专利名称：用于制造乳酪的方法
技术领域：
本发明涉及通过利用转谷氨酰胺酶以提高的产率制造乳酪的方法，并涉及由所说的方法产生的乳酪产品。
本发明也涉及转谷氨酰胺酶在乳酪制造方法中保持乳酪物质中蛋白质上的用途发明背景反刍动物把草和其它植物材料(人类不能消化)转化成有价值的营养物质(如牛奶和肉)的能力几千年来对全世界大量的人群的存在一直是必需的。
人们从奶制造黄油和乳酪已有许多年。原来制造乳酪是作为夏天保存过剩奶的方法。
乳酪的工业制造在100年以前开始，因为处理大量奶的能力达到了足够的技术成熟阶段，粗制凝乳酶是从市场上可获得的。乳酪制造的一般原理在乳酪的生产中，将乳酪乳状物凝结以便能够使乳酪物质(例如酪蛋白)与乳清分离是必需的。可以通过酸处理或酶凝结使奶凝结。两种情况下都使酪蛋白不能溶解，其导致形成凝聚性物质。然而，两种凝聚性凝结物质(即乳酪材料)是不同的。与使用酸时形成的凝结物比较，用奶凝结酶时凝结物变得更牢固和更有弹性，所述酶例如粗制凝乳酶(一种凝乳酶制剂)。
包含凝乳酶的产品(其可以从小牛第四胃分离)已用于这一目的许多年。小牛胃不足在最近十年已导致引入其它奶凝结酶(如牛胃蛋白酶，猪胃蛋白酶以及微生物酶)。所有这些酶以具有对κ-酪蛋白中105位残基苯基丙氨酸和106位残基甲硫氨酸之间的肽键或者其邻近的键的特异性为特征。这意味着在通过乳酪-制造中使用这些酶，可以在κ-酪蛋白和携带有负电荷的称为糖巨肽的巨肽(macropeptide)部分之间裂解κ-酪蛋白。当出现这种裂解时，巨肽扩散到乳清中，其稳定化作用丧失，一旦足够量的κ-酪蛋白水解，蛋白质微胶粒就可以开始聚合。
巨肽向乳清中的这一扩散作用意味着相当一部分奶干物质损失到乳清中。乳清典型地是由0.85％蛋白质、0.36％脂肪和5.14％食糖组成(USDA标准参考表。美国政府印刷所，1986)。有关奶的酶促凝结的细节参见例如D.G.Dalgleish高级的奶制品化学，Vol1，P.F.Fox Elsevier编，伦敦1992。酶和乳酪-制造酶在乳酪制造和酪乳酪产品的味道、结构、口感等上具有重要的作用。
添加某些酶，以例如获得所需的结构。灭活存在于奶原材料中的其它酶，以例如避免不需要的味道。
例如，在乳酪制造过程的某一时间点添加以上提到的奶凝结酶(例如粗制凝乳酶)，以保证乳酪材料的凝结。这样的酶是蛋白酶，其除了使奶材料凝结之外，还造成奶蛋白质一定程度的断裂。这对于结构和味道具有重要性。
在奶中脂肪酶的存在将导致短链脂肪酸从奶脂肪甘油三酯释放，这将产生一种涩味(harsh)。这一点可以通过热处理(通常经巴氏消毒法)乳酪乳状物避免。然而，对于Danablue和Boerenkaas之类的乳酪，涩味是所需的。
溶菌酶(其是一种糖苷酶)已知作为防腐剂添加到乳酪中。溶菌酶水解某些粘多糖和粘肽，这造成细菌细胞壁(例如Clostridiumsp的细菌细胞壁)裂解。
也已知转谷氨酰胺酶用于制造奶和奶制品，如乳酪。尽管转谷氨酰胺酶的精确的作用不完全清楚，人们相信转谷氨酰胺酶交联奶或奶制品中的蛋白质，由此产生格子或网状。这造成这些产物的水相的胶凝，其可能是有利的。
WO94/21130(Novo Nordisk A/S)公开了一种基于奶产生非酸化的可食用凝胶的方法，该方法包括将转谷氨酰胺酶和粗制凝乳酶添加到奶中，其后进行加热处理。由此获得功能上和/或感官上合意的可食用凝胶，其可以用作多泡沫含奶油的甜点、乳酪以及布丁等。
从W094/21129(Novo Nordisk A/S)可知，将转谷氨酰胺酶添加至奶或奶制品(如乳酪)中导致产品具有愉快的稠度和口感，并显示出令人满意的感官性质。此外，这样的产品可以产生而无须添加乳化剂和稳定剂。
