专利名称：：甲基黄青霉素酯及其盐类、其制备方法和应用、以及药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的甲基黄青霉素酯及其盐类化合物、其制备方法和应用、以及药物组合物。技术背景结核病是一种严重危害人们生命健康的疾病，近年来结核病发病率呈明显上升趋势。耐药尤其是多药耐药结核菌快速增加。结核杆菌耐药率达到20°/。-50%,多药耐药率达到5%-20%。结核耐药情况十分严重。我国结核杆菌初始耐药率为28.1%，继发耐药率为41.1%，其中多药耐药菌的比例高达15%，已超过WHO规定的警戒线。另外，我国的HIV患者迅速增加，HIV与结核病并发感染加重了结核病疫情。目前临床抗结核治疗中使用的一线药物仍旧是一些传统的抗结核药物，包括异烟肼、利福平、链霉素等。但随着这些药物的广泛使用，耐药和多药耐药菌的不断增加，这些传统的抗结核药物渐渐失去了它们原有的疗效，据资料统计，目前异烟肼、利福平、链霉素、EMB、TH的耐药率分别达到了14.4%、10.6%、21.1%、2.4%、3.7%;近年来开发的作为结核病治疗二线药的新型喹诺酮类药物Ciprofloxacin、ofloxacin和sparfloxacin的耐药率也已达到30-40%。现有的抗结核药物已经难以控制不断出现的耐药菌引发的结核病DNA回旋酶B亚基是研究抗结核药物中的一个非常有意义的靶点。DNA回旋酶是细菌中特有的一种拓朴异构酶，由A亚基和B亚基组成，分别由gyrA和gyrB基因编码，天然的活性酶是由两个A亚基和两个B亚基组成的四聚体。DM回旋酶的A、B亚基都含有其特定的结构和功能区，共同决定着酶的生物学功能。该酶催化利用ATP的闭合环状双链DM负超螺旋反应等一系列关于DNA分子与拓朴异构体间的转化反应，为细菌生存所必须。已知喹诺酮类和香豆素类药物是DNA回旋酶的抑制剂，前者作用于A亚基，后者作用于B亚基。香豆素类化合物如新生霉素，与DNA回旋酶的B亚基具有高亲和性，而且只有B亚基存在新生霉素的结合位点，它们的结合使酶分子的构象发生改变，形成一种稳定的与ATP有较低亲和力的构象，干扰负超螺旋反应中ATP的能量耦联，从而抑制回旋酶的活性。本发明人开展了以DNA回旋酶B亚基为靶点建立筛选模型，用分枝杆菌来建立DNA回旋酶B亚基为靶点的药物筛选模型的研究。本发明采用分枝杆菌DNA回旋酶B亚基为靶点，靶向耐药结核杆菌的抗结核药物筛选模型，从7200份微生物中发现了棒曲霉Aspergillusclavatus(例如，购自保藏号CGMCC3.1290的微生物)的真菌发酵液粗提取物具有显著的抗结核菌活性，它的作用机理是抑制DNA回旋酶活性，作用靶点为DNA回旋酶B亚基。棒曲霉Aspergillusclavatus粗提取物对分枝杆菌表现出较强的特异性活性，对革兰氏阴性细菌、酵母和真菌没有活性(中国抗生素杂志2004;29(12):742-745.)。对棒曲霉Aspergillusclavatus粗提取物进行分离以及结构研究表明，其抗结核菌活性成分为新的甲基黄青霉素xanthocillinXmonomethylether类化合物。目前已知的从天然界中得到的曱基黄青霉素类化合物有xanthocillinXmonomethylether、xanthocillinXdimethylether、methoxy-xanthocillinXdimethylether体夕卜对部分革兰氏P日性细菌具有抗菌活性、抗肿瘤以及抗病毒作用(JAntibiot(Tokyo).I968Dec;21(12):671_5.