专利名称：舟形藻的一种开放式培养方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及藻类的培养方法及其专用培养基，特别是涉及舟形藻的培养方法及其专用培养基。
背景技术：
舟形藻(Navicula sp)是一类富含多不饱和脂肪酸的底栖海洋硅藻，是海洋生态系统的常见初级生产力种群。由于舟形藻含有γ-亚麻酸(GLA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，已成为很多珍贵水产动物重要开口饵料之一。舟形藻在生长过程中还向胞外分泌大量的多糖类成分，初步药理实验表明，舟形藻胞外总多糖含21.24％的SO42-，对S-180肉瘤的抑制率达60％以上，具有药学价值，使舟形藻成为海洋生物制药的重要原料。
天然海水中舟形藻与其他底栖藻类混杂生长，种群密度很低，无法满足水产养殖的需要。目前，舟形藻的人工培养多采用f/2培养基，在该培养基中舟形藻生长速度缓慢，尤其在开放式培养时很难形成种群优势，极易被小球藻、盐藻等单细胞绿藻污染。这些单细胞绿藻生长速度快，大量消耗培养基养分的同时还分泌胞外产物抑制舟形藻的生长，容易导致培养失败。
发明内容
本发明的目的是提供一种能使舟形藻快速生长的培养基。
本发明所提供的舟形藻培养基命名为ZWN，其配方是硝酸钾，180-220mg；磷酸二氢钠，18-22mg；硅酸钠，270-330mg；脲素，7-9mg；维生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二钠，5-7mg；氯化铁，5-7mg；海水定容至1L。
培养基的优选配方为硝酸钾，200mg；磷酸二氢钠，20mg；硅酸钠，300mg；脲素，8mg；维生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二钠，6mg；氯化铁，6mg；海水定容至1L。
为了防止在培养过程中舟形藻受到绿藻等杂藻的污染，在培养基中还加有350-450mg/L碘化钾；优选为400mg/L。
海水在配制培养基前按如下步骤处理1)用盐酸调节天然海水pH为2-4，静置12-24h；2)用NaOH调节pH到7.0-8.0。
本发明的第二个目的是提供一种应用本发明所提供的ZWN培养基培养舟形藻的方法。
应用ZWN培养基培养舟形藻的方法，包括如下步骤1)用海水配置培养基；2)按新月菱形藻与培养基体积比为1∶5-9的比例将新月菱形藻接种到培养基中，在19-25℃，光照强度3000-6000Lux，光照时间8-12h/天条件下通气培养。
培养过程的通气量为0.5m3/min；培养6-8天即可达到培养终点。优选培养条件为温度为25℃；光照强度为5000Lux；光照时间为10h/天。
人工培养舟形藻主要涉及两方面的关键技术即培养基的组成和绿藻污染的防治。本发明所提供的ZWN培养基能使舟形藻细胞快速利用培养基的营养成分，达到细胞快速分裂，生长周期比传统f/2培养基缩短3-4天，并可利于舟形藻生物量的积累，比传统培养基高出0.4-1倍；在ZWN培养基中加入碘化钾，能有效达到防治绿藻污染的目的，可以采用开放式的培养方式大规模获得舟形藻及其目标产物，对水产养殖业和海洋生物制药有着十分重要的意义。
图1为三种舟形藻在ZWN培养基和f/2培养基的生长曲线图2为舟形藻在含碘化钾和不含碘化钾ZWN培养基中开放培养的生长曲线图3为舟形藻在含碘化钾和不含碘化钾ZWN培养基中无菌培养的生长曲线具体实施方式
实施例1、舟形藻在ZWN培养基中的培养1、ZWN培养基配制1)取1L天然静置海水，加入1N盐酸调节海水pH为3，静置12h，除去沉淀物；然后加入1N NaOH调节至pH为7.5左右，静置除去沉淀物。
2)定量称取ZWN配方中各种营养盐硝酸钾(KNO3)，200mg；磷酸二氢钠(NaH2PO4)，20mg；硅酸钠(Na2SiO3l0H2O)，300mg；脲素(NH2)2CO，8mg；维生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)，6mg；氯化铁(FeCl3)，6mg。
