专利名称：：一种改进的固定化青霉素g酰基转移酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种改进的固定化青霉素G酰基转移酶。此外，本发明涉及运用所说的固定化酶通过母体氨基β-内酰胺核和相应的酰化剂的酶促酰化作用制备β-内酰胺抗生素的方法。
背景技术：
：和领域从下列文献已知通过用活化的侧链酸衍生物(例如酰胺或酯)酰化母体氨基β-内酰胺部分酶促制备半合成β-内酰胺抗生素的方法荷兰专利158847、欧洲专利申请339751和473008、国际专利申请WO92/01061和WO93/12250、美国专利3816253和西德专利文献2163792和2621618。本领域使用的酶在大多数情况下是来源于大肠杆菌的青霉素酰基转移酶，并且固定化在各种类型的水-不溶性材料上。用于产生阿莫西林、氨苄青霉素、头孢羟氨苄、头孢氨苄和头孢拉定的已知酶促方法的弊端是由于固定化酶的选择性引起的高成本。所说的固定化酶能够缩合活化的侧链衍生物和氨基β-内酰胺，侧链衍生物例如D(-)-苯基甘氨酸酰胺(PGA)、D(-)-苯基甘氨酸甲酯(PGM)、D(-)-4-羟苯基甘氨酸酰胺(HPGA)、D(-)-4-羟苯基甘氨酸甲酯(HPGM)、D(-)-2，5-二氢-苯基甘氨酸酰胺(DPGA)和D(-)-2，5-二氢-苯基甘氨酸甲酯(DPGM)；氨基β-内酰胺例如6-氨基-青霉烷酸、(6-APA)、7-氨基头孢菌酸(7-ACA)、7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸(7-ACCA)、7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸(7-ADCA)和7-氨基-3-[(Z)-1-丙烯基]-3-头孢烯-4-羧酸。另一方面，所说的固定化酶也将活化的侧链衍生物水解成无价值的侧链酸，也将所需产物水解形成侧链酸和母体氨基β-内酰胺，合成和水解之间的高比率会降低活化的侧链衍生物的成本。从国际专利申请WO93/12250已知，经固定化在EupergitPCA上的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶的头孢羟氨苄和头孢氨苄合成的合成/水解比率强烈地依赖于反应条件，如pH、反应物浓度和温度。然而没有指出载体材料的性质对合成/水解比率的影响。从欧洲专利222462已知，通过将氨基聚合物(例如藻酸胺、脱乙酰壳多糖果胶或聚乙烯亚胺)添加到载体的基质胶凝成分上，可以把氨基引入到载体材料上。令人惊奇地是，现已发现就活化的侧链衍生物与氨基β-内酰胺的缩合反应中的合成/水解比率而言，在由胶凝剂和包含游离氨基基团的聚合物组成的载体上固定化大肠杆菌青霉素G酰基转移酶使得酶促催化剂与固定在其它载体上的青霉素G酰基转移酶比较具有良好的特性。发明概要本发明提供了在由胶凝剂和包含游离氨基基团的聚合物组成的载体上固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶。优选地，聚合物选自藻酸胺、脱乙酰壳多糖、果胶或聚乙烯亚胺；更优选地，胶凝剂是明胶。此外，本发明提供了通过使用这样的固定化酶经母体氨基β-内酰胺和相应的酰化剂的酶促反应制备β-内酰胺衍生物的改进的方法。特定实施方案可以由本发明的方法产生的β-内酰胺衍生物的例子是阿莫西林、氨苄青霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢罗齐、头孢氨苄和头孢拉定。酰基转移酶活性不依赖于头孢烯化合物3-位上的取代基，例如氢、卤素、(低级)烷氧基、甲基或由例如以下基团取代的甲基(低级)烷氧基、(低级)烷酰氧基、卤素、S-R5(其中R5是(低级)烷基、(低级)烷酰基或者取代或未取代的杂环)，N+-R6(其中R6是(低级)烷基或者取代的或未取代的杂环)。低级意指1-6个碳原子。杂环定义为包含至少一个氮、硫或氧原子的不饱和环状结构。酰化剂可以是D(-)-苯基-甘氨酸衍生物、D-(-)-4-羟苯基甘氨酸衍生物或D-2，5-二氢-苯基甘氨酸衍生物，如低级烷基(甲基、乙基、正丙基或异丙基)酯或在-CONH2基团上取代的酰胺。相应的氨基β-内酰胺含有与所制备的β-内酰胺衍生物相同的β-内酰胺核。一般地，本发明的方法的反应温度可以在0℃到35℃之间变化。最佳温度取决于在欧洲专利申请473008中提到的底物，在给出的比较实施例中没有最佳化。合适的pH值取决于底物的性质和浓度，典型地在5到9的范围内。为了方便操作，使用pH对照。合适的反应时间从若干分钟到若干小时，特别是从30分钟到3小时。在涉及使用催化剂(例如酶)的商业方法中，在方法的总的经济学上催化剂的价格常常是一个重要的参数。在这样的情况下，催化剂能够再使用而不丧失催化活性是有利的。总之，具有以可再用形式的酶(例如，固定化的或截留形式的)是有利的。研究了以下固定化的大肠杆菌青霉素酰基转移酶A型如国际专利申请WO92/12782中所描述的方法分离大肠杆菌青霉素酰基转移酶。如欧洲专利申请222462中所描述的方法进行固定化。B型市售的来源于Recordati，意大利的固定化大肠杆菌青霉素G酰基转移酶，如欧洲专利申请473008中所描述的。