WO93/22930(Novo Nordisk A/S)描述了通过将转谷氨酰胺酶添加至包含奶蛋白质的液体产生类似奶的产品的方法。需要时，该液体中可以含有数量足以用于转谷氨酰胺酶所催化的反应的Ca2+，并且需要时，将该液体的pH调节至5.5和7.5之间。由此获得物理上更稳定的类似奶的的产品。
从JP-A-5959151中可见，可以通过将转谷氨酰胺酶添加至奶中获得凝胶形式的改良的奶制品。
从JP-A-2276541中可见，基于酪蛋白溶液、转谷氨酰胺酶和奶凝结酶可以获得含纤维性组织的蛋白质食物。
JP-A-6030770涉及一种在含有1.Owt.％或更多蛋白质的溶液和泥浆中胶凝蛋白质的方法，其通过从海squirt(Halocynthia roretzi)分离的新的转谷氨酰胺酶的作用。该文献也提及所说的转谷氨酰胺酶可以用于胶凝食品(如乳酪)。对现有技术的评价在常规制造乳酪的过程中，其弊端是大量的蛋白质丧失到乳清中，而蛋白质在乳酪产品中是有价值的组分。在以上提到的现有技术文献中没有一个解决了这个问题，因为在所说文献中公开的制备方法的目的是稳定和乳化奶或类似奶的产品，以形成物理上改进的产品。当采用一种这些公开的技术产生乳酪时，当乳清与乳酪物质分离时，大量的蛋白质将损失到乳清中。
因此，当制造乳酪时，能够保持乳酪物质中损失到乳清中的以上提到的至少一部分蛋白质是合乎需要的。
发明概述本发明的目的是通过提供改进的乳酪制造方法克服以上提及的问题。
现在发明人令人惊奇地发现，从已用酶(其在乳酪制造过程中能够保持乳酪物质中蛋白质)预处理的乳酪乳状物制造乳酪是可能的。发现采用这一方法可以以增加的产率产生乳酪。
因此，本发明的一个方面涉及一种制造乳酪的方法，该方法包括a)向乳酪乳状物添加转谷氨酰胺酶，将这一混合物温育一段合适的时间，b)将所形成的产物与粗制凝乳酶一起温育，以便产生凝结和形成凝结物，c)将乳清与凝结物分离，和d)将凝结物加工成乳酪。
在另一方面，本发明涉及按照本发明的方法所产生的乳酪产品。
最后，本发明涉及转谷氨酰胺酶在乳酪制造方法中保持乳酪物质中蛋白质上的用途。发明详述如上所述，当利用常规乳酪-制造方法产生乳酪时，大量的蛋白质损失到乳清中。
现在发明人令人惊奇地发现这种损失可以由以下方法降低-用转谷氨酰胺酶预处理用于乳酪产生的包含蛋白质的原材料，和-用预处理的原材料经已知方法进行乳酪制造过程。
＂乳酪材料＂是一种物质，其在经历本发明的乳酪-制造过程后，形成乳酪产品。
这样，按照本发明，对用于产生乳酪的原材料的性质和组成没有特别的限制，并且可以接下来采用乳酪产生的常规方法(除了具有预处理步骤外)。
因此，本发明的一个方面提供了一种制造乳酪的方法，该方法包括a)向乳酪乳状物添加转谷氨酰胺酶，将这一混合物温育一段合适的时间，b)将所形成的产物与粗制凝乳酶一起温育，以便产生凝结和形成凝结物，c)将乳清与凝结物分离，和d)将凝结物加工成乳酪。
转谷氨酰胺酶是蛋白质-保持酶，与没有用这种酶预处理的乳酪乳状物相比，在步骤b)中与粗制凝乳酶一起温育后和在步骤c)中从凝结物分离乳清后，其能够增加留在凝结的乳酪材料中的蛋白质的量。
在乳酪制造过程中酶在乳酪乳状物保持增加量的蛋白质的能力可以按照以下材料和方法部分的描述进行测定。
＂乳酪乳状物＂用来指用于乳酪制造的奶材料。
按照本发明，乳酪乳状物可以来源于反刍动物，如母牛、羊、山羊、水牛或骆驼。按照本发明用作原材料的乳酪乳状物可以是具有0％到50％脂肪含量的全奶、重构奶、浓缩的全奶、低脂肪奶、奶油或奶制品。一般乳酪乳状物含有1％到68wt.％的蛋白质。
对乳酪乳状物的选择通常取决于所要制造的乳酪的类型。通过本发明的方法可以有利地制备大多数类型的乳酪。
如果需要，乳酪乳状物可以是非-巴氏法灭菌过的。然而，在大多数情况下，为了改善奶的质量，乳酪乳状物是巴氏法灭菌过的。巴氏法灭菌灭活存在于奶中的脂肪酶，这常常是有利的，由于脂肪酶的存在导致产生具有涩味的乳酪产品。此外，巴氏法灭菌杀灭例如大肠杆菌状的细菌(其使得乳酪具有不愉快的味道，并导致不受控制地产生气体。
