专利名称：一种生产尼可霉素z的方法及其专用培养基和工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产尼可霉素z的方法及其专用培养基和工程菌。
背景技术：
尼可霉素属于核苷肽类抗生素，与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺 的结构类似，是该酶的强竞争性抑制剂。由于几丁质是真菌细胞壁，昆虫以及其它无 脊椎动物外骨骼的重要组成部分，因此，尼可霉素能有效地抑制真菌、昆虫和螨虫， 而对哺乳动物、蜜蜂和植物无毒或者毒性极低，并且尼可霉素在自然界中易降解，因 而尼可霉素是一种理想的农用抗生素。田间试验证明尼可霉素对很多植物病害，如小 麦白粉病、烟草红斑病、黄瓜菌核病、番茄叶霉病、苹果轮斑病等都有很好的防治效果。同时，研究表明尼可霉素能够有效地抑制人体深部感染真菌一白色念珠菌 ("/^iA a7Z^ca/7s)，尼可霉素Z作为口服药物对粗球孢子菌和芽生病菌也有明显的疗效。目前，越来越多的人面临着自身免疫系统疾病(如艾滋病患者、器官移植病 人和接受放化疗的癌症患者)和其他原因引起的免疫能力下降而引起的危及生命的真 菌感染，因此，作为抗真菌药物的尼可霉素Z有着巨大的应用和开发前景。尼可霉素X组分和Z组分为天然的同分异构体，要将其分离难度较大。即使是采 用HPLC的方法，用三氟乙酸作为流动相也不能有效地分离X组分和Z组分。使用HPLC， 用离子对试剂能分离X组分和Z组分，但所使用试剂昂贵，不适合用于大规模的工业 生产。 发明内容本发明的目的是提供一种重组圈巻产色链霉菌。本发明所提供的重组圈巻产色链霉菌，是尼可霉素生物合成基因M/7尸被阻断的 圈巻产色链霉菌。所述的重组圈巻产色链霉菌具体可为圈巻产色链霉菌(6Yr印^/^ces 雄oc力，柳酒)TH322 sanPD CGMCC No. 3086。圈巻产色链霉菌(5Yj-epto/z /ces朋soc力r咖oge/7es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086 已于2009年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简 称为CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 3086。本发明的目的是提供一种生产尼可霉素Z的方法。本发明所提供的生产尼可霉素Z的方法，是发酵圈巻产色链霉菌(5Y/^^o/^ces朋socAr哪o《e"es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086，得到尼可霉素Z。所述圈巻产色链霉菌(5Yr一o/z 7ce51朋socAro/z c^e/2e50 TH322 sanPD CGMCC No. 3086的发酵是在生产尼可霉素的专用培养基上进行的；所述生产尼可霉素的专用 培养基组成为每升培养基中含有30 g葡萄糖，30 g甘露醇，5 g大豆蛋白胨，8 g 酵母提取物，10g可溶性淀粉和3 g尿嘧啶，其余为水。本发明的再一个目的是提供利用圈巻产色链霉菌(5Yrep^/^"s 朋socAro历o《OTes) TH322 sanPD CGMCC No. 3086生产尼可霉素Z的培养基。本发明所提供的培养基，组成为每升培养基中含有30g葡萄糖，30g甘露醇， 5 g大豆蛋白胨，8 g酵母提取物，10g可溶性淀粉和3 g尿嘧啶，其余为水。发明人根据尼可霉素生物合成途径和尼可霉素X组分和Z组分的结构差异，推测 编码二型硫酯酶的ss/2尸基因是合成尼可霉素X组分核苷部分的重要基因，该基因阻 断可导致尼可霉素X组分不能生物合成，仅定向积累尼可霉素Z组分。本发明获得了只产生单一尼可霉素Z组分的基因工程菌株，并优化了其培养基， 可以大规模生产单组分的尼可霉素Z，产量可以达到原出发株圈巻产色链霉菌TH322 的4.5倍，其可以降低生产成本，对简化发酵后续产物的分离纯化有重要的意义。
图1为圈巻产色链霉菌(5Yre/^咖yces朋soc力2YM7c^e/7es) TH322 s朋尸基因阻断 的PCR验证图电泳的第一道M为分子量标准，第二道sanPD为圈巻产色链霉菌(5Yrepfo/z /ces 朋soc/ 2YM7o《e/2es) TH322 sanPD，第三道WT为圈巻产色,连霉菌TH322。图2为圈巻产色链霉菌(5"^repz^/H7ces朋wcAroM^e/ es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086和圈巻产色链霉菌TH322发酵产物的HPLC检测结果。其中，A为圈巻产色链霉菌TH322发酵产物的HPLC结果，B为圈巻产色链霉菌 (Strepto/^ces朋socAro历oge/2es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086发酵产物的HPLC结 果。X， Z分别代表尼可霉素X和尼可霉素Z的产量。图3为圈巻产色链霉菌(6Yr印"/z /ces朋soc力ro/z oge/7es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086和圈巻产色链霉菌TH322发酵产物的生物活性检测结果。其中，所用指示菌为白色念珠菌，A为圈巻产色链霉菌TH322发酵产物的抑菌圈， B为圈巻产色链霉菌(5Yr印fcM 7ces朋socAra/z oge;2") TH322 sanPD CGMCC No. 3086 发酵产物的抑菌圈。
