一种产脂肪酶的黄连木内生菌的制作方法

本发明涉及一种微生物，具体涉及一种产脂肪酶的黄连木内生恶臭假单胞菌PC2(Pseudomonas putida)PC2。

背景技术：

黄连木(Pistaciachinensis Bunge)属于漆树科黄连木属落叶乔木。黄连木籽含油量接近50％，脂肪酸链长多在C17-C19之间，是生成生物柴油的理想木本油料植物。植物内生菌(endophyte)是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。脂肪酶是一类能在水-油界面催化甘油三酯水解，并在非水相介质中催化酯合成反应的酶，可广泛应用于食品、医药、皮革、日用化工等方面。但至今关于在黄连木中可产脂肪酶内生菌的报道非常有限。我们希望从黄连木种子中分离出新型的内生菌资源，并可以分离出新的脂肪酶基因从而加以应用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种产脂肪酶的黄连木内生菌。

上述提及的黄连木内生菌，命名为恶臭假单胞菌PC2(Pseudomonas putida)PC2，于2015年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M2015318。

本发明的菌株PC2的形态学特征：将培养12-16h的PC2菌株进行革兰氏染色，置于显微镜下观察，单个菌落表面光滑，白色(见图1A)，革兰氏染色观察菌体呈杆状、革兰氏阴性菌(图1B)。

将本发明菌株PC2接种于LB液体培养基中，28℃培养12-16h，利用TENS法提取基因组DNA，再利用细菌通用引物8F/1506R扩增16S rDNA片段。PCR扩增体系：15μL的2×Taq MasterMix(含Mg²⁺，dNTPs，DNA聚合酶)、10μL mQH2O、2μL的正反向引物和1μL模板DNA。PCR扩增条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸2min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳、胶回收、并送公司测序，测序结果在NCBI网站进行BLAST比对，与恶臭假单胞菌有最大同源相似性(＞99.9％)。结合形态学特征，鉴定本菌株PC2为恶臭假单胞菌，并将其命名为恶臭假单胞菌PC2(Pseudomonas putida)PC2。

将本发明菌株PC2以三丁酸甘油酯为底物，或以橄榄油为底物、维多利亚蓝B为指示剂，于LB固体培养基上进行酶活性测定，有明显的水解圈和变色圈，表明本发明菌株PC2能产脂肪酶。

本发明首次从黄连木种子中分离得到可产脂肪酶的内生恶臭假单胞菌PC2，为分离出新的脂肪酶基因提供了新内生菌。

附图说明

图1是本发明菌株PC2的形态学特征图。

其中：A为单菌落；B为革兰氏染色图。

图2是本发明菌株PC2于维多利亚蓝B筛选板和三丁酸甘油酯筛选板上的水解圈图。

其中，C为维多利亚蓝B筛选板；D为三丁酸甘油酯筛选板。

具体实施方式

实施例1

取产于江苏的健康的黄连木果实若干，去果皮后，依次浸于75％质量浓度的酒精10min和0.1％质量浓度的HgCl₂溶液10min进行表面消毒，再用无菌水清洗5次，每次1min。将表面消毒后的果实种子置于无菌研钵中，加少量无菌水磨碎，取1mL研磨液，均匀涂抹于牛肉膏蛋白胨培养基，同时以等量的最后一次清洗液为对照，各设3组平行，于30℃培养3-7天。利用平板划线的方式，对生长出的菌种进行分离、纯化，即得本发明菌株PC2。

实施例2

将本发明菌株PC2划线培养于LB平板上，28℃培养过夜，然后接种一个单菌落于LB液体培养基，28℃震荡培养过夜，再分别取2μL菌液，分别点在维多利亚蓝B筛选板(pH为8.0)和三丁酸甘油酯筛选板上，以大肠杆菌为阴性对照，28℃培养过夜。见图2，本发明菌株PC2在该两种板上均产生明显的水解圈，并且可以导致维多利亚板变色，说明本发明菌株PC2能产生碱性脂肪酶。

上述三丁酸甘油酯筛选板：80ml LB固体培养基+1.6ml三丁酸甘油酯乳化液。其中，三丁酸甘油酯乳化液：6ml 4％阿拉伯树胶液+1/3体积(2ml)灭菌三丁酸甘油酯，无菌条件下乳化；4％阿拉伯树胶是取4g阿拉伯树胶粉，加入100ml蒸馏水，加热搅拌，121℃灭菌20min，即得。

上述维多利亚蓝B筛选板：80mlLB固体培养基+1.6ml橄榄油乳化液+4mg维多利亚蓝B粉末。其中，橄榄油乳化液：45ml 3％PVA+15ml橄榄油，震荡混匀；3％PVA溶液是取7.5g PVA，加入250ml无菌水，加热混匀，勿沸腾，即可，pH为7.5。