按照本发明，用含蛋白质的酶处理具体来说包括在原材料经历常规的乳酪制造过程之前将这种酶添加到原材料中，并且使酶与原材料中的蛋白质(即乳酪乳状物)反应。
如上所述，本发明的蛋白质-保持酶是转谷氨酰胺酶。
按照本发明使用的＂转谷氨酰胺酶＂可以是任何转谷氨酰胺酶，包括钙-依赖性和非钙-依赖性转谷氨酰胺酶或者转谷氨酰胺酶的混合物。转谷氨酰胺酶是蛋白质-谷酰胺γ-谷氨酰基转移酶，按照酶命名法(学术出版公司，1992)，其被分类为具有编号E.C.2.3.2.13的酶。
转谷氨酰胺酶是能够催化酰基转移反应的酶，在所述反应中，连接肽的谷酰胺残基的γ羧酰胺基是酰基的供体。在各种化合物中的伯氨基可以作为酰基受体起作用，尔后形成连接肽的谷氨酸单取代的γ-酰胺。当肽链中的赖氨酸残基的ε-氨基酸用作酰基受体时，转谷氨酰胺酶形成分子间或分子内γ-谷氨酰基-ε-赖氨酰基交叉键。
尽管在乳酪制造过程中转谷氨酰胺酶的蛋白质-保持作用不完全清楚，但相信它是在奶蛋白质分子之间形成网络的结果。
已从许多底物和几种植物物种鉴别和分离了一系列转谷氨酰胺酶。最广泛使用的动物来源的转谷氨酰胺酶(因子XIIIa)是-多亚单位酶。
按照本发明，转谷氨酰胺酶可以是例如哺乳动物源的(如人或牛源的)、海源的(来源于海squirt(Halocynthia roretzi)的)或微生物源的(如细菌、丝状真菌的酵母源的)或其变体。
在本发明的一个实施方案中，转谷氨酰胺酶是人源的因子XIIIa。
在另一个实施方案中，转谷氨酰胺酶是来源于利迪链霉菌(以前称为黎巴嫩链霉菌)或其变体的微生物转谷氨酰胺酶。所说的微生物转谷氨酰胺酶可从Novo Nordisk A/S获得。
已描述了其它合适的微生物转谷氨酰胺酶，包括来源于多头绒泡菌的转谷氨酰胺酶(Klein等，细菌学杂志，vol.174，2599-2605页)以及来源于茂原链轮丝菌、肉桂链轮丝菌和灰肉色链轮丝菌的转谷氨酰胺酶(Motoki等，美国专利5,156,956)和来源于淡紫灰链霉菌的转谷氨酰胺酶(Andou等，美国专利5,252,469)。
此外，也包括EP481504-Al(Amano制药有限公司)和WO96/06931(NovoNordisk A/S)描述的转谷氨酰胺酶，这两篇文献本文一并参考。
也包括来源于类真菌生物体卵菌纲，优选地是来源于疫霉属(Phytophthora)的转谷氨酰胺酶。其它有关的卵菌纲转谷氨酰胺酶在PCTDK96/00031(Novo Nordisk A/S，本文一并参考)中描述。
添加的转谷氨酰胺酶的量在乳酪产品中产生蛋白质-保持作用的量。通常在每克底物蛋白质0.1-10毫克活性酶蛋白质之间，优选地在每克底物蛋白质1-6毫克活性酶蛋白质之间。
由于一般乳酪乳状物具有1％到6％蛋白质的蛋白质含量，因此添加的转谷氨酰胺酶的量优选地是从每升乳酪乳状物1g到每升乳酪乳状物36g。
自不待言，如果转谷氨酰胺酶是钙-依赖性的，Ca2+的浓度被认为是这样的值，即Ca2+可以激活转谷氨酰胺酶和粗制凝乳酶两者。
为了显示蛋白质-保持酶(在步骤a)中添加)的酶促作用，将原材料与所说的酶一起温育合适的时间。合适的时间在10分钟到4小时范围内。
在蛋白质-保持酶是转谷氨酰胺酶的特定的情况下，将原材料在对转谷氨酰胺酶来说最佳的条件下保持10分钟到4小时，优选地是在10分钟到3小时，特别优选地是在10分钟到2小时，所述的条件是pH值为6-7，温度在5-60的范围内，优选地在约40-55℃的范围内。以这种方式足以进行酶反应，以获得所需的蛋白质-保持作用。
在用转谷氨酰胺酶预处理后，转谷氨酰胺酶可以用任何对产品无害的常规方法灭活，例如加热原材料到约80℃，加热时间是足以灭活转谷氨酰胺酶。在转谷氨酰胺酶最终灭活之后，原材料可以如以前的描述用制造乳酪的常规方法处理。
