产耐盐中性纤维素酶的菌株及筛选方法和应用与流程

文档序号:12248396阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一株产耐盐中性纤维素酶的菌株,该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏地址:中国武汉武汉大学,分类命名:Streptomyces sp CW,保藏号CCTCC M 2016437,保藏日:2016.8.29,该菌株的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的一株产耐盐中性纤维素酶的菌株筛选方法,其特征在于,通过以下步骤实现:

(1)取少量样品加入到液体富集培养基富集1天后,将经过富集培养后的菌液稀释到10-4,取稀释液涂布于刚果红平板上;

(2)培养5天后,用接种针挑出刚果红平板上产生明显透明圈且不同形态的菌落,转接到刚果红平板上分离单菌落,获得多株菌;

(3)将每株菌株接种于产酶培养基,28℃培养5天,取发酵后的培养基6000rpm离心5分钟获取粗酶液;

(4)实验组将适当稀释的粗酶液0.5mL,含1%CMC-Na的pH6.0的磷酸缓冲液2.0mL混合,空白组不加入粗酶液,于50℃孵育30分钟,实验组再加入2.5mL的DNS溶液,空白组同时再加入相应的粗酶液,混合均匀后沸水浴5分钟,待冷却后测定实验组与空白组在540nm的吸光值,差值大即为酶活高,选出纤维素酶酶活高的一株菌株,将其命名为Streptomyces sp CW。

3.根据权利要求2所述的一株产耐盐中性纤维素酶的菌株筛选方法,其特征在于,步骤(1)中富集培养基的组成为:CMC-Na 5g,K2HPO4 0.5g,MgSO4 0.5g,NaCl 0.5g,蒸馏水1000mL,pH6.5~7。

4.根据权利要求2所述的一株产耐盐中性纤维素酶的菌株筛选方法,其特征在于,步骤(1)和步骤(2)中刚果红平板培养基组分为:CMC-Na 5g,NH4Cl 1g,刚果红0.4g,琼脂16g,蒸馏水1000mL,pH6.5~7。

5.根据权利要求2所述的一株产耐盐中性纤维素酶的菌株筛选方法,其特征在于,步骤(3)产酶培养基组分为:麸皮48.9g,NH4NO3 8g,K2HPO4 4g,NaCl 4g,FeSO4 1g,蒸馏水1000mL。

6.根据权利要求1所述菌株生产耐盐中性纤维素酶的方法,其特征在于,通过以下步骤实现:

(1)产酶培养:将Streptomyces sp CW接种于斜面高氏1号培养基,30℃培养4天后转接不含琼脂的高氏1号液体培养基,30℃200rpm下培养24小时,以5%接种量再转接发酵产酶培养基,在30℃200rpm条件下培养6天,得发酵液;

(2)胞外产物粗酶液的处理:将发酵液以6000rpm的转速离心5分钟,取上清液,即为粗酶液;

(3)硫酸铵分级沉淀处理:取20mL粗酶液加入(NH4)SO4粉末3.52g,混合均匀,静置2小试,6700rpm冷冻离心20分钟,取上清液,加入(NH4)SO4粉末3.96g,混合均匀,静置2小时,6700rpm冷冻离心20分钟,弃上清液,取沉淀溶于20mL 0.06M的磷酸缓冲液中,再将溶于磷酸缓冲液中酶液于0.06M磷酸缓冲液中透析过夜;用聚乙二醇浓缩透析液,再经0.22微米微孔滤膜过滤除杂,收集滤液;滤液即为耐盐中性纤维素酶酶液。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述高氏培养基组成为:可溶性淀粉20g,KNO3 1g,K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,NaCl 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,琼脂18g,蒸馏水1000mL,pH6.5~7.0。

8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述产酶培养基组成为:麸皮48.9g,NH4NO3 8g,K2HPO4 4g,NaCl 4g,FeSO4 1g,蒸馏水1000mL。

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