专利名称：：抗丙型肝炎病毒的疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的疫苗制剂，它们的生产方法及其在医药中的应用。从GB2220211(Ribi)中已知3脱-O-酰化-单磷酰脂A，就其化学意义上说，它是3脱-O-酰化-单磷酰脂A与4，5或6酰化链的混合物，由RibiImmunochemMontana制备。3脱-O-酰化-单磷酰脂A的优选形式公开于国际专利申请No.92/116556中。QS21是得自南美树种QuillajaSaponariaMolina树皮皂苷的Hplc纯化的无毒级分，其生产方法公开于(作为QA21)US专利No.5,057,540中。水包油乳剂本身是本
技术领域：
已知的，已被建议用作佐剂组合物(EPO399843)。丙型肝炎病毒描述于EP-A-0318216。丙型肝炎病毒的特殊抗原蛋白被称为核心蛋白，被描述于例如Delisse等，肝脏病学杂志(J.Hepatology)，1991；13(Suppl.4)S20-S23(基因型1b)，丙型肝炎病毒的特殊包膜蛋白被称为E1和E2，被描述于例如Grakoui等，(J.Virology)67，1385-1395；Spacte等，1992，病毒学(Virology)188，819-830；Matsumia等，病毒学杂志(J.Virology)66，1425-1431，和Kohara等，1992，病毒遗传学杂志(J.Gen.Virol.)73，2313-2318。至今已被鉴定的大多数HCV基因型描述于OkamotoHiroaki和MishiroShunji，Intervirology，1994，3768以及下列等等。本发明提供了含有QS21，3脱-O-酰化-单磷酰脂A(3D-MPL)水包油乳剂的疫苗组合物，其中水包油乳剂具有下列组分如角鲨烯的可代谢的油类，α生育酚和吐温80，和至少一种选自下列组中的免疫原(a)丙型肝炎病毒的核心蛋白或其免疫原性的衍生物，以及(b)丙型肝炎病毒的包膜蛋白或其免疫原性的衍生物。术语“免疫原性的衍生物”包含任何分子，如内部施用于人之后，保留了诱导对此蛋白质的免疫应答能力的蛋白质的截短或其他衍生物。通过氨基酸的加入，缺失，替换，或重排或通过对其进行化学修饰可制备这种其他衍生物。通过表达适当的基因片段或通过肽合成，例如使用Merrifield合成(肽，第2册，学术出版社，NY，第3页)可制备能用于制备亚单位疫苗的蛋白质的免疫原性片段。本发明的免疫原性衍生物可以是杂合的，即为含有附加序列的融合多肽，所述序列携有其他免疫原的一个和多个表位。另外，本发明的免疫原性衍生物可以与载体多肽或另一个载体融合，所述载体具有免疫刺激特性，如佐剂存在的情况下，或另外还加强了对蛋白质或其衍生物的免疫应答，或可用于表达，纯化或配制蛋白质或其衍生物。本发明还涉及使用常规连接剂如戊二醛与大分子化学缀合的HCV蛋白或其免疫原性的衍生物(Geerlings等，(1988)免疫学方法杂志(J，Immunol.Methods)，106，239-244)。通过在重组宿主细胞中表达编码所述蛋白质或其衍生物的DNA并回收产物，然后任选地制备其衍生物可制备适用于本发明的蛋白质和其免疫原性的衍生物。通过标准的DNA合成技术，如通过D.M.Roberts等人在Biochemistry1985，24，5090-5098中描述的酶连接法，通过化学合成，体外酶聚合反应或通过这些技术的联合可以合成含有这种编码序列的DNA分子。使用如DNA聚合酶I(Klenow片段)的DNA聚合酶，在含有所需的核苷三磷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP的适当缓冲液中，在10℃-37℃的温度下，一般在50ml或更小的体积中的体外酶聚合反应。使用如T4DNA连接酶的DNA连接酶，在如0.05MTris(pH7.4)，0.01MMgCl2，0.01M二硫苏糖醇，1mM亚精胺，1mMATP和0.1mg/ml牛血清白蛋白的适当缓冲液中，在4℃至室温的温度下，一般在50ml或更小的体积中进行DNA片段的酶连接。通过常规的磷酸三酯，亚磷酸酯或亚磷酰胺化学，使用如基因片段的化学和酶学合成-实验手册‘ChemicalandEnzymaticSynthesisofGeneFragments-AlaboratoryManual’(ed.H.G.GassenandA.Lang)，VerlagChemie，Weinheim(1982)或其他科学出版物，如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat，和R.C.Titmas，核酸研究(NucleicAcidResearch)，1982，10，6243；B.S.SproatandW.Bannwarth，TetrahedronLetters，1983，24，5771；M.D.MatteucciandM.H.Caruthers，TetrahedronLetters，1980，21，719；M.D.MatteucciandM.H.Caruthers，美国化学会杂志(JoumaloftheAmericanChemicalSociety)，1981，103，3185；S.P.Adams等，美国化学会杂志(JournaloftheAmericanChemicalSociety)，1983，105，661；N.D.Sinha，生物材料杂志(J.Biemat，)J.McMannus，andH.Koester，核酸研究(NucleicAcidsResearch)，1984，12，4539；andH.Koester，核酸研究(NucleicAcidsResearch)，1984，12，4539；andH.W.D.Matthes等，EMBOJournal，1984，3，801中描述的那些固相技术可进行DNA聚合物或片段的化学合成。通过使用如G.Winter等，自然(Nature)1982，299，756-758或Zoller和Smith1982；核酸研究(Nucl，AcidsRes)，10，6487-6500所述的那些常规方法定点突变，或如Chan和Smith在核酸研究(Nucl.AcidsRes.)