、JAntibiot(Tokyo).1968Dec;21(12):676-80.);MK4588具有窄谱的抗革兰氏阳性及阴性菌活性(工Antibiot(Tokyo).1990May;43(5):456-61.);BU-4704具有抗革兰氏阳性及弱的抗革兰氏阴性菌活性(JAntibiot(Tokyo).1993Apr;46(4):687-88.)。BU-4704给出的是平面结构，两个异腈基构型未定。本发明中式1所示的化合物结构为分子相对构型，两个异腈基在异侧。其熔点以及波谱数据与BU-4704有一定差异。曱基黄青霉素及其衍生物在抗菌活性、抗肿瘤以及抗病毒方面产生了多项专利1.黄青霉素提取分离技术专利(1)1960年4月12日GerhardBarwald申请了黄青霉素的生产流程专利，欧洲专利局(espS)cenet)公开号NO.:GB898.198，申请号GB1960001309919600412.优先权号GB1960001309919600412(2)1966年R.Bergkvist获得了黄青霉素分离提取技术的专利，专利号欧洲专利局(esp扭cenet)No.US3，281，331日期1966年10月25日，相同专利其他公开号CH441198，，FI42062B2.化合物专利(1)1993年5月11日日本科学家Kurihara等人获得了黄青霉素(XME，XDE和XTE)的化合物专利，专利号UnitedStatesPatentNO.5,210,097日期1993年5月11日(2)2005年曰本Nissan化学有限公司Miyajietal申请了黄青霉素衍生物(结构式如图3)的专利，专利y^开号USPatentPubNO.US2005/02822730Al(ThrombopoetinReceptorActivatorandProcessforProducingtheSame)3.抗肿瘤相关专利1994年5月17日日本科学家TsutomuTsuruoka等人获得了黄青霉素用于治疗肿瘤的专利，实验中意外地发现了一直被公认具有抗菌作用的黄青霉素及它的衍生化合物有极高的芳香化酶的阻断活性，可以用于治疗激素依赖性疾病。其中包括治疗乳腺癌，前列腺炎等男女疾病，USPatent[19]No.5,312,833日期1994年5月17日4.血小板生成受体激活剂的专利2005年Nissan化学有限公司Miyajietal申请了黄青霉素衍生物具有血小板生成受体激活剂的活性的专利，专利号USPatentPubNO.US2005/02822730Al(ThrombopoetinReceptorActivatorandProcessforProductingtheSame)5.黄青霉素作为芳香酶抑制剂的相关专利1995年曰本科学家NAKAYAMAMASAJIatel申请了黄青霉素作为芳香酶抑制剂的专利，申请号JP1993023714019930831;优先权号JP1993023714019930831/>布日期1995年3月14日6.黄青霉素X作为驱虫剂的专利1990年日本明治制药有限公司高木申请了黄青霉素X作为驱虫剂的专利，主要是作用于豚，马，牛，羊，狗，猫等家禽体内的会引起寄主贫血，营养不良，体虛，生育能力低下等的吸血虫等多种寄生虫，欧洲专利局，专利^>开号JP2040324.申请号JP1988018672019880728.优先权号:JP1988018672019880728日本专利公报，NO.特开平2-40324未发现甲基黄青霉素硫酸酯以及其盐类化合物及其制备方法，以及其具有抗结核菌的相关文献以及专利的报道。本发明目的在于提供新的甲基黄青霉素酯及其盐类化合物及其制备方法，以及其在抗结核菌中的应用、以及含有曱基黄青霉素酯及其盐类化合物的药物组合物。