具体实施方式
下述实施例中所有涉及含量的百分数均为质量百分数。该基因工程菌的具体构建方法(1) 设计并构建sa;7尸基因破坏的重组质粒pSNP4。(2) pSNP4通过接合转移导入圈巻产色链霉菌TH322中进行同源重组。(3) 通过卡那霉素抗性筛选获得可能的转化子，42 "C温敏后分别影印到新的培 养皿，筛选卡那霉素抗性和安普霉素敏感的转化子。通过PCR验证，最终筛选到s朋尸 阻断的突变株sanPD(sa"尸Disruption)。实施例1、圈巻产色链霉菌(5Yr印fOTyc"朋^ c力ro/z t^e/3es) TH322 sanPDCGMCC No. 3086的构建本实施例使用的尼可霉素产生菌为圈巻产色链霉菌株TH322。圈巻产色链霉菌 TH322是通过诱变圈巻产色链霉菌7100 CGMCC 4.321 (购自中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心)而得来的菌株。圈巻产色链霉菌7100CGMCC4.321 (购自中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)的孢子呈丝钩状，或圈巻，很少成圈 环;孢子为球形或椭圆形。圈巻产色链霉菌株TH322的尼可霉素Z初始产量为350 mg/L。从圈巻产色链霉菌7100 CGMCC 4. 321中提取其基因组DNA，用消化，脉 冲电泳分离后回收40-50kb的DNA片段，同时用Sa/sHI (&"3AI同尾酶)酶切科斯质 粒supercosl (Stratagene)，去磷酸化后与回收的DNA片段以T4 DNA连接酶链接， 转化大肠杆菌XL 1-blue MR (Stratagene),获得含有尼可霉素生物合成基因簇片段 的重组科斯质粒文库，利用m/7F基因的部分片段(500 bp，序列2)的地高辛标记的 探针筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重组科斯质粒(cosG4)的阳性 克隆；尼可霉素生物合成基因簇片段a从5' —3'依次为sa;^上游8. 9kb， sa/^， s朋K，S朋Z/' S朋r, s朋S s朋《 Sa/7" 513《 S朋G 513/^ S朋爽 SSd, 51372《S朋乂 Sa成sa/ /, sa/ /7, sa风 5^;i5' sa"邻部分5v3/7鹏该部分s朋朋为s朋"沖与sa77邻 连的500bp片段。为了破坏s朋尸基因，用和5^cl酶切cosG4，将得到的尼可霉素生物合成簇 中含有全长sa/ 尸基因的2. 5 kb尸"I-5^cI片断连接到pBluescript II KS (-) (strategene)的尸"I和^cl位点间，得到质粒pBS:: s朋尸，用酶切 pBS::s朋尸，再用Klenow酶处理补平末端，回收该5. 5 kb的DNA片段；同时用^aMI1 和勤/2l双酶切重组质粒pUC119::A2z/"。绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)处理切平 末端，回收约lkb的卡那霉素抗性基因片段；连接该两段DNA片段，得到质粒pSNPl。 尸WI和feci双酶切pSNPl，回收3. 46 kb插入片段，与相同双酶切的质粒pIJ2925 (John Innes Institute, Norwich, UK)相连接，得到质粒pSNP2。 pSNP2经射II酶切，3.5 kb的外源片段与经^MH酶切的质粒pKC1139 (John Innes Institute, Norwich, UK)连接，最后得到重组质粒pSNP4。上述质粒pUC119:: AW是按照如下方法构建的将核苷酸序列是序列表中的序列1 的卡那霉素抗性基因片段插入载体pUC119 (Takara)的AY"cII中得到pUC119::AW。将pSNP4转化￡ c。7i ET12567/pUZ8002 (John Innes Institute, Norwich, UK) 感受态细胞，通过接合转移转入圈巻产色链霉菌TH322。安普霉素筛选，随机挑选转 化子，转接至含有卡那霉素和安普霉素的酵母膏-麦芽膏(YEME)培养基(Difco Yeast Extract 3 g ， Difco Tryptone 5 g， Oxoid Malt Extract 3 g ， Sucrose 200 g ，加蒸馏水定容至1000 ml，使用前加入下列灭过菌的溶液MgCl2*6H20 (2. 5M) 2 ml， Glucose (50%) 20 ml， Glycine (10%) 50 ml)中培养，提取质粒、酶切验证。 