，1984，12，2407-2419或G.Winteretal在生物化学会通讯(Biochem.Soc.Trarns.)，1984，12，224-225所述的缺失突变可制备编码突变体的DNA聚合物。重组技术描述于Maniatis等，MolecularCloning-ALaboratoryManual；ColdSpringHarbor，1982-1989。具体地说，可使用下列步骤制备本发明所用的蛋白质或免疫原性的衍生物i)制备可复制或整合的表达载体，所述载体能在宿主细胞中表达含有可编码所述蛋白质或其免疫原性的衍生物的核苷酸序列的DNA聚合物；ii)用所述载体转化宿主细胞；iii)在允许表达所述DNA聚合物的条件下培养所述经转化的宿主细胞以产生所述蛋白质；和iv)回收所述蛋白质。本文所用术语‘转化’是指通过使用如基因工程(GeneticEngineering)；Eds.S.M.Kingsman和A.J.Kingsman；Blackwell科学出版社；Oxford，England，1988所述的常规技术，用适当的质粒或病毒载体转化，转染或感染将外源DNA导入宿主细胞。下文将使用术语‘经转化的’或‘转化子’表示含有和表达感兴趣的外源基因的所得宿主细胞。通过裂解与宿主细胞相容的载体以提供具有完整复制子的线性DNA片段，在连接条件下，将所述线性片段与一个或多个DNA分子以及编码所需产物的所述线性片段连接能制备可复制的表达载体。因此，在所需载体的构建过程中可制备或形成DNA聚合物。载体的选择部分由宿主细胞决定，所述宿主细胞可以是原核的或真核的，适当的载体包括质粒，噬菌体，粘粒和重组病毒。可通过如上文提到的Maniatis等人所述的方法，常规地用适当的酶对DNA进行限制，聚合和连接可制备能复制的表达载体。通过在转化条件下用能复制的表达载体转化宿主细胞可制备重组宿主细胞。适当的转化条件是常规的，被描述于例如上文提到的Maniatis等或“DNA克隆”Vol.II，D.M.Glovered.，Irl出版公司，1985中。转化条件的选择取决于宿主细胞。因此，可用CaCl2溶液(Cohen等，美国国家科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.)，1973，69，2110)或用含有RbCl，MnCl2，醋酸钾和甘油的混合物的溶液，再用3-[N-吗啉代]-丙烷-磺酸，RbCl和甘油处理如大肠杆菌的细菌宿主。通过载体DNA的与CaCl2共-沉淀于细胞上可转化培养物中的哺乳动物细胞。在允许DNA聚合物表达的条件下培养经转化的宿主细胞可按常规进行，例如上文提到的Maniatisetal和“DNA克隆”有述。因此，优选给细胞提供营养成分并在低于45℃的温度下培养。根据宿主细胞，通过常规方法回收产物，因此，当宿主细胞是如大肠杆菌的细菌时，可用物理，化学或酶学的方法裂解之并从所得裂解物中分离蛋白质产物。当宿主细胞是哺乳动物细胞时，一般从营养介质或无细胞提取物中分离产物。常规的蛋白质分离技术包括选择性沉淀，吸收层析和包括单克隆抗体亲和柱的亲和层析。优选宿主细胞为大肠杆菌。本发明具体的一方面提供了含有HCV核心蛋白或其免疫原性的衍生物的新的化合物，所述核心蛋白与含外源表位的多肽融合。多肽优选为流感病毒的蛋白质，如NS1蛋白或其免疫原性的衍生物。编码这种新化合物的DNA，含有所述DNA的载体，被所述载体转化的宿主细胞以及它们在生产所述新化合物中的用途构成了本发明要求的另一方面。本发明的疫苗是IgG2a产生和THl细胞反应的潜在刺激剂。由于已知TH1反应对细胞介导的反应的影响，因而这是有利的。实际上在鼠中诱导IgG2a与这种免疫应答有关。本发明的疫苗加强了对细胞毒T淋巴细胞反应的诱导，当靶抗原在细胞内合成时，即在被病毒感染的过程中容易观察到CTL的诱导，因为通过蛋白酶裂解分离抗原产生的肽可进入适当的加工途径，导致与细胞膜上I类分子相关的呈递。然而，一般来说，预先形成的可溶性抗原不会到达此加工和呈递途径，不会产生I类限制的CTL。因此，常规的灭活疫苗在产生抗体和T辅助细胞反应的同时，一般不诱导CTL介导的免疫力。两种佐剂QS21和3D-MPL以及水包油乳剂的联合可克服以重组蛋白质为基础的疫苗的严重局限，并诱导广谱的免疫反应。在某些系统中，3D-MPL和QS21以及水包油乳剂的联合已经能协同增强γ干扰素的产生。水包油乳剂另外可含有山梨糖醇酯85和/或卵磷脂。3脱-O-酰化-单磷酰脂A的优选形式公开于国际专利申请No.92/116556中(SmithKlineBeechamBiologicalss.a.)。水包油乳剂可以单独使用或与其他佐剂或免疫刺激剂一起使用。本发明的另一个方面提供了本文所述的可用于医药的疫苗。QS213D-MPL的比例典型地为1∶10至10∶1；优选1∶5至5∶1，经常实质上为1∶1。最适协同作用的优选范围为2.5∶1至1∶13D-MPL∶QS21。对于给人施用的疫苗，其中存在的QS21和3D-MPL的范围典型地为每剂量1μg-100μg，优选为10μg-50μg。水包油乳剂典型地含有2-10％的角鲨烯，2-10％的α生育酚和0.3-3％的吐温80，优选角鲨烯α生育酚的比例等于或小于1，因为这可以提供更稳定的乳剂，山梨糖醇酯85也可以以1％的水平存在，在一些情况下，本发明的疫苗进一步含有稳定剂是有利的。疫苗的制备一般描述于疫苗发展和新趋势(NewTrendsandDevelopmentsinVaccines)，Voller等编，UniversityPark出版社，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。包入脂质体胶囊的技术描述于例如Fullerton，U.S.专利4,235,877中。蛋白质与大分子的缀合公开于例如Likhite，U.S.专利4,372,945和Armoretal，U.S.专利4,474,757中。每一疫苗剂量中蛋白质的量选定为在典型的疫苗中可诱导免疫保护反应，而没有显著的有害的副作用的量。一般希望每一剂量含有1-1000μg蛋白质，优选2-100μg。通过涉及观察受试者适当的免疫应答的一般性研究可确定特殊疫苗的最适量。