发明内容本发明的第一方面，涉及的是新化合物曱基黄青霉素酯及其药学上可接受的盐类的结构如式l所示。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式1其中，R表示C2-C10。的含环或不含环的酰基，C2-C5的磺酰基，(C1-C6烷基或者闺素)取代的或未取代的苯磺酰基，氨基酸酰基，-HS03、-H2P03、以及它们与金属或非金属形成的盐。本发明特别涉及如上述式1中之一的曱基黄青霉素硫酸酯及其药学上可接受的盐，特别是甲基黄青霉素硫酸酯的钠、钾或铵盐。本发明的第二方面，涉及含有治疗有效量的甲基黄青霉素酯及其盐类化合物为有效成分以及一种或多种药用载体的药物组合物。本发明的第三方面，涉及涉及一种甲基黄青霉素酯及其盐类化合物在制备抗结核药物中的应用。本发明的第四方面，涉及一种甲基黄青霉素>^酸酯及其盐类化合物的制备方法，主要包括以下步骤a:培养:在培养基中培养具有产生甲基黄青霉素硫酸酯能力的棒曲霉Aspergillusclavatus的真菌微生物使之在培养物中生成和积累。步骤a中的培养基是釆用所用微生物能利用的营养源，其中碳源可以采用葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油，可两种以上组合使用；氮源组合使用蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、血冻，此外可以在适当地添加钠盐、钾盐、磷酸盐、聚乙二醇；培养方法为震荡、通气搅拌的液体培养方法；另外步骤a中的培养基液体pH-6.0;培养基温度保持在25-30t:培养时间3-5天。b:分离按照发酵产物的一般提取分离方法从发酵液中提取分离含有甲基黄青霉素硫酸酯的盐类的粗提取物。步骤b所述的一般提取分离方法包括溶媒提取、大孔吸附树脂、层析法。首先进行过滤或离心除去菌丝体，发酵液釆用大孔吸附树脂吸附，将甲基黄青霉素硫酸酯吸附大孔吸附树脂上，再用包括乙酸乙酯-丙酮的有机溶剂作为洗脱液将其洗脱下来。洗脱液根据所需要得到的钠、钾、铵等盐分别加入适量的醋酸钾、醋酸钠、或醋酸铵，0-25匸条件下搅拌2-5h，0-25'C条件下减压回收乙酸乙酯-丙酮，剩余物进行冷冻干燥，得到甲基黄青霉素硫酸酯的钾、钠、铵盐类的粗提取物。c:精制进一步分离精制甲基黄青霉素硫酸酯的盐类，采用一般小分子化合物分离精制方法。步骤C所迷的精制方法是采用硅胶吸附层析，以乙酸乙酯-丙酮为洗脱剂，可以适量加入少量的DMS0;以及0DS键合型硅胶的反相层析，以乙腈-水或甲醇-水为洗脱剂。精制过程中甲基黄青霉素硫酸酯的盐类的确认釆用甲基黄青霉素硫酸酯抑制微生物活性的生物检测法以及高效液相层析法联用。d.:甲基黄青霉素硫酸酯的制备从上述步骤得到的盐溶于DMS0中，加入稀酸调节pH得到甲基黄青霉素硫酸酯。甲基黄青霉素硫酸酯结构确证及数据甲基黄青霉素疏酸酯为白色晶体，硪蒸气显色反应阳性。熔点157-162X:(分解);高分辨质谱ESI-MS—显示分子量为382.05480，分子式为C19H14謹5S。^NMR、13CNMR表明分子中含有两个A2B2芳香偶合系统、两个孤立双键以及甲氧基信号，13CNMR数据同时显示分子中含有取代a、P不饱和苯丙异腈特征。ESI-MS-:381.05480(M-1)，301.09831(M—S03),286.07503(M-S03-CH3)274.08770(M-S03-HCN),259.06417(M-S03-CH3-HCN)。!HNMR:7.87(2H,d，J=9.OHz，2"、6"),7.80(2H,d，J=9.OHz,、6')，7.31(1H，S,4-H)，7.30(1H，S,1-H),7.19(2H,d，J-9.0Hz，3"、5")，7.11(2H，d，J-9.OHz，3'、5')，3.83(3H，s，Ar-OCH3)。"CNMR数据见表l。