一种心肌梗死快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疾病检测制剂技术领域，具体涉及一种心肌梗死快速检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 心肌梗死（myocardialinfarction，MI)是冠状动脉闭塞，血流中断，使部分心肌 因严重的持久性缺血而发生局部坏死的病症。临床症状有剧烈而较持久的胸骨后疼痛，发 热、白细胞增多、红细胞沉降率加快，血清心肌酶活力增高及进行性心电图变化，可发生心 律失常、休克或心力衰竭。心肌梗死是属于冠状动脉粥样硬化性的一种心脏病。
[0003] 急性心肌梗死（acutemyocardialinfarction，AMI)是指因持久而严重的心肌缺 血所致的部分心肌急性坏死。目前临床上确诊AMI依靠检测心脏标志物、心电图、影像（超 声、磁共振）及临床证据，按全球定义标准执行。诊断AMI检测试剂盒的开发与市场化欠规 范，产品陈旧，需要新组合产品。2000年AMI全球定义提出检测cTnl、cTnT、MYO、CK-MB作 为诊断AMI的第一标准，2007和2012年欧美和全球AMI指南中cTnl和cTnT做为临床诊 断依据，不再提MY0、CK_MB。近年来研宄发现心脏型脂肪酸结合蛋白（heartfattyacid bindingprotein，H-FABP)，是极早期确定和排除AMI的重要依据。大量研宄和临床资料表 明心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP)是极早期诊断和排除AMI的标志物，补充cTnl较迟出 现的不足。欧美急诊中心联合应用，H-FABP和cTnl，对诊断AMI的阳性预测和阴性排除都 达到90%以上。
[0004] 当前国内医院多用单独检测cTnl、cTnT、CK、CKMB或应用Myo、CKMB、cTnl三联。 单独指标不能早、中、晚全程判断AMI，CK、CKMB、Myo、cTnT的诊断假阳性高达30-50%。目 前市场常用的急性心肌梗死检测试剂盒多采用以Au纳米颗粒结合抗体形成复合物，检出 待测标志物。Au纳米颗粒与抗体蛋白之间通过范德华力进行结合，其结合力不牢固，易造成 检测灵敏度不稳和下降、产品批内和批间一致性较低，差异达不到小于10%要求。
【发明内容】
[0005] 为了满足急性心肌梗死早期、快速、高灵敏检测重大临床应用的需求，进一步提高 检测的灵敏度、准确率和时效性，以便在发病早期予以准确诊断，本发明提供了一种心肌梗 死快速检测试剂盒。
[0006] 本发明提供的心肌梗死快速检测试剂盒，包括cTnl检测试剂、cTnT检测试剂和 H-FABP检测试剂。
[0007] 优选地，所述cTnl检测试剂为cTnl捕获抗体，所述cTnT检测试剂为cTnT捕获抗 体，所述H-FABP检测试剂为H-FABP捕获抗体。
[0008] 优选地，该试剂盒还包括阴性对照试剂和阳性对照试剂，两种对照试剂和三种检 测试剂均以纸基为载体，所述纸基为亲水性多孔层状材料，各试剂在纸基上的包被位置互 不交叉；所述阴性对照试剂为PBS溶液或Tris盐酸溶液，阳性对照试剂为cTnl捕获抗体。
[0009] 其中，PBS溶液或Tris盐酸溶液均可以购买市售商品或者自行配制，属于现有技 术内容，二者的pH值均优选在7. 4~8.0的范围。
[0010] 优选地，所述纸基为硝酸纤维素纸。以CELLULOSENITRATESTRIPS11306-41BL最 佳，该型号的硝酸纤维素纸购自SartoriusStedim。
[0011] 优选地，所述PBS溶液的pH值为7. 4~8. 0,经过包被的纸基位置由10% (w/v) BSA(牛血清白蛋白）溶液封闭。
[0012]优选地，该试剂盒还包括经标记物标记的cTnl、cTnT和H-FABP检测抗体混合液 (即经标记物标记的cTnI检测抗体、经标记物标记的cTnT检测抗体和经标记物标记的 H-FABP检测抗体三者的混合液）；cTnI阳性对照样品、样本洗涤液1和样本洗涤液2 ;样本 洗涤液1为含有〇? 05 % (v/v)Tween-20的PBS溶液，洗涤液pH值为7. 4~7. 8 ;样本洗涤 液2为含有0? 2 % (v/v)Tween-20的PBS溶液，洗涤液pH值为7. 4~7. 8 ;当标记物为酶 时，该试剂盒还包括该酶的对应反应底物；当标记物为生物素时，该试剂盒还包括对应结合 该生物素的亲和素。其中Tween-20为现有常规试剂，可直接购买市售商品。