首次免疫接种后，受试者可接受一或几次有充分间隔的加强免疫接种。本发明的制剂既可用于预防也可用于治疗目的。因此本发明的一个方面提供了治疗方法，包括给病人施用有效量的本发明的疫苗。下列实施例将阐明本发明。实施例11.1重组HCV核心融合蛋白的构建和表达质粒pMG81是pMG27(Gross等1985，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)51015)的衍生物，其中i)裂解质粒pAS1EH/801(Young等，1983，美国国家科学院院杆(Proc.Natl.Acad.Sci.)806105)得到的流感病毒株A/PR/8/34的NS1编码区的前81个密码子被插入到pL启动子的下游和ii)氨苄青霉素抗性基因被来自转座子Tn902的卡那霉素抗性基因取代，质粒pMG81被用于表达融合蛋白NS1-Core。PCR扩增丙型肝炎病毒基因型1b(Delisse等，1991.肝病学阿志(J.Hepathology)13，suppl.4S20-23)的HCV基因组序列，将其克隆到pUC12质粒上得到质粒TCM128-2。从TCM128-2中扩增相应于核心蛋白氨基酸2-166的核苷酸序列，在聚合酶链反应过程中，在核心序列的5’和3’末端产生了NcoI和XbaI限制性位点以允许它插入质粒pMG81的相同位点得到pRIT14129。pRIT14129含有融合蛋白NS1(flu)-核心(HCV)的编码序列并表达序列1中所述的多肽。融合蛋白NS1(flu)-核心(HCV)的编码序列示于序列2。序列3表示HCV基因型1a(H)的氨基酸序列1-1006。质粒pRIT14129被导入E.coliAR58(Mott等，1985，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci)，8288)中，该菌含有λpL启动子的热敏感性阻抑蛋白。在30℃下，补料分批培养条件下，在20升发酵罐中培养重组细菌，通过将温度升高至38-42℃来诱导NS1-核心蛋白的表达，然后收获细胞并机械破碎之。1.2NS1-核心融合蛋白的纯化通过制备性电泳以变性的形式纯化抗原步骤1在含有蛋白酶抑制剂(1mMpefabloc，0.5mg/亮肽素，0.1％抑肽酶)的20mM磷酸盐缓冲液，pH7中破碎(Rannie-2×14,500pi)细菌细胞。步骤2以17,000g的转速将裂解物离心25分钟，在此阶段，重组蛋白是不溶性的，应在沉淀物中回收，用10mM磷酸盐pH6.8，2MNaCl，4M尿素将沉淀物洗两次；用10mM磷酸盐pH6.8，0.15MNaCl洗三次，每次洗涤步骤后，以17,000g的转速离心25分钟，引入这些步骤是为了降低纯化产物中内毒素的含量。步骤3将洗过的沉淀物重新悬浮于SDS-PAGE还原性样品缓冲液中，煮沸5分钟，以27,000g的转速再次离心25分钟，然后上样于12％聚丙烯酰胺凝胶以分离保留下来的蛋白质(PrepCellequipment，Biorad)。步骤4在25mMTrispH8，200mM甘氨酸，0.1％SDS中将蛋白质从凝胶中电洗脱下来；在0℃下用10％TCA沉淀，最后重悬浮于10mM磷酸盐pH6.8，150mMNaCl，50mM十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)中。纯化的抗原在27-30KD的范围内出现了两条带，两条带都能被抗NS1的单克隆抗体以及抗核心的特异性人单克隆抗体和兔多克隆抗体识别。1.3NSI-核心蛋白的佐剂配制制备了两种佐剂制剂，每种含有下列水包油乳剂成分。SB265％的角鲨烯5％的生育酚0.4％的吐温80；颗粒大小为500nmSB625％的角鲨烯5％的生育酚2.0％的吐温80；颗粒大小为180nm1(a)乳剂SB62的制备(两倍浓缩)将吐温80溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以得到于PBS中的2％溶液，将5gDLα生育酚和5ml角鲨烯彻底地旋涡混合以得到100ml两倍浓缩的乳剂，加入90mlPBS/吐温溶液并彻底混合，然后将所得乳剂通过注射器，最后使用M110S微液器使乳剂微液化，所得油滴的大小约为180nm。1(b)乳剂SB26的制备使用0.4％的吐温80以相似的方法制备乳剂。1(c)以相似的方法制备表1所示的其他乳剂。1(d)融合蛋白/QS21/3DMPL/水包油制剂的制备。在1a)或b)或c)的乳剂中加入等倍体积的两倍浓缩的融合蛋白(或20μg或100μg)并混合，将之与50μg/ml的3D-MPL和20μg/ml的QS21联合得到最终的制剂，根据盐含量和pH来设置缓冲液。实施例22.1重组E1E2寡聚蛋白的制备可从被重组痘苗病毒感染的哺乳动物细胞中制备E1-E2HCV包膜蛋白的寡聚形式，所述病毒将HCV包膜序列表达成多聚蛋白，使用本
技术领域：
已知的技术将覆盖HCV基因型1a(H)的氨基酸167-1006的多聚蛋白的编码序列插入痘苗病毒载体，所得质粒用于制备可导致在被感染的细胞中表达多聚蛋白的痘苗重组病毒，被表达的多蛋白被包含和保留在细胞内。使用特殊的去污剂(Ralston等，1993，病毒学杂志(J.Virology)676753)使细胞提取物中的E1/E2蛋白复合物成为可溶性的，并从中纯化E1-E2的寡聚形式(Dubuisson等1994，病毒学杂志(J.Virology)686147)。2.2疫苗制剂的制备以与实施例1中的配制相类似的方法制备寡聚E1E2的制剂。实施例3以与实施例1中的配制相类似的方法制备含有实施例1中的融合蛋白和实施例2中的E1E2寡聚体的制剂，所述两种制剂含有50-100μg的每种蛋白质。