3)将上述物质溶解在1)所得海水中，并定容至1000毫升，然后加入400mg碘化钾。
2、舟形藻的培养本实施例所用舟形藻有三种，分别为舟形藻YT01、舟形藻LY01、舟形藻LY02。这三种硅藻系发明人在2001-2002年分别从烟台、连云港海滨采集，在实验室分离后获得，作为发明人实验室保存藻种。
舟形藻藻种密度为3×105细胞/毫升，按1∶5的体积比接种到ZWN培养基中，在温度为25℃、光照时间为10h/天、光强5000Lux条件下，以0.5m3/min通气量通气培养。
以f/2培养基作为对照培养基，培养方式与上相同。
三种舟形藻在ZWN培养基和f/2培养基中生长曲线如图1所示，图中A、B、C分别为在ZWN培养基中培养的舟形藻YT01、LY01、LY02；D、E、F分别为在f/2培养基中培养的舟形藻YT01、LY01、LY02。
结果表明，这三种舟形藻在ZWN培养基中生长周期为6-8天，随初始培养的接种密度和比例不同而有差异。通常情况下当藻种密度为3×103cells/ml、接种比例为1∶5时，培养第2天即进入指数生长期，第6-7天藻细胞密度达最大值；接着是3-5天的稳定期，此时的藻细胞分裂、生长变慢，生长结束。与f/2培养基相比，舟形藻提前4天进入对数期，生物量分别高出0.4-1倍。
实施例2、舟形藻在ZWN培养基中藻体脂肪酸的组成按照如下配方配制ZWN培养基硝酸钾，180mg；磷酸二氢钠，22mg；硅酸钠，270mg；脲素，9mg；维生素B1，350μg；乙二胺四乙酸二钠，7mg；氯化铁，5mg；海水定容至1升，加入碘化钾使其浓度为400mg/L。
以ZWN为培养基，在温度为25℃、光照时间为8h、接种量为1∶9、光强5000Lux条件下通气培养舟形藻8天，其他操作与实施例1相同。培养结束后，收集藻体细胞，按GC-MS法测定藻体脂肪酸的组成，结果如表1所示，其中表中i-14:0表示十四碳酸；15:0表示十五碳酸；16:2(n-6)表示十六碳二烯酸；ai-17:0表示十七碳酸；其余与此类似。
结果表明，以ZWN培养基培养的舟形藻其藻体多不饱和脂肪酸以EPA、GLA和DHA为主要成分，分别为总脂肪酸含量的31.8-11.1％、15-18％及1.84-7.82％。
表1.以ZWN培养的几种舟形藻体脂肪酸组成(占总脂肪酸百分比)
实施例3、碘化钾ZWN培养基对舟形藻绿藻污染的防治作用按照如下配方配制ZWN培养基硝酸钾，220mg；磷酸二氢钠，18mg；硅酸钠，330mg；脲素，7mg；维生素B1，450μg；乙二胺四乙酸二钠，5mg；氯化铁，7mg；海水定容至1升。
一部分培养基中加入碘化钾使其浓度为450mg/L，另一部分不加碘化钾，在温度为19℃、光照时间为12h/天、接种量为1∶9(藻种密度为3×105细胞/毫升)、光强5000Lux条件下通气培养舟形藻10天，其他操作与实施例1相同。舟形藻YT01在两种培养基中的生长曲线如图2所示，图中A为ZWN培养基+400mg/L碘化钾；B为ZWN培养基。
结果表明，在ZWN培养基中，接种后的第5天，单细胞绿藻的数量开始急剧上升，这些单细胞绿藻在生长的过程中向培养基释放舟形藻生长抑制物，从而使舟形藻生长受到抑制，导致培养失败；在培养液中加入400mg/L的碘化钾，可有效预防绿藻的污染；对已污染的舟形藻培养液中单细胞绿藻也能有效遏制，具体表现为单细胞绿藻类种群数量增长停止并逐渐减少，存活的单细胞绿藻多附着在容器液面上方的器壁上。
实施例4、碘化钾对于舟形藻培养的影响按照如下配方配制ZWN培养基硝酸钾(KNO3)，200mg；磷酸二氢钠(NaH2PO4)，20mg；硅酸钠(Na2SiO310H2O)，300mg；脲素(NH2)2CO，8mg；维生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)，6mg；氯化铁(FeCl3)，6mg；海水定容至1升。
一部分培养基中加入碘化钾使其浓度为400mg/L，另一部分不加碘化钾，然后将两种培养基用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，按1∶9接种量在无菌条件下接种、培养舟形藻藻种YT01，培养条件与实施例1相同。
