多氧霉素Polyoxin B组分高产菌株及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种多氧霉素B分高产菌株及其构建方法，该多氧霉素B组分高产菌株是其polF基因发生同框突变，丧失功能。该高产菌株CXR3的制备方法是将S.aureochromogenes工业菌多氧霉素生物合成基因簇中polF基因通过同框缺失的方法进行定向突变，得到了定向积累多氧霉素B组分的高产菌株CXR3，提高了多氧霉素中B组分的产量，提高了多氧霉素的相对生物效价。
【专利说明】多氧霉素Po Iyoxin B组分高产菌株及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多氧霉素B组分高产菌株及其构建方法，属于生物制药领域。
【背景技术】
[0002]多氧霉素(Polyoxin，POL)是重要的肽基核苷类抗生素，由于其对农作物、果蔬及一些经济植物真菌病害有良好防治作用，加之对环境友好，故自创制成功便在农业上大规模推广使用，迄今为止，多氧霉素仍是世界上投产与使用最广泛且未产生耐药性的农用抗生素之一。
[0003]多氧霉素属于多组分抗生素,在所有的组分中,polyoxin A与polyoxin H为主要组分，polyoxin B,polyoxin D,polyoxin K以及polyoxin L是少量组分,但是生物活性最高的组分却是后四者。因此提高polyoxin B、polyoxin D、polyoxin K或polyoxin L的含量，是提高多氧霉素抗菌能力的重要手段。
[0004]在传统育种实践中，通过诱变筛选的方式来提高多氧霉素的效价，但是这种方式，不确定因素多，筛选工作大，育种缓慢，并且往往是整体对多氧霉素产生影响，生物活性较弱的组分效价也相应提高，难以有效提高特定活性组分的含量。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的 在于针对上述不足提供一种能够定向积累多氧霉素Polyoxin B组分的高产菌株；
本发明的第二个目的在于提供构建上述高产菌株的方法；
本发明的第三个目的在于提供用于构建上述高产菌株的专用载体。
[0006]本发明前期研究已成功克隆S.aureochromogenes工业菌株中多氧霉素生物合成基因簇。Polyoxin A与B组分的区别在于前者含有POIA基团，而本发明发现的基因簇中/707/^参与POIA基团的生物合成，本发明选择/707/^基因进行定向突变，结果获得了PolyoxinB组分的高产菌株，命名为CXR3。
[0007]据此，本发明提供一种定向积累多氧霉素Polyoxin B组分的基因工程菌，该菌的/707/7基因发生突变,丧失功能。由于/707/7处于polC-polQ2转录单元中，同框缺失可避免潜在的极性效应，因此优选所述突变为同框缺失突变。所述基因工程菌的出发菌可以使产多氧霉素的任何菌株，包括但不限于金色产色链霉素(5: aureochromogenes)?
[0008]本发明还提供上述多氧霉素Polyoxin B组基因工程菌的构建方法，该方法通过构建/707/^基因敲除载体，将该载体导入到目标菌株后筛选阳性菌株。所述基因敲除载体带有报告基因。优选所述基因敲除不改变基因的阅读框。
[0009]具体地，该基因工程菌的构建方法包括如下步骤:
I)以POlFlaF和polFlar (其序列如SEQ ID N0.1&2所示)为引物，扩增2.5_kb的片断，经BglII切后，克隆到pOJ446的BglII和HpaI位点之间，构建成pJTU4721 ;再以引物poIFraF和poIFraR(其序列如SEQ ID N0.3&4所示)扩增的2.5_kb的片断克隆到pJTU4721的XbaI和BglII位点之间，构建成polF的同框缺失载体pJTU4722 ；
2)将来自pJTU2180+的tsr基因插入载体pJTU4722的BglII位点，构建成的中断载体pJTU4723 ；
3)将质粒pJTU4723通过导入多氧霉素工业菌株中，筛选得到tsr插入polF的插入突变株； 4)将的tsr插入突变株中tsr置换出来，并筛选阳性菌株。
[0010]实验表明，本发明基因工程菌用于多氧霉素的生产能够有效提高多氧霉素中的Polyoxin B组分,从而提高多氧霉素的活性。
[0011]本发明还提供一种制备多氧霉素的方法，该方法是通过培养上述述的基因工程菌，并从发酵液中分离得到多氧霉素。