表1两倍浓缩的载体</tables>序列11MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL51GLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMSTNPKPQRKTKRNTNRRPQ101DVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKARQ151PEGRAWAQPGYPWPLYGNEGMGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLG201KVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPPGGAARALAHGVRVLEDGVNYAT序列21GAATTCGTACCTAGATCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAA51ATAAATTCATATAAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTAT101CTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCA151GCAGGACGCACTGACCACCATGAAGGTGACGCTCTTAAAAATTAAGCCCT201GAAGAAGGGCAGCATTCAAAGCAGAAGGCTTTGGGGTGTGTGATACGAAA251CGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGCTGCCAATGTGCCAAT301CGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACCACCAAAGCTA351ACTGACAGGAGAATCCAGATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCG401CGCAGAGAAACAGGCTCAATGGAAAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGG451TAAGCGCAAAACCAGTTCCGAAAGATTTTTTTAACTATAAACGCTGATGG501AAGCGTTTATGCGGAAGAGGTAAAGCCCTTCCCGAGTAACAAAAAAACAA551CAGCATAAATAACCCCGCTCTTACACATTCCAGCCCTGAAAAAGGGCATC601AAATTAAACCACACCTTAAGGAGGATATAACATATGGATCCAAACACTGT651GTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTG701CAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGAT751CAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACATCGAGAC801AGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGAAT851CCGATGAGGCACTTAAAATGAcCATGAGCACAAATCCTAAACCCCAAAGA901AAAACCAAACGTAACACCAACCGTCGCCCACAGGACGTTAAGTTCCCGGG951CGGTGGTCAGATCGTtGGTGGAGTTTACcTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCA1001GGTTGGGTGTGCGcGCGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGT1051GGAAGGCGACAgCCTATCCCCAAGGCTCGCCaGCCCGAGGGtAGGgCCTG1101GGCaCAGCCcGGGTATCCTTGGCCCCTCTATGGCAATGAGGGCaTGGGGT1151GGGCAGGATGGCTCCTGTCACCCCGCGGCTCcCGGCCTAGTTGGGGCCCC1201AcgGACCCCCGGCGTAGGTCGCGTAATTTGGGTAAGGTCATCGATACCCT1251cACgTGCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATTCCGCTCGTCGGCGCCC1301CCccAGGGGGCGCTGCCAGGGCCtTGGCACATGGTGTCCGGGTTCTGGAG1351GACGGCGTGAACTATGCAACAtaaTCTAGAATCGATAAGCTTCGACCGAT1401GCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCA1451TGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTA1501GGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCG1551CTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGC1601ACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGC1651GAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGT1701CTTGCTGGCGTTCGTCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTT1751CAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCGCAGCA1801ACTTGTCGCGCCAATCGAGCCATGTCGTCGTCAACGACCCCCCATTCAAG1851AACAGCAAGCAGCATTGAGAACTTTGGAATCCAGTCCCTCTTCCACCTGC1901TGACGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCC1951GGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGA2001TGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCC2051TAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCG2101GCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCT2151TGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGA2201CCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAA2251TTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCT2301TGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCG2351CATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCC2401TGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAG2451AATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAAC2501GTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGT2551AAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATC2601TGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATT2651AACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCA2701TCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGT2751TCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTAT2801CATTACCCCCATGAACAGAAATTCCCCCTTACACGGAGGCATCAAGTGAC2851CAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGA2901CATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCA2951GACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTG3001CCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCC3051CGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCC3101CGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAC3151CCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATC3201AGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCA3251CAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGC3301TCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCT3351CACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGG3401AAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGG3451CCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCAC3501AAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAG3551ATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGA3601CCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTG3651GCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGT3701TCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCT3751GCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGAC3801TTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTA3851TGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACA3901CTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC3951GGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAG4001CGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGAT4051CTCAAGAAGATCCTTTGATCT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