表1甲基黄青霉素硫酸酯的"CNMR数据<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>抗结核菌活性测定1.材料和方法(l)受试药物作为本发明的化合物甲基黄毒霉素硫酸酯、甲基黄毒霉素硫酸酯的钠盐和甲基黄毒霉素硫酸酯的钾盐；对照药异烟肼(INH)和利福平(RFP)为Sigma公司产品。(2)实验菌抹结核分枝杆菌标准林H37Rv为本室保存菌林。(3)培养基7H9液体培养基(Difco公司产品)。(4)方法无菌96孑L板(Falcon3072;BectonDickinson,LincolnPark,N.J.)，200jli1灭菌水加入96孔板的四周的各孔中，以防止培养过程中各实验孔的成分蒸发。INH以灭菌蒸镏水溶解，本发明的化合物及RFP以二甲基亚砜溶解，制成浓度为6.4mmg/ml的初溶液，用7H9培养基(不含吐温-80)稀释为所需的各二倍浓度，加入96孔板lOOjiil，化合物终浓度为0.5，1,2，4，8，16，32jig/ffll。，INH和RFP终浓度为:0.006、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、pg/ml。结核分枝杆菌H37Rv,每孔接种100m1，菌的终浓度为lx105CFU/ml。每板上均设2个不含抗菌药的生长对照孔，96孔板于37"C孵育。7天后加入生长对照孔20m110xAlamarBlue(Setotec公司产品)和5%Tween8050"1的混合液，37孵育24小时，如果颜色从蓝色变为粉色，则在各实验药物的孔内加入上述量的AlamarBlue和Tween80混合液，37C將育24小时记录各孔的颜色，MIC定义为阻止颜色变化(从蓝色变为粉红色)的最小抑菌浓度。2.结果MABA法测定的最小抑菌浓度(MIC)如表2。表2MABA法测定的最小抑菌浓度(MIC)曱基黄毒霉素硫酸酯1甲基黄毒霉素硫酸酯的钠盐4甲基黄毒霉素硫酸酯的钾盐2濯0.025RFP0.0125在本实验条件下，曱基黄毒霉素硫酸酯、甲基黄毒霉素硫酸酯的钠盐和甲基黄毒霉素硫酸酯的钾盐对结核分枝杆菌标准林HnRv的MIC分别为lng/ml、4jug/ml和2ng/ml，INH和RFP的MIC分别为0.025pg/ml和0.0125ng/ml。1.甲基黄青霉素疏酸酯的高分辨质镨2.甲基黄青霉素硫酸酯的高分辨多级质傳3.甲基黄青霉素硫酸酯的屮NMR图谱4.甲基黄青霉素疏酸酯的"CNMR图镨5.甲基黄青霉素硫酸酯的力-111C0SPY图谱具体实施方案下面的实例适用于进一步说明本发明，但不意味着本发明仅限于此。曱基黄青霉素硫酸酯以及甲基黄青霉素硫酸酯的钠盐、甲基黄青霉素硫酸酯的钾盐的具体制备方法如下制备实例1:培养基组成a.斜面培养基Sabouraud培养基葡萄糖4%,蛋白胨1%，琼脂1.5%，pH5.6。b.—级种子培养基甘油1%，KH2P040.03%，葡萄糖1%，可溶性淀粉1%，蔗糖1%，黄豆粉0.2%，聚乙二醇60000.25%，NaNO30.3%，蛋白胨1%，(NH4)2S040.03%,pH6.0(—般情况下培养基配完自然达到6.0)。c.二级种子培养基(同一级种子培养基)d.发酵培养基(同一级种子培养基，罐上发酵再加入万分之三消泡剂)制备实例2:培养方法从新鲜培养好的棒曲霉Aspergillusclavatus真菌斜面上挑取(一般500ml摇瓶中挑取指甲盖大小即可)的菌接入一级种子培(20%装量，500ml摇瓶)，一级种子摇瓶中需要加入适量玻，为了防止菌丝体成团，28t:培养48小时，摇床转速200rpm/s。一级种子培养基转入二级种子培养基(20%装量，500ml量基珠适养璃摇瓶)，接种量5%，这次摇瓶中无需加入玻璃珠，28r:培养24小时，摇床转速200rpm/s。