[0012]本发明还提供一种用于制备上述基因工程菌的载体，该载体包括基因上下游各2.5kb的基因片段和来自PJTU2180+的tsr基因。本发明通过基因工程手段，对产多氧霉素的工程菌进行改造，将其基因进行突变，得到了定向积累多氧霉素Polyoxin B组分的高产菌株CXR3，提高了多氧霉素组分中Polyoxin B的产量，提高了多氧霉素的相对生物效价。
[0013]
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1CXR3突变株的构建方法示意图及PCR鉴定，其中图A是CXR3突变株的构建示意图；图B是CXR3突变株的PCR鉴定，泳道M是I kb plus ladder，泳道I是CXR3突变株，泳道2是51 aureochromogenes野生型；
图2CXR3突变株代谢产物的生物活性测定，I是5: aureochromogenes野生型，2-4是CXR3突变株；
图3CXR3突变株代谢产物的HPLC检测结果，ST:多氧霉素标准品，WT: S.aureochromogenes野生型的代谢产物；
图4CXR3突变株代谢产物的质谱鉴定图，CXR3突变株代谢产物的质谱鉴定ST/POL-B: polyoxin B 标准品的一级质谱(MS)和二级质谱(MS/MS)，CXR3/P0L-B:突变株CXR3的代谢产物的一级质谱(MS)和二级质谱(MS/MS)。
【具体实施方式】
[0015]本发明构建了 Polyoxin B的高产菌株CXR3，还提供了高产菌株CXR3代谢产物的鉴定方法。分别介绍如下。
[0016]l、Polyoxin B组分的高产菌株CXR3的构建
为了实现Polyoxin B的高产，将负责多氧霉素的POIA基团生物合成基因中的进行定向突变。
[0017]首先以polFlaF和polFlaR为引物，扩增2.5_kb的片断，经BglII切后，克隆到P0J446的BglII和HpaI位点之间，构建成pJTU4721 ;再以引物polFraF和polFraR扩增的
2.5-kb的片断克隆到PJTU4721的XbaI和BglII位点之间，构建成的同框缺失载体PJTU4722 ;然后将来自PJTU2180+的tsr基因插入pJTU4722的BglII位点，构建成的中断载体PJTU4723。再将质粒pJTU4723通过接合转移入多氧霉素エ业菌株中，构建出/
的tsr插入突变株。最后将/70が' 的tsr插入突变株中tsr置换出来，PCR筛选验证影印实验显示获得ー个候选突变株，为PolF的同框缺失菌株CXR3。如图1。
[0018]2、CXR3的发酵产物检测鉴定
接种三株CXR3进行发酵，取发酵液进行生物測定，以野生型作为对照，结果如图2显示，I指的是aureochromogenes野生型,2-4指的是CXR3, CXR3的发酵液丧失对指示酵母的生物活性，暗示CXR3产生的多氧霉素组分可能发生变化。
[0019]CXR3发酵液经预处理，进行HPLC分析的结果显示，彻底丧失了 polyoxin A(34.0min)与polyoxin H (41.0 min)的特征峰，主要化合物与标准品中polyoxin B (16.3 min)的保留时间一致，如图3 ;该化合物进ー步的LC/MS分析结果显示，该吸收峰产生特征性的[M+H]+离子流?/z 508.3，其产生的二级断裂碎片为490.1，429.1及305.1，与polyoxin B标准品完全吻合，从而说明CXR3产生的主要组分为Polyoxin B。如图4。
[0020]实施例1
多氧霉素Polyoxin B组分的高产菌株CXR3的构建
首先以 polFlaF(5’-GCTCTAGATGCTGCGACTTGTGCTTGGA-3’ )和 polFlaR(5，-GAAGATCTCAGGTCAGCGACGAGGACA-3’ )为引物，以 5: aureochromogenes 野生型(购自中国普通微生物菌种保藏中心)DNA为模板，95 °C解链lmin，59°C复性30s，72°C度延伸2.5min,扩增30个循环，得2.5-kb的片断，经BglII切后，克隆到pOJ446 (Bierman M etal.Gene, 1992，116(1):43 -49.)