验证正确的转化子转接至含有卡那霉素的基本培养基上(丽培养基)(琼脂10 g， L-天冬酰胺0. 5 g， K2HP04 0 . 5 g， MgS04 7H20 0. 2 g， FeS04. 7H20 0. 01 g，加蒸馏 水定容至1000 ml,使用前加入50 ml 10%甘露醇)，28'C培养7天，制备孢子悬液， 梯度稀释后，以每个平皿约104个孢子的浓度涂布在含有卡那霉素的MM平板上于42 。C培养。质粒pKC1139 (John Innes Institute, Norwich, UK)具有温度敏感型复制 子，在42'C条件下培养不能自主复制，重组质粒pSNP4只有与圈巻产色链霉菌TH322 染色体DNA发生同源重组，才能在含有卡那霉素的基本培养基上生长。若发生双交换， 则卡那霉素抗性基因(《朋r)正确地插入到靶基因内部，此时菌落表现为卡那霉素抗性和安普霉素敏感(Kan7Aprs)。将表现Kan7Apr5的菌落同时影印到含有上述两种抗 生素的MM平板上28。C培养。随机挑选突变株接种在没有任何选择压力的基本培养基 上2『C培养，转接3代后重新接种到分别含有卡那霉素和安普霉素的基本培养基上， 结果仍然表现为卡那霉素抗性和安普霉素敏感(Kan7Apr5)，说明通过双交换得到了 遗传稳定的阻断突变株，将其中一株编号为TH322 sanPD的圈巻产色链霉菌突变株于 2009年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为 CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 3086。以圈巻产色链霉菌TH322和圈巻产色链霉菌(5Yr印to/^ces a"soc/ ro历ogey2es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086 (即尼可霉素Z组分工程菌)的基因组DNA作为模板， 使用引物Pl (GCGGCCAGCTACTTCCGGGAC)和P2 (GCAGAAAGGCCGAGCGCATGT)，进行PCR验 证。PCR体系为H20 27 Mi, 二甲基亚砜DMS0 2.5叱，10XK0D buffer 5 ML， dNTP 5 PL, MgCl2 2叱。浓度5 pmol/叱的Pl/P2各3叱，DNA模板1. 5 PL, KOD plus ( T0Y0B0 CO., LTD. Japan ) l叱，总体积为50叱。混匀进行PCR ， PCR程序为95 。C预变性2 min; 94 °C 30 s， 55 °C 30 s， 68。C1.5 min，共30个循环；68《C延伸10 min。 PCR扩增结束后用琼脂糖电泳检测扩增片段大小，如图1所示，结果表明圈巻产色链 霉菌TH322中扩增长度为424 bp，圈巻产色链霉菌(6Yrepz^迈yces a/^ocAr咖oge/ e^) TH322 sanPD CGMCC No. 3086的扩增长度为1400 bp。实施例2、圈巻产色链霉菌(5Yre/^o/77ycesa/L5oc/ rofflo《e/ es)TH322 sanPDCGMCC No. 3086发酵产物的HPLC分析和生物活性检测1) 圈巻产色链霉菌(5Yrepto/syces a"soc/Lra历c^e/3es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086 发酵产物的制备将圈巻产色链霉菌("5Yr一輝ces愿。c力,。呵e腦)TH322 sanPD CGMCC No. 3086 分别接种在YEME培养基上(Difco Yeast Extract 3 g ， Difco Tryptone 5 g， Oxoid Malt Extract 3 g ， Sucrose200 g ，加蒸馏水定容至1000 ml，使用前加入下列灭 过菌的溶液MgCl2 6H20 (2. 5M) 2 ml, Glucose (50%) 20 ml， Glycine (10%) 50 ral) ， 28 °C，转速180 rpm，培养48 h后，转移1 ml菌液到50ml发酵培养基 SP培养基中，28°C，转速180rpm，培养5天，离心收集发酵液。发酵实验重复3次。SP培养基按照如下方法配制葡萄糖30 g，甘露醇30 g，大豆蛋白胨5 g，酵 母提取物8 g，加适量的去离子水溶解；再加入10 g的可溶性淀粉，加热至80 'C， 放置15分钟，再加热至沸腾，此时溶液成透明；再加入3g尿嘧啶，待溶解后，加去 离子水定容至1000 ml，调节pH至7. 00。2) 圈巻产色链毒菌(5Yr印to/ yces朋wcAr，og^es:i TH"2 sanPD GGMGG No. 3086 发酵产物的HPLC分析将离心后的发酵液通过0.25 Mm的微孔滤膜过滤，滤液进行HPLC分析。所用仪 器为Agilent 1100 HPLC，分析柱为Agilent公司的Z0RBAX SB-C18柱(4. 6X 150mm, 3.5to)，预柱为Agilent公司的SB C-18柱(4.6X12.5mm， 5Mffl)。