舟形藻YT01在两种培养基的生长曲线如图3所示，图中A为ZWN培养基；B为ZWN培养基+400mg/L碘化钾。舟形藻培养的潜伏期、生长周期及生物量等生长指标如表2所示。
结果表明，该浓度的碘化钾对舟形藻生物量积累没有抑制作用。
表2.碘化钾对舟形藻生长指标的影响
培养结束后，收集藻体，按常规方法测定藻体细胞的不饱和脂肪酸含量，结果如表3所示，表中表示方法与实施例2相同。结果表明，碘化钾加入ZWN培养基后，舟形藻的多不饱和脂肪酸含量没有显著的变化，而且EPA含量略有增加。
表3.碘化钾对ZWN培养舟形藻多不饱和脂肪酸含量的影响
权利要求
1.一种舟形藻培养基，其配方为硝酸钾，180-220mg；磷酸二氢钠，18-22mg；硅酸钠，270-330mg；脲素，7-9mg；维生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二钠，5-7mg；氯化铁，5-7mg；海水定容至11。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述硝酸钾为200mg；所述磷酸二氢钠为20mg；所述硅酸钠为300mg；所述脲素为8mg；所述维生素B1为400μg；所述乙二胺四乙酸二钠为6mg；所述氯化铁为6mg。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于所述培养基还含有350-450mg/L碘化钾。
4.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于所述海水按如下步骤处理1)用盐酸调节天然海水pH为2-4，静置12-24h；2)用NaOH调节pH到7.0-8.0。
5.一种培养舟形藻的方法，包括如下步骤1)用海水配置培养基，所述培养基配方为硝酸钾，180-220mg；磷酸二氢钠，18-22mg；硅酸钠，270-330mg；脲素，7-9mg；维生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二钠，5-7mg；氯化铁，5-7mg；海水定容至1升；2)按新月菱形藻与培养基体积比为1∶5-9的比例将新月菱形藻接种到培养基中，在19-25℃，光照强度3000-6000Lux，光照时间8-12h/天条件下通气培养。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于步骤1)所述硝酸钾为200mg；所述磷酸二氢钠为20mg；所述硅酸钠为300mg；所述脲素为8mg；所述维生素B1为400μg；所述乙二胺四乙酸二钠为6mg；所述氯化铁为6mg。
7.根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于步骤1)所述培养基中还含有350-450mg/L碘化钾。
8.根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于所述海水在配置培养基前按如下步骤处理1)用盐酸调节天然海水pH为2-4，静置12-24h；2)用NaOH调节pH到7.0-8.0。
9.根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于步骤2)所述通气培养的通气量为0.5m3/min。
10.根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于步骤2)所述培养温度为25℃；光照强度为5000Lux；光照时间为10h/天。
全文摘要
本发明公开了舟形藻的一种开放式培养方法及其专用培养基。本发明所提供的培养基为ZWN，其配方为硝酸钾，180－220mg；磷酸二氢钠，18－22mg；硅酸钠，270－330mg；脲素，7－9mg；维生素B
文档编号C12N1/12GK1710062SQ20041004788
公开日2005年12月21日 申请日期2004年6月18日 优先权日2004年6月18日
发明者郑维发, 王雪梅 申请人:江苏省药用植物生物技术重点实验室