的 BglII 和 HpaI 位点之间，构建成 pJTU4721 ;再以 polFraF (5，-GAAGATCTGACGCCCAGACCGGAGAG-3’ )和 polFraR(5，-TTCCGCACCTGGCTGTCC-3’ )为引物，以 51 aureochromogenes 野生型 DNA 为模板，95°C解链 Imin, 59°C复性 30s,72°C度延伸2.5min,扩增30个循环，得2.5-kb的片断，经XbaI和BglII切后，克隆至Ij pJTU4721的XbaI和BglII位点之间，构建成/70が' 的同框缺失载体PJTU4722 ;然后将含有tsr基因的pJTU2180+用BamHI酶切回收tsr基因，插入到pJTU4722的BglII位点，构建成/70が的中断载体PJTU4723。再将质粒pJTU4723通过接合转移入S.aureochromogenesエ业菌株中，构建出/^が的tsr插入突变株。最后将pJTU4722接合转移入/70が的tsr插入突变株中将tsr置換出来，PCR筛选验证影印实验显示获得三个候选突变株，为polF的同框缺失菌株CXR3。如图1。影印实验显示获得候选突变株(AprsThios)，以polFIDF(5，-ATCGGCTTGITGTTCAGGAGG-3’)和 polFIDR(5’-TGTGACCGTGAACGCTTTGG-3’ )为鉴定引物，进ー步的PCR验证结果显示，该候选突变株可扩增到预期的0.44-kb的预期PCR产物，而S.aureochromogenes产生的PCR产物的大小为0.89_kb,说明该候选突变株为polF的同框缺失菌株，命名为CXR3。构建示意图及电泳验证，如图1。
[0021]实施例2
验证CXR3为polyoxin B的高产菌株,具体操作方法如下:
接种随机挑选的三株CXR3突变株孢子于TSB中，30°C培养36 h左右，接种到发酵摇瓶中，每隔12 h调节发酵液的pH值至中性，连续培养3 d左右，发酵液用草酸调节pH值至
3-4,过滤后得滤液。
[0022]取酸化处理后的发酵液进行生物測定，同时以野生型作为对照，结果显示，随机挑选的CXR3突变株的发酵液与野生型相比，CXR3的发酵液丧失对指示酵母的生物活性，暗示CXR3产生的多氧霉素组分可能发生变化，如图2。发酵液进一步进行HPLC检测，流动相为每升含有10 mM己烷磺酸钠盐和2 ml的乙酸溶液一乙腈(6:4)，流速为0.5ml/min，检测波长为264nm,结果显示，CXR3的样品相7底丧失了 polyoxin A(34.0 min)与polyoxinH(41.0 min)的特征峰，但是在16.5 min中的位置产生一个新的峰，其与多氧霉素标准品中的polyoxin B组分(16.3 min)的保留时间基本一致，如图3 ;对该峰进行及LC/MS检测，结果显示该峰产生特征性的[M+H]+离子流?/^ 508.3，其产生的二级断裂碎片为490.1，429.1及305.1，其一级质谱与二级质谱与polyoxin B标准品完全吻合，从而确证CXR3产生的主要组分为Pol yoxin B,如图4。
【权利要求】
1. 一种产多氧霉素的基因工程菌，其特征在于，该菌的/70が'基因发生突变，丧失功能。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述突变为/70が'基因同框缺失突变。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的出发菌为金色产色链霉索 C51.aureochromogenes )。
4.权利要求f3所述产多氧霉素基因工程菌的构建方法，其包括如下步骤:通过构建带有报告基因的/70が'基因敲除载体，将该载体导入到目标菌株后筛选阳性菌株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述基因敲除载体带有报告基因。
6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述基因敲除不改变/70が'基因的阅读框。
7.权利要求r3任一项所述的基因工程菌在制备多氧霉素中的应用。
8.一种制备多氧霉素的方法，该方法是通过培养权利要求f 3任一项所述的基因工程菌，并从发酵液中分离得到多氧霉素。
9.一种用于制备权利要求1或2所述基因工程菌的载体，其特征在干，该载体包括 基因上下游各2.5kb的基因片段和来自PJTU2180+的tsr基因。
【文档编号】C12P21/02GK103525747SQ201310502123
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】陈文青, 邓子新, 程放, 汪长春 申请人:武汉大学