在进行步骤a)中的酶处理之前，可以用各种方法浓缩奶，所述方法例如蒸发和喷雾干燥，但优选地是通过膜过滤，即超滤，其允许高达20,000道尔顿分子量的分子通过膜，在超滤前后可用可不用膜渗滤(其允许高达500道尔顿分子量的分子通过膜)处理。有关处理方法更详尽的描述，参见例如Quist等，Beretning fra Statens Mejeriforsφg，1986(来源于丹麦政府奶制品试验机构的报告)。
引酵物培养物可以在添加凝结诱导酶(步骤b)之前添加或者同时添加。所述的引酵物培养物是在常规乳酪制造中的乳酸菌培养物。添加培养物以使存在于乳酪乳状物中的乳糖发酵，并引起凝结的酪蛋白进一步分解为小肽和游离氨基酸。这是引酵物培养物产生蛋白酶和肽酶的结果。引酵物培养物可以以常规用于这一目的的量添加，即典型地量为约1*E4到1*E5细菌/g乳酪乳状物，并且可以以冻结-干燥、冷冻或者液态培养物形式添加。当用于本发明的方法中的奶是浓缩奶时，在浓缩奶后添加引酵物培养物是优选的，尽管这并不是绝对需要的，因为引酵物培养物细菌在过滤期间将被保持。
在本发明的方法步骤a)中添加引起凝结的酶之后，进一步的加盐、压制和成熟酪状物之类的操作可以用产生乳酪的常规方法进行，例如按照R.Scott，乳酪制造实践，第二版，Elsevier，伦敦，1986描述的方法进行。
在本发明的一个优选的方法中，所说的粗制凝乳酶是Rennilase粗制凝乳酶，以1到30粗制凝乳酶单位/ml活性单位/ml奶或类似奶的产品的量使用。
本发明另一方面是提供由本发明的方法制备的乳酪产品。
本发明的最后一个目的涉及转谷氨酰胺酶在乳酪制造方法中保持乳酪物质中蛋白质的用途。由术语＂乳酪乳状物＂包括的原材料是以上所限定的。
此外，按照本发明的这一方面可以使用的转谷氨酰胺酶是以上所限定的其它本发明的特征将在下列实施例中变得明显，给出以下实施例以说明本发明。方法和材料酶转谷氨酰胺酶，因子XIIIa，每克纯化的酶产品8毫克酶蛋白质(可从Novo Nordisk A/S获得)。
Rennilase50LXL(可从Novo Nordisk DK获得)。
酶活性Rennilase在Novo Nordisk产品说明书＂用Rennilase制造乳酪＂B250g-GB2500Oct.1990PBz中描述了其特征，Novo粗制凝乳酶单位在IB67/3-a中限定。这些出版物两者基于请求可以从Novo NordiskA/S，NovoAll②，DK-2880 Bagsvaerd，丹麦获得。奶巴氏法灭菌过的脱脂奶(可从Mejeriet Enigheden，Lygten，哥本哈根，丹麦获得)。蛋白质-保持测定在乳酪制造过程中酶在乳酪乳状物保持增加量的蛋白质的能力可以按照以下描述进行测定。a)用合适量的所述酶处理脱脂奶，b)温育一段固定的时间(例如45分钟)，c)添加粗制凝乳酶，d)让乳酪乳状物凝结，e)切割和过滤所形成的凝块，f)从凝结物分离乳清，g)收集所分离的乳清，和h)测定在乳清中的蛋白质的含量。
除了在步骤a)中不添加酶外，重复步骤a)到h)。
然后，通过比较采用酶的试验和对照试验中的蛋白质含量，可以证实或否定＂蛋白质-保持酶＂的能力。
实施例实施例1将巴氏法灭菌过的脱脂奶加热到32℃，以各150ml分配到烧杯中。
以每100g奶蛋白质0.4g的量添加转谷氨酰胺酶蛋白质，每升添加0g或0.1CaCl2。在45分钟的温育之后，以每升脱脂奶0.1g的量添加粗制凝乳酶Rennilase50LXL。
在切割凝结的凝块后，收集乳清，并通过Whatman CF/C过滤。在乳清中的蛋白质含量以Kjeldahl N*6，28测定。
与对照试验(即没有用转谷氨酰胺酶处理)比较的试验的结果显示在下表中。
从表中可以看出，通过采用转谷氨酰胺酶，保持了乳酪材料中显著量的蛋白质。