二级种子培养基转入发酵培养基，接种量10%，溶氧保持在30%以上，28t:培养78-80小时左右，发酵pH接近7.7时放罐。制备实例3:曱基黄青霉素硫酸酯的钾盐的制备取真菌棒曲霉Aspergillusclavatus发酵物50L,冷藏12h，过滤，滤液以20ml/min的速度在41C条件下流过预先装入2LHP20大孔吸附树脂的层析柱，吸附完成后，依次采用20L水、10L306丙酮淋洗HP20树脂，然后采用6L乙酸乙酯-丙酮3:7(V/V)混合溶液洗脱，分步收集洗脱液、100ml/瓶。合并含有甲基黄青霉素硫酸酯的洗脱液、加入醋酸钾0.6g，搅拌3h，然后在5*€以下减压乙酸乙酯-丙酮，回收乙酸乙酯-丙酮后的剩余物冷冻干燥，得到20g含有甲基黄青霉素硫酸酯的钾盐化合物的粗提物。将18g含有甲基黄青霹素硫酸酯的钾盐化合物的粗提物溶于200ffll乙酸乙酯中，在零下16-18匸条件下进行硅胶柱层析，依次用乙酸乙酯500ml、乙酸乙酯-丙酮(9:1，V/V)300ml、乙酸乙酯-丙酮(8:2，V/V)1000ml洗脱，将含有甲基黄青霉素硫酸酯的钾盐化合物的乙酸乙酯-丙酮8:2洗脱部位合并，5X:以下减压浓缩至原体积的1/10，液浓缩进行反复硅胶柱层析，将含有甲基黄青霉素硫酸酯的钾盐化合物的洗脱液浓缩，冷藏条件下结晶，得到甲基黄青霉素硫酸酯的钾盐化合物晶体，将甲基黄青霉素硫酸酯的钾盐化合物晶体用乙酸乙酯洗涤数次，过滤，得到白色的甲基黄青霉素硫酸酯的钾盐化合物纯品100mg。制备实例-4甲基黄青霉素硫酸酯的钠盐的制备-取真菌棒曲霉Aspergillusclavatus发酵物50L，冷藏12h，过滤，滤液以20ml/min的速度在4^C条件下流过预先装入2LHP20大孔吸附树脂的层析柱，吸附完成后，依次釆用20L水、10L30。/。丙酮淋洗HP20树脂，然后采用6L乙酸乙酯-丙酮3:7(V/V)混合溶液洗脱，分步收集洗脱液、100ml/瓶。合并含有曱基黄青霉素硫酸酯的洗脱液、加入醋酸钠0.8g,搅拌3h,然后在51C以下减压乙酸乙酯-丙酮，回收乙酸乙酯-丙酮后的剩余物冷冻千燥，得到20g含有甲基黄青霉素硫酸酯的钠盐化合物的粗提物。将18g甲基黄青霉素硫酸酯的钠盐粗提物溶于400ml乙酸乙酯中，在零下16-18X:条件下进行硅胶柱层析，依次用乙酸乙酯500ml、乙酸乙酯-丙酮(9:1，V/V)300ml、乙酸乙酯-丙酮(8:2，V/V)1000ml洗脱，将含有甲基黄青霉素硫酸酯的钠盐化合物的乙酸乙酯-丙酮8:2洗脱部位合并，浓缩至原体积的1/10，液浓缩进行反复硅胶柱层析，将含有甲基黄青霉素硫酸酯的钠盐化合物的洗脱液浓缩，冷藏条件下结晶，得到甲基黄青霉素硫酸酯的钠盐化合物晶体，将甲基黄青霉素硫酸酯的钠盐化合物晶体用乙酸乙酯洗涤数次，过滤，得到白色的甲基黄青霉素硫酸酯的钠盐化合物纯品80mg。制备实例-5甲基黄青霉素硫酸酯的制备甲基黄青霉素硫酸酯的钾盐25mg，溶于IOml乙酸乙酯-二曱亚砜-9:l的混合溶剂中，-5t:条件下，滴加0.1M盐酸0.6ml，保持温度在-5。C搅拌15min后，加入预先冷冻至-10X:的乙酸乙酯50ml，冰-水混合物50ml，剧烈振摇后，快速分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层用冰-水混合物5Gml快速洗涤后，4t:条件加入无水硫酸钠干燥过夜。滤除疏酸钠的千燥乙酸乙酯溶液在-10iC条件下快速减压浓缩至干，得到甲基黄青審素硫酸酯8mg。权利要求1.