一方面是由于这 些疾病具有很明显的复杂性和异质性，患者的病情轻重、病程急缓、发病早晚以及遗传背景 等均会导致临床表征的巨大差异；另一个重要因素是对疾病的发病机制和发生发展基础的 认识还非常有限。随着对这些疾病表征认识的不断深入，加之现代生物学技术的飞速发展， 妊娠重大疾病的发病机制研宄也面临着全新的机遇和挑战。开展相关疾病机理的深入而系 统的研宄，将发现可用于疾病的预测、诊断、治疗和预后的关键生物靶标分子，这是最大限 度地降低妊娠重大疾病造成的母儿危害、提高女性健康水平的重要途径，也将为从生命早 期宫内发育的环节上防治糖尿病、高血压等成年慢性疾病提供关键的科学依据。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种用于产后子痫诊断的标 志物一WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种或两种的组合。
[0005] 本发明还提供了一种以WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种或两种的组合为标志物 制备的用于产后子痫诊断的试剂。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明以正常妊娠妇女和产后子痫患者的蜕膜组织为材料进行研宄，通过免疫组 化检测WNT4、WNT5A在蜕膜组织中的表达情况；通过Real-timePCR、Westernblot分别检 测蜕膜组织中WNT4、WNT5A在mRNA和蛋白质水平的表达量，结果发现，与正常妊娠妇女组相 比，产后子痫患者的蜕膜组织中，WNT4、WNT5A在mRNA和蛋白质水平的表达量明显降低，推 测这可能会导致蜕膜损伤，进而会引发产后子痫。因此，WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种 或两种的组合可以作为产后子痫预防和/或诊断的标志物。
[0008] 优选的，以WNT4蛋白和WNT5A蛋白的组合作为产后子痫预防和/或诊断的标志 物。
[0009] 一种用于产后子痫临床诊断的试剂盒，包括抗WNT4抗体和抗WNT5A抗体中的一种 或两种、HRPrabbitanti-goat抗体，以及抗0-actin抗体。
[0010] 采用该诊断试剂盒进行产后子痫临床诊断的方法，在孕妇剖宫产分娩出胎盘后， 采集蜕膜组织，提取蜕膜组织中的全蛋白，进行凝胶电泳，根据蛋白Marker条带和WNT4、 WNT5A及-actin分子量，切下含有目的蛋白的胶条，放到转移缓冲液中，用以后续转膜； 根据切下的待转膜的胶条的大小，剪取适当大小的聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），将PVDF膜 放入甲醇中，活化30s;将活化的膜放入三蒸水中清洗2分钟；将膜放入转移缓冲液中，和胶 条一起浸泡15分钟进行渗透；渗透完毕后，打开转膜夹，从正极到负极依次按照1层海绵、2 层滤纸、PVDF膜、胶条、2层滤纸、1层海绵的顺序铺到转膜夹上；各层都铺放整齐后，将转膜 夹扣紧，放到转膜槽中，倒入转移缓冲液，注意缓冲液要没过海绵；接通电源，设定为120mA 恒流，转膜50分钟，一定要注意确认电源的正负极，及蛋白是由胶向PVDF膜的方向转移；封 闭：转膜结束后，将PVDF膜取出，膜上会有清晰的蛋白Marker条带，然后将膜放入5%的脱 脂奶粉中，在摇床上轻摇封闭1. 5小时；
[0011] 一抗孵育：将PVDF膜从封闭液中取出，分别放入所对应的一抗工作液中，用封口 机封好后，放入4°C冰箱孵育过夜；
[0012] 洗膜：第二天早上，将孵育的膜从冰箱拿出，室温下平衡30分钟，然后将PVDF膜放 入1XTBST中，轻摇清洗4次，每次15分钟；
[0013] 二抗孵育：将PVDF膜分别放入所对应的二抗工作液中，室温下在摇床上轻摇孵育 1小时，注意：13 -actin不需要二抗孵育；
[0014] 洗膜：二抗孵育结束后，用1XTBST轻摇清洗4次，每次15分钟；
[0015]显影：
[0016] (1)根据PVDF膜的大小，配制适量的ECL反应液（分为A液和B液），用移液枪分 别吸取等量的A液和B液混匀，约lOOulECL反应液/cm2膜，注意避光；
[0017] (2)用吸水纸吸干PVDF膜上的液体，然后将膜正面向上放到干净的一次性PE手套 上，在膜上滴加配好的ECL反应液，保证反应液将膜完全覆盖，避光反应约3分钟左右，期间 可将膜正反颠倒，保证膜充分接触反应液。