所用试剂为，试 剂A: 10 mM庚垸磺酸钠盐和O. 72 ml/L冰乙酸的水溶液；试剂B: 10 mM己烷磺酸钠 盐和0.72 ml/L冰乙酸的水一乙腈(6:4)溶液；HPLC梯度洗脱条件为流速lml/min， 25分钟内，试剂B的线性梯度从13 %到45 %，试剂A 的线性梯度从87 %到55 %。结果表明，与圈巻产色链霉菌TH322相比，圈巻产色链霉菌(S^印^/^ces a/^ocArcMK^e;2es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086产生的尼可霉素Z组分含量增加了 25%。尼可霉素Z标准品(Sigma)出峰时间为22. 3分钟，样品的出峰时间为22. 3分 钟，以尼可霉素Z的峰面积绘制标准曲线。其中，进行定量的尼可霉素Z标准曲线是Y二6.7357X-181.52 (Y为峰面积，X为 尼可霉素z浓度mg/L)。在步骤1)的SP培养基条件下圈巻产色链霉菌(5Yre;^o/B7ces 朋soc力ro历o《朋es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086发酵5天的发酵液的滤液中的尼可霉 素Z的峰面积为1665. 2±39. 17;在步骤1)的SP培养基条件下圈巻产色链霉菌TH322 发酵5天的发酵液的滤液中的尼可霉素Z的峰面积为2060. 75±22. 7。如图2所示，使用优化培养基(SP培养基)后，HPLC检测表明，圈巻产色链霉 菌(5"^re/^咖yces朋soc7^ra/zrage"es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086只产生尼可霉素 Z，并且产量是圈巻产色链霉菌TH322的4. 5±0. 08倍，达到1600±20mg/L的水平。3)圈巻产色链霉菌TH322 sanPD发酵产物的生物活性检测取3mL麦芽汁培养基(10 g麦芽汁，1.5%琼脂)置于15X150 mm试管中，灭菌 后摆放成3.5 cm长度斜面；于斜面上接种少量白色念珠菌，28t:培养l天后，用50 ml带玻璃珠的无菌水将斜面上的菌体洗下，并将菌体打散混匀，制成菌悬液，按2% 的加量将菌悬液加至PDA培养基中(20g土豆汁，20g葡萄糖，8g琼脂，加蒸馏水 定容至1000 ml)，于直径15 cra的培养皿中倒入该PDA菌液约60 mL;待其凝固后， 将在步骤l)中SP培养基培养5天的发酵液加入用打孔器在检测平板上打出的小孔中， 每孔加入发酵液约50叱，28 C培养18-24小时，检测抑菌圈大小。实验重复3次。 如图3所示，在加入本发明提供的圈巻产色链霉菌(5Yre/7to/z /ces朋socAr咖oge"es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086的发酵产物后，白色念珠菌有抑菌圈出现，说明能够达 到与圈巻产色链霉菌TH322相同甚至更好的抑菌效果，并且在培养基条件优化后，圈 巻产色链霉菌(5Yre/7fo/z /ces朋^c力r咖oge"es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086的抑 菌活性明显强于圈巻产色链霉菌TH322。序列表〈110>中国科学院微生物研究所<120> —种生产尼可霉素Z的方法及其专用培养基和工程菌<210> 1 <211> 976 〈212> DNA 〈213>人工序列<400> 1tcccctggat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 60agcggaagaa tcaaattatc gaggttgaca ccttttgccg attctggtag aatgacacca 120acatagatcg atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 180gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 240aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 300ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 360ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 420aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 480accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 540ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 600ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 660cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcacatacc cgacggcgag gatctcgtcg 720tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 了80tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 840gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 900tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag %0cgggactctg gggttc〈110〉中国科学院微生物研究所<120> —种生产尼可霉素Z的方法及其专用培养基和工程菌976<210> 2〈211〉 500〈212〉 DNA <213>人工序列<400〉 2cgatccccgg cagcggccgg gcagcgaacc gacgaggggt cggcaggggc ccgcggacag 60gctgtggcca ggtcaggccc gggccgtccc gggcccacgc atcgacccca aggagacacc 120gtggtgctga cgctcgactc ggcgctggag gaacgtaccc agccgttcca gctcttccgc 180ggccgtgacc tgctcgacga cgggcaactg gacgagctgc tcgcgaccgt gccgaccgcc 240gacgtcgcga agatcgcggt cgaggacccg aagcacgaga agcagtaccg gatgaacctc 300gtggacctca tcgtcctcga aaaggaagcc ccggtcttcc cccgcctgcc cggggtctgg 360cgcgacctcg tggaggacct gcgcggcgcc gagttcaccg cctggctgga gaagtcgacc 420gggatcgaac tggccggcct gcagcgcagc atcggcctct acacccaccg caacggtgac 480tacctgtcgg tacacaagga 500
权利要求
1、一种重组圈卷产色链霉菌，是尼可霉素生物合成基因sanP被阻断的圈卷产色链霉菌。
2、 根据权利要求l所述的重组圈巻产色链霉菌，其特征在于所述重组圈巻产 色链霉菌为圈巻产色链霉菌(5Yre/ t湖j^es朋soc/ r，oge/2es) TH322 sanPD CGMCC No. 3086。
3、 一种生产尼可霉素Z的方法，是发酵权利要求1或2所述的重组圈巻产色链 霉菌，得到尼可霉素Z。
4、 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵中采用的培养基组成为 每升培养基中含有20-40 g葡萄糖，20-40 g甘露醇，4-6 g大豆蛋白胨，6-10 g酵 母提取物，8-12g可溶性淀粉和1-4 g尿嘧啶，其余为水。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵中采用的培养基组成为 每升培养基中含有30g葡萄糖，30g甘露醇，5g大豆蛋白胨，8g酵母提取物，10g 可溶性淀粉和3 g尿嘧啶，其余为水。
6、 一种利用圈巻产色链霉菌(5"tre/^，yces朋soc/ ro/w^OTes)TH322 sanPD CGMCC No.3086生产尼可霉素Z的专用培养基，培养基组成为每升培养基中含有20-40 g 葡萄糖，20-40 g甘露醇，4-6 g大豆蛋白胨，6-10 g酵母提取物，8-12g可溶性淀 粉和1-4 g尿嘧啶，其余为水。
7、 如权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述发酵中采用的培养基组成为 每升培养基中含有30g葡萄糖，30g甘露醇，5g大豆蛋白胨，8g酵母提取物，10g 可溶性淀粉和3 g尿嘧啶，其余为水。
全文摘要
本发明公开了一种重组圈卷产色链霉菌，该重组圈卷产色链霉菌是尼可霉素生物合成基因sanP被阻断的圈卷产色链霉菌。所述重组圈卷产色链霉菌为圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)TH322 sanPD CGMCC No.3086。本发明还提供了一种生产尼可霉素Z的方法及其培养基。本发明提供了只产生单一尼可霉素Z组分的重组圈卷产色链霉菌，并优化了其培养基，可以大规模生产单组分的尼可霉素Z，产量可以达到原出发株圈卷产色链霉菌TH322的4.5倍，其可以降低生产成本，对简化发酵后续产物的分离纯化有重要的意义。
文档编号C12N1/21GK101591634SQ200910088488
公开日2009年12月2日 申请日期2009年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者廖国建, 谭华荣 申请人:中国科学院微生物研究所