本领域技术人员清楚的是，在以上公开的内容的教导下，在不背离本发明的精神和其范围的情况下，实施本发明中可能有许多改变和修改。因此，本发明的范围本质上由所附的权利要求构成。
权利要求
1.一种用于制造乳酪的方法，该方法包括a)向乳酪乳状物中添加转谷氨酰胺酶，将这一混合物温育一段合适的时间，b)将所形成的产物与粗制凝乳酶一起温育，以产生凝结和形成凝结物，c)将乳清与凝结物分离，和d)将凝结物加工成乳酪。
2.按照权利要求1的方法，其中所说的转谷氨酰胺酶是哺乳动物源的或其变体。
3.按照权利要求2的方法，其中所说的哺乳动物转谷氨酰胺酶是人或牛源的。
4.按照权利要求3的方法，其中所说的转谷氨酰胺酶是人源的因子XIIIa。
5.按照权利要求1的方法，其中所说的转谷氨酰胺酶是海源的或其变体。
6.按照权利要求5的方法，其中所说的转谷氨酰胺酶是来源于海squirt(Halocynthia roretzi)的或其变体。
7.按照权利要求1的方法，其中所说的转谷氨酰胺酶是微生物源的或其变体。
8.按照权利要求7的方法，其中所说的微生物酶是细菌源的转谷氨酰胺酶。
9.按照权利要求8的方法，其中所说的细菌转谷氨酰胺酶来源于利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)。
10.按照权利要求7的方法，其中所说的微生物酶是真菌源的转谷氨酰胺酶，优选地来源于卵菌纲，尤其优选地来源于Phytoftera的菌株。
11.按照权利要求1至10之任一的方法，其中添加的转谷氨酰胺酶的量在每克底物蛋白质0.1-10毫克活性酶蛋白质的范围内，优选地在每克底物蛋白质1-6毫克的活性酶蛋白质的范围内。
12.按照权利要求1至11之任一的方法，其中所说的温育时间从10分钟至4小时，优选地从10分钟至3小时，尤其优选地从10分钟至2小时。
13.按照权利要求1至12之任一的方法，其中在步骤a)中所说的温育在pH5至8下进行，优选地在pH6至7下进行。
14.按照权利要求1至13之任一的方法，其中在步骤a)中所说的温育在温度5-60℃的范围内进行，优选地在温度大约40至55℃的范围内进行。
15.按照权利要求1至14之任一的方法，其中所说的粗制凝乳酶是Rennilase。
16.一种包含牛奶蛋白质的乳酪产品，其中所说的乳酪是由按照权利要求1至15之任一的方法产生的。
17.转谷氨酰胺酶在乳酪制造方法中保持乳酪物质中蛋白质上的用途。
18.按照权利要求17的用途，其中所说的乳酪制造方法是按照权利要求1至15之任一的方法。
19.按照权利要求16至18之任一的用途，其中所说的转谷氨酰胺酶是哺乳动物源的或其变体，如人或牛源的。
20.按照权利要求19的用途，其中所说的转谷氨酰胺酶是人源的因子XIIIa。
21.按照权利要求16和16a的用途，其中所说的转谷氨酰胺酶是海源的或其变体，优选地是来源于海squirt(Halocynthia roretzi)的或其变体。
22按照权利要求16和16a的用途，其中所说的转谷氨酰胺酶是微生物源的或其变体，优选地是真菌(例如丝状真菌或酵母)源的或细菌源的。
23.按照权利要求19的用途，其中所说的转谷氨酰胺酶来源于链霉菌属的细菌，尤其是利迪链霉菌。
全文摘要
本发明涉及制造乳酪的方法,该方法包括:a)向乳酪乳状物中添加转谷氨酰胺酶,温育一段合适的时间,b)与粗制凝乳酶一起温育,以产生凝结,和c)将乳清与凝结物分离,和d)将凝结物加工成乳酪。本发明也涉及由所说的方法产生的乳酪产品。本发明还涉及转谷氨酰胺酶在常规的乳酪制造方法中保持乳酪物质中蛋白质上的用途。
文档编号A23C19/04GK1189764SQ9619518
公开日1998年8月5日 申请日期1996年6月25日 优先权日1995年6月30日
发明者P·布德茨 申请人:诺沃挪第克公司