[0018] 图像结果处理：
[0019] (1)将显影得到的蛋白条带图像用Quantiscan软件处理，得到条带的灰度值，即 NetArea的读数；
[0020] (2)记录所有研宄对象WNT4、WNT5A及0 -actin条带的灰度值，然后计算目的蛋 白与0-actin的灰度值比值。
[0021] 结果判定：
[0022] 以阴性蜕膜组织（正常健康妊娠女性的蜕膜组织）为对照，待检测孕妇的蜕膜组 织的WNT4蛋白的相对表达量与阴性对照的比值小于0. 72，WNT5A蛋白的相对表达量与阴性 对照的比值小于0. 56,满足上述两个条件之一，即判定为阳性。
[0023] 本发明的有益效果：
[0024] 本发明通过检测出WNT4、WNT5A在产后子痫患者蜕膜组织中的低表达，提供了一 种新的产后子痫临床诊断的标志物一WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一种或两种的组合，进一 步的，以该检测标志物制备的检测试剂，具有敏感性强、特异性高等优点，可广泛用于临床 类产后子痫初步调查和健康普查，为临床诊断提供可靠依据。
【附图说明】
[0025] 图1为WNT4和WNT5A蛋白在两组蜕膜中的表达分布情况，A、C和E为NP组蜕膜 组织切片，B、D和F为产后子痫组蜕膜组织切片，褐色显示的是靶蛋白，标数字1的代表放 大倍数为200X，标数字2的代表放大倍数为400X，箭头所指为蜕膜细胞；NP，正常妊娠组； NC，阴性对照；标尺=50ym;SPE，产后子痫组；
[0026] 图2为WNT4和WNT5A蛋白表达水平实验结果；
[0027] 图3A为WNT4mRNA水平的表达实验结果；B为WNT5AmRNA水平的表达实验结果。
【具体实施方式】
[0028] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0029] 实施例1 :用于产后子痫临床诊断标志物的发现与验证
[0030] 1. 1研宄对象的选择及分组
[0031] 本实施例的研宄对象均为2014年1月至2015年1月期间，在济南市山东大学齐鲁 医院妇产科进行剖宫产手术终止妊娠的女性，共40例。其中包括产后子痫患者（SPE组）20 人，作为产后子痫组，该组平均年龄为29. 40±1. 111，平均孕周为36. 78±0. 625。正常健 康妊娠女性20人，作为正常妊娠组（NP组），该组平均年龄为28. 73±0. 639,平均孕周为 39. 10±0. 233。
[0032] 1. 2蜕膜组织标本的采集及处理
[0033] 1. 2. 1组织采集：在孕妇剖宫产分娩出胎盘后，用无菌纱布擦拭胎盘附着部位的 子宫壁，然后从纱布上取下擦拭下来的组织，用无菌滤纸反复吸净组织上的血液，再放入无 菌小瓶中，作好标记，然后迅速放入小型液氮罐中以备带回实验室做进一步处理，整个操作 过程要迅速。
[0034]1. 2. 2组织处理：
[0035] 将组织带回实验室后，从液氮罐里取出组织，保持在冰冻状态下做如下处理：
[0036](1)分出一块约0. 5cmX0. 5cmX0. 5cm大小的组织块放入包埋剂OCT中，然后放回 液氮罐保存，用于后续冰冻切片。
[0037] (2)迅速分出约80mg组织，放入lmlRIPA裂解液中，并放到-80°C冰箱保存，用于 后续提蛋白。
[0038] (3)迅速分出约40mg组织，放入lmlTRIzol中，并保存于-80°C冰箱，用于后续提 RNA〇
[0039] 1. 3WNT4及WNT5A在蜕膜组织中的表达分布研宄
[0040] 1. 3. 1试剂材料：
[0041] APES，DAB试剂盒，HRPgoatanti-rabbit，HRPrabbitanti-goat均购于北京中 杉金桥生物科技有限公司；包埋剂OCT购于美国SAKURAFinetek公司；BSA购于Promega 公司；TritonX-100购于Amresco公司；抗WNT4抗体，抗WNT5A抗体均购买于美国Santa CruzBiotechnology公司；NaCl，KCl，Na2HP04，KH2P0, 30%H202，甲醇，无水乙醇，丙酮，二甲 苯等均为国产分析纯。
[0042]1. 3. 2溶液配制：
[0043] (1)配制 10XPBS:分别取NaCl40. 03g，KC1 1. 005g，Na2HP047. 7g，KH2P040 . 95g， 加入烧杯中，然后加入三蒸水约400ml，再调节pH到7. 4,最后用三蒸水定容至500ml即可。
[0044] (2)配制 3%TritonX-1