C型市售的来源于BoehringerMannheimGmbH，德国的固定化大肠杆菌青霉素G酰基转移酶，称为Enzygel。合适的酶浓度可以从0.1U·ml-1到100U·ml-1(1U＝一个单位酶活性，参见以下)。使用按照本发明的方法，可以获得特别高的合成/水解比率。定义和分析方法酶活性就青霉素G酰基转移酶活性的限定而言，使用了以下定义一个单位(U)相当于在标准条件(100g.1-1青霉素G钾盐，0.05M磷酸钾缓冲液，pH8.0，28℃)下每分钟水解1μmole青霉素G的酶量。HPLC分析方法A(阿莫西林)样品用在2mM磷酸钾缓冲液(pH5)中的25％乙腈1∶10稀释柱ChromsphereC18，5μm(100×3.0mm)溶剂在包含0.2％十二烷基硫酸钠的12mM磷酸钾缓冲液(pH2.6)中的25％乙腈流速1ml·分钟-1检测波长214nm保留时间HPG(1.9分钟)；HPGA(3.1分钟)；6-APA(3.4分钟)；阿莫西林(4.8分钟)；HPGM(7.3分钟)方法B(头孢氨苄)样品用在2mM磷酸钾缓冲液中的25％乙腈(pH5)1∶10稀释柱ChromsphereC18，5μm(100×3.0mm)溶剂在包含0.2％十二烷基硫酸钠的12mM磷酸钾缓冲液(pH3.1)中的29％乙腈，流速1ml·分钟1检测波长214nm保留时间PG(0.8分钟)；7-ADCA(1.3分钟)；PGA(3.7分钟)；头孢氨苄(6，2分钟)；PGM(7.8分钟)方法C(头孢拉定)样品用在50mM磷酸缓冲液(pH3.0)中的3％1-丙醇1∶150稀释，柱Nucleosil1203C18(250×4.0mm)溶剂洗脱液A50mM磷酸缓冲液，pH3.0；洗脱液B50％洗脱液A，50％乙腈梯度0-5分钟100％A；5-10分钟从100％A到70％A；10-18分钟70％A；18-18.1分钟从70％A到100％A。流速1ml·分钟1检测波长220nm保留时间7-ADCA(5.3分钟)；DPG(6.0分钟)；DPGA(9.1分钟)；DPGM(15.9分钟)；头孢拉定(18.5分钟)方法D(头孢克洛)样品用在50mM磷酸缓冲液(pH3.0)中的3％1-丙醇1∶150稀释，柱Nucleosil1203C18(250×4.0mm)溶剂洗脱液A50mM磷酸缓冲液，pH3.0；洗脱液B50％洗脱液A，50％乙腈梯度0-5分钟100％A；5-10分钟从100％A到70％A；10-18分钟70％A；18-18.1分钟从70％A到100％A。流速1ml·分钟1检测波长220nm保留时间7-ACCA(3.2分钟)；PG(3.8分钟)；PGA(5.6分钟)；头孢克洛(14.9分钟)方法E(氨苄青霉素)样品用在3.4mM磷酸钾缓冲液(pH6.9)中的33％乙腈1∶200稀释柱ChromsphereC18，5μm(100×3.0mm)溶剂在包含0.1％十二烷基硫酸钠的5mM磷酸钾缓冲液(pH3.0)中的30％乙腈，流速1ml·分钟1检测波长214nm保留时间PG(1.0分钟)；6-APA(1.3分钟)；PGA(2.6分钟)；氨苄青霉素(4.5分钟)PGM(5.8分钟)实施例1采用固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶从6-APA和HPGA合成阿莫西林在21℃下，向含有10mMHPGA和30mM6-APA的水溶液(50ml)中添加50U固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶。将pH调节至6.0，用0.05M硫酸水溶液控制pH值，使反应在氮气氛围下进行。在不同的时间间隔(参见下表)按照以上所述的方法A分析各样品。从由此获得的结果计算合成/水解(S/H)摩尔比率。表1.1采用A型酶合成阿莫西林表1.2采用B型酶合成阿莫西林</tables>表1.3采用C型酶合成阿莫西林实施例2采用固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶从6-APA和HPMG合成阿莫西林在21℃下，向含有10mMHPGM和30mM6-APA的水溶液(50ml)中添加50U固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶。将pH调节至6.0，用0.05M硫酸水溶液控制pH值，使反应在氮气氛围下进行。在不同的时间间隔(参见下表)按照以上所述的方法A分析各样品。从由此获得的结果计算合成/水解(S/H)摩尔比率。</tables>表2.1采用A型酶合成阿莫西林实施例3采用固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶从7-ADCA和PGA合成头孢氨苄在21℃下，向含有10mMPGA和30mM7-ADCA的水溶液(50ml)中添加50U固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶。将pH调节至7.0，用0.05M硫酸水溶液控制pH值，使反应在氮气氛围下进行。在不同的时间间隔(参见下表)按照以上所述的方法B分析各样品。