[0013] 优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。
[0014] 另外，本发明的心肌梗死快速检测试剂盒还配有标准曲线测定纸基芯片。标准曲 线测定纸基芯片上有多个检测单元。
[0015] 标准曲线测定纸基芯片，检测浓度范围为0-100ng。每个试剂盒配有标准曲线测定 纸基芯片，多个检测单元均包被同一种蛋白捕获抗体。下面以cTnI为例进行说明：
[0016] (1)测定标准曲线时，在检测单元的检测区滴加不同浓度的cTnI(或cTnT、 H-FABP)蛋白1yL，阴性对照检测单元的检测区滴加1yLPBS溶液，在室温下晾干5min。
[0017] (2)将纸基芯片浸入10% (w/v)BSA溶液中进行封闭，30min后取出。
[0018] (3)将lyL的cTnI(或cTnT、H-FABP)蛋白检测抗体滴加到检测区，2min后，将 芯片放于含有〇? 05% (v/v)Tween-20的3mLPBS溶液（pH7. 4)中，洗涤3min，取出。
[0019] (4)取250yL混合化学发光底物于纸基芯片上，2min后吸出。
[0020] (5)将纸基芯片放于化学发光检测器（Las4000)中检测，曝光时间10min，得到化 学发光图像。
[0021] (6)处理得到化学发光图像，用Photoshop软件处理读数，读取检测区的灰度值， 计算得到测定cTnl(或cTnT、H-FABP)蛋白的标准曲线。
[0022] 本发明还提供上述心肌梗死快速检测试剂盒的制备方法，步骤为：
[0023] (1)采用一对相互啮合、边缘锋利的金属模具，按照设计尺寸以压印的方式在室温 下制作纸基，其中预留的待包被区直径为4~6mm;
[0024] (2)在纸基芯片不同的待包被区分别滴加cTnT捕获抗体、cTnl捕获抗体、H-FABP 捕获抗体、阴性对照试剂和阳性对照试剂（不同试剂滴加在不同待包被区，也就是检测 区），室温晾干；
[0025] (3)晾干后的纸基用10% (w/v)BSA溶液室温封闭30min，润湿状态密封后置于 2~8°C环境下保存。
[0026] 本发明的试剂盒，还有另一种优选的技术方案，即所述cTnl检测试剂为经标记物 标记的cTnl检测抗体，所述cTnT检测试剂为经标记物标记的cTnT检测抗体，所述H-FABP 检测试剂为经标记物标记的H-FABP检测抗体。
[0027] 优选地，该试剂盒还包括cTnl阳性对照样品，10 % (w/v)BSA溶液和样本洗涤液； 所述样本洗涤液为含有〇? 05 % (v/v)Tween-20的PBS溶液，洗涤液pH值为7. 4~7. 8 ;当 标记物为酶时，该试剂盒还包括该酶的对应反应底物；当标记物为生物素时，该试剂盒还包 括对应结合该生物素的亲和素。其中所述标记物为辣根过氧化物酶最佳。
[0028] 本发明具有以下有益效果：
[0029] 本发明三项指标并用，集成在一起制备成试剂盒，方便携带，检测过程简单，通过 同时对心肌肌钙蛋白I(cTnl)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP) 的快速检测，能在发病1小时内诊断或排除AMI，确定发病的阶段，评估病危程度，具有床边 和现场快速应用等优点。实现极早期确认或排除AMI，危险度分层，达到全程监测AMI目标。
[0030] 相较于现有技术中H-FABP和cTnl的联合使用，本发明的研宄发现，cTnT在心肌 梗死患者中的增高倍数和持续时间要优于cTnl。H-FABP在心肌损伤后可快速释放入血液， 对于心肌梗死发作6小时（尤其3h)内的诊断灵敏度最好；cTnI和cTnT在心肌梗死发 生早期诊断灵敏度低，但持续时间优于H-FABP，尤其是cTnT，最长可持续到14天，即患者在 发病10天后仍能检测是否患AMI。但cTnT的特异性不如cTnI，骨骼肌的损伤、肾脏疾病 会影响cTnT的检测，出现假阳性。三联检测可使AMI的检测时间窗达到最大，并且具有更 高的敏感性和较强的特异性（避免假阳性）。
【附图说明】
[0031] 图1是双抗体夹心