一种如式1所示的甲基黄青霉素酯及其药学上可接受的盐，id="icf0001"file="S2008100978184C00011.gif"wi="119"he="44"top="61"left="49"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式1其中，R表示C2-C10的含环或不含环的酰基，C1-C5的磺酰基，(C1-C6烷基或者卤素)取代的或未取代的苯磺酰基，氨基酸酰基，-HSO3、-H2PO3、以及它们与金属或非金属形成的盐。2.权利要求1所述的甲基黄青霉素酯及其药学上可接受的盐，其是甲基黄青霉素硫酸酯的钠、钾或铵盐。3.—种产生如权利要求2所述的甲基黄青霉素酯及其药学上可接受的盐类的制备方法，该方法包括以下步骤a:培养:在培养基中培养具有产生曱基黄青霉素硫酸酯能力的棒曲霉Aspergillusclavatus的真菌微生物4吏之在培养物中生成和积累。b:分离按照发酵产物的提取分离方法从发酵液中提取分离含有甲基黄青霉素硫酸酯的盐类的粗提取物。c:精制采用小分子化合物分离精制方法，进一步分离精制曱基黄青霉素硫酸酯的盐类。4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤a中的培养基是采用所用微生物能利用的营养源，其中碳源采用葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油中的一种或两种以上；氮源使用蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、血冻中的一种或两种以上，添加或不添加钠盐、钾盐、磷酸盐、或者聚乙二醇；培养方法为震荡、通气搅拌的液体培养方法；所述培养基的液体pH-6.0;培养基温度保持在25-30C，培养时间3-5天。5.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤b所述的提取分离方法包括溶媒提取、大孔吸附树脂、层析法。6.根据权利要求5所述的方法，其中，首先进行过滤或离心除去菌丝体，发酵液釆用大孔吸附树脂吸附，将甲基黄青霉素硫酸酯吸附大孔吸附树脂上，再用有机溶剂将其洗脱下来，洗脱液根据所需要得到的钠、钾、铵盐分别加入醋酸钾或醋酸钠或醋酸铵，在0-25匸条件下搅拌2-5h,在0-25。C条件下减压回收有机溶剂，剩余物进行冷冻干燥，得到甲基黄青霉素疏酸酯的钾、钠或铵盐的粗提取物。7.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤c所述的精制方法是采用硅胶吸附层析，其以乙酸乙酯-丙酮为洗脱剂，加入DMSO;以及ODS键合型硅胶的反相层析，其以乙腈-水或曱醇-水为洗脱剂；精制过程中甲基黄青霉素硫酸酯的盐类的确认采用甲基黄青霉素硫酸酯抑制微生物活性的生物检测法以及高效液相层析法的联用。8.—种产生如权利要求3所述的甲基黄青霉素酯及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于在甲基黄青霉素硫酸酯的钾、钠或铵盐的DMSO溶液中，加入稀酸调节pH，得到甲基黄青霉素硫酸酯。9.权利要求1中的化合物在制备用于抑制结核杆菌以及防治结核病中的药物中的应用。10.药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1中的化合物及药学上可接受的载体。全文摘要本发明涉及甲基黄青霉素酯及其盐类、其制备方法和在抗结核方面的应用、以及药物组合物。文档编号A61K31/277GK101265214SQ200810097818公开日2008年9月17日申请日期2008年5月15日优先权日2008年5月15日发明者艳关,刘振龙,明张,张勇忠,肖春玲,郝雪秦申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所