从由此获得的结果计算合成/水解(S/H)摩尔比率。</tables>表3.1采用A型酶合成头孢氨苄</tables>表3.2采用B型酶合成头孢氨苄实施例4采用固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶从7-ADCA和DPGM.HCl合成头孢拉定向含有300mMDPGM·HCl和300mM7-ADCA的水溶液(120ml)中添加固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶(单位在表中给出)。将pH调节至下表中给出的值，使反应在氮气氛围下进行。在不同的时间间隔按照以上所述的方法C分析各样品。从由此获得的结果计算合成/水解(S/H)摩尔比率表4.1采用B型酶(33U·ml-1)在pH7.0下合成头孢拉定实施例5采用固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶从7-ACCA和PGA合成头孢克洛向含有PGA和7-ACCA的水溶液(120ml)中添加固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶(浓度和酶单位在下表中给出)。将pH调节至7.7，用2.0M硫酸水溶液控制pH值，使反应进行。在不同的时间间隔(参见下表)按照以上所述的方法D分析各样品。从由此获得的结果计算合成/水解(S/H)摩尔比率表5.1采用A型酶(9U·ml-1)从PGA(0.5M)和7-ACCA(0.6M)合成头孢克洛</tables>表5.2采用B型酶(47U·ml-1)从PGA(0.6M)和7-ACCA(0.6M)合成头孢克洛实施例6采用固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶从6-APA和PGA合成氨苄青霉素向含有500mMPGA和300mM6-APA的水溶液(100ml)中添加100U固定化的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶。将pH调节至7.5，用6.0M盐酸水溶液控制pH值，使反应进行。在不同的时间间隔(参见下表)按照以上所述的方法E分析各样品。从由此获得的结果计算合成/水解(S/H)摩尔比率，在下表中显示。</tables>表6.1.1采用A型酶合成氨苄青霉素(在使用聚合物藻酸胺时)</tables>表6.1.2采用A型酶合成氨苄青霉素(在使用聚合物脱乙酰壳多糖时)</tables>表6.1.3采用A型酶合成氨苄青霉素(在使用聚合物果胶时)表6.1.4采用A型酶合成氨苄青霉素(在使用聚合物聚乙烯亚胺时)表6.2采用B型酶合成氨苄青霉素表6.3采用C型酶合成氨苄青霉素权利要求1.在载体上固定化的青霉素G酰基转移酶，所说的载体包含胶凝剂和含有游离氨基基团的聚合物。2.按照权利要求1的青霉素G酰基转移酶，其中所说的聚合物选自藻酸盐胺、脱乙酰壳多糖、果胶或聚乙烯酰胺。3.按照权利要求1或2的青霉素G酰基转移酶，其中所说的胶凝剂是明胶。4.按照以上任一权利要求的青霉素G酰基转移酶，其中所使用的酶来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)、巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianum)、柑橘黄单胞菌(Xanthomonascitrii)、嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(Kluyveracitrophila)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)或粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)。5.使用固定化酶通过母体氨基β-内酰胺和相应的酰化剂的酶促反应制备β-内酰胺衍生物的方法，其特征在于使用权利要求1-4之任一所限定的酶。6.按照权利要求5的方法，其中所说的酰化剂选自D-苯基甘氨酸衍生物、D-对-羟苯基甘氨酸衍生物和D-2，5-二氢-苯基甘氨酸衍生物。7.按照权利要求5或6的方法，其中形成的β-内酰胺衍生物选自氨苄青霉素、阿莫西林、头孢克洛、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定和头孢罗齐。8.按照权利要求5-7之任一的方法，其中所说的反应是在从约0到约35℃的温度范围内，优选地是在高于约10℃的温度下进行的。9.按照权利要求5-8之任一的方法，其中所说的反应是在从约5到约9的pH值范围内进行的。全文摘要提供了一种具有令人惊奇的良好性能的新固定化青霉素G酰基转移酶。运用这种固定化酶通过母体氨基β－内酰胺和相应的酰化剂的酶促反应,可以高产率地制备β－内酰胺衍生物。文档编号C12N11/02GK1190990SQ96195543公开日1998年8月19日申请日期1996年7月16日优先权日1995年7月18日发明者E·德弗鲁姆申请人:吉斯特·布罗卡迪斯股份有限公司被以下专利引用(1),