芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物防治领域，具体涉及一种芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
：芽孢杆菌(Bacillus)因可以产生具有抑菌、抗肿瘤、免疫增强等活性的多糖、蛋白质等物质而成为人们研究的热点。此外，芽孢杆菌还可以用于生物防治。除苏云金芽孢杆菌产生的伴孢晶体可以毒杀鳞翅目的幼虫而被开发为细菌杀虫剂外，芽孢杆菌产生的孢子可以长久存在于自然环境中因而可以开发为经济实用的生物农药。解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，巴氏芽孢杆菌(B.pasteurii)，蜡样芽孢杆菌(B.cereus)和蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)都可以用作控制不同作物真菌疾病的生物制剂。蜡样芽孢杆菌(B.cereus)AR156可以有效诱导拟南芥抑制由丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000引起的病变；解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)FLN13对从病变小麦中筛选的5种镰刀菌都具有抗性作用，并且解淀粉芽孢杆菌FLN13与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SLG17的混合物应用于大田中的抽穗期至开花期小麦时可以降低小麦赤霉病指数；两种植物内生菌B.oryzicola菌株YC7007和YC7010T具有抗微生物、促进水稻生长和系统诱导抑制活性。但是，上述生防菌都仅对农作物或水果疾病有防治作用，目前还没有对引起谷类(小麦、大麦、玉米)和蔬菜水果(黄瓜、番茄)疾病的某些植物病原菌都有抑制作用的生物制剂的报道。基于上述现状，经检索，2013年王洪梅等研究的甲基营养芽孢杆菌N5对番茄青枯病致病菌茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)具有抑制作用。但是，N5显现如下特性：第一，N5菌落周边不规则；第二，N5培养温度为30℃；第三，N5发酵液提取的脂肽类物质具有抑菌作用；第四，N5发酵液用硫酸铵提取的粗蛋白仅30％～50％饱和度具有抑菌作用。2013年和2014年，黄霄等研究的甲基营养芽孢杆菌BM-24对香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型Fusariumoxysporumf.sp.cubense(FOC)具有抑菌活性，并且，BM-24菜籽饼发酵液对粉蕉枯萎病具有一定的防治作用，还可以促进粉蕉苗的生长。粉蕉枯萎病是制约粉蕉生产的主要因素，粉蕉是芭蕉属一个不可替代的香蕉杂交栽培种，易被香蕉枯萎病菌1号生理小种侵染。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种芽孢杆菌及其应用。本发明所涉的芽孢杆菌菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)C1，保藏号为GDMCCNo.60046，能够作为生防菌株起到拮抗作物病原菌中的作用；能够作为抑制作物病原菌的脂肽类和/或蛋白质的发酵菌株，能够作为促生菌株促进作物生长，能够作为植物生长素的发酵菌株本发明菌株具有广谱抑菌活性；不产生对禾谷镰刀菌具有抑制作用的脂肽类物质，但产生对对禾谷镰刀菌具有抑制作用的蛋白质。本发明是通过以下技术方案实现的：第一方面，本发明提供一种芽孢杆菌，所述芽孢杆菌菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)C1，保藏号为GDMCCNo.60046。优选地，所述芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQIDNO.3所示。优选地，所述芽孢杆菌的形态特征包括：短杆状，0.5～1.7×1.6～4.3μm；革兰氏染色呈紫色；菌落乳白色、圆形、较湿润、边缘较规则。优选地，所述芽孢杆菌的培养条件包括：温度为25～46℃、pH值为4～9、装液量为每250mL体积装培养液25～200mL。更优选地，所述芽孢杆菌的培养条件包括：温度为39℃、pH值为7、装液量为每250mL体积装培养液25mL。优选地，所述芽孢杆菌的生理生化特征包括如表2和表3所示的特性。第二方面，本发明提供一种所述芽孢杆菌作为生防菌株在拮抗作物病原菌中的应用。优选地，所述病原菌包括串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌、瓜类炭疽病菌、尖孢镰刀菌、玉米弯孢菌。第三方面，本发明提供一种所述芽孢杆菌作为抑制作物病原菌的蛋白质的发酵菌株的用途。优选地，所述病原菌包括禾谷镰刀菌。第四方面，本发明提供一种所述芽孢杆菌作为促生菌株在促进作物生长中的应用。优选地，所述作物包括玉米。第五方面，本发明提供一种所述芽孢杆菌作为植物生长素发酵菌株的用途。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：1、从抗菌谱上来讲，本发明的菌株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)C1是一株对禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum，引起小麦、大麦赤霉病和玉米穗腐病)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme，引起玉米穗腐病、玉米弯饱菌(Curvularialunata，引起玉米叶斑点病)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporium，引起番茄镰刀菌枯萎病)和瓜类炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare，引起黄瓜炭疽病)等5种植物病原菌都有抑制作用的菌株。2、从抗菌机制上来讲，本发明甲基营养型芽孢杆菌C1菌株是通过产生抗性蛋白对禾谷镰刀菌的生长具有抑制作用，并且，菌株C1对玉米的生长具有促进作用。3、现有甲基营养芽孢杆菌N5(2013年王洪梅等报道)相比，本发明的菌株具备如下特性：(1)C1菌落规则、较圆，而N5菌落周边不规则；(2)C1最适培养温度为39℃，而N5培养温度为30℃；(3)C1发酵液提取的脂肽类物质不具有抑菌作用，而N5发酵液提取的脂肽类物质具有抑菌作用；(4)C1发酵液用硫酸铵不同饱和度(0～30％饱和度、30％～50％饱和度和50％～80％饱和度)提取的粗蛋白质都具有抑菌作用，而N5发酵液用硫酸铵提取的粗蛋白仅30％～50％饱和度具有抑菌作用。4、与现有甲基营养芽孢杆菌BM-24(2013年和2014年，黄霄等)相比，本发明菌株C1抑制的尖孢镰刀菌主要引起番茄镰刀菌枯萎病。因此，菌株C1与BM-24抑制的病原菌不同。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1拮抗菌株对病原菌的抑制；其中：A为菌株C1抑制弯孢菌；C为菌株C1抑制禾谷镰刀菌；E为菌株C1抑制瓜类炭疽菌；图2菌株C1菌落形态；图3菌株C1革兰氏染色显微观察(1000×)；图4菌株C116SrDNA序列进化树；图5温度对菌株C1的影响；图6pH值对菌株C1的影响；图7装液量对菌株C1的影响；图8菌株C1的生长曲线；图9菌株C1脂肽类物质抗菌活性的检测；其中，A是检测平板的反面，B是检测平板的正面，A和B中:1为脂肽类物质，2为脂肽类物质，3为酸沉淀后的上清液，4为甲醇；图10菌株C1发酵液经硫酸铵不同饱和度分级沉淀的抑菌效果；其中，1、0～30％饱和度2、30％～50％饱和度3、50％～80％饱和度4、80％～100％饱和度；图11菌株C1促进玉米生长的效果；图12菌株C1分泌植物生长素的测定；其中，1是对照(无菌水)，2是菌株C1。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。1材料与方法1.1供试菌株本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus)C1菌株已在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码510075；本发明菌株的信息为：芽孢杆菌属(Bacillus)C1，分离自土壤；保藏号为GDMCCNo.60046；保藏日期为2016年6月13日。1.2供试病原菌玉米弯饱菌(Curvularialunata)，禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporium)，串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)，瓜类炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)。1.3培养基PDA培养基：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g(液体不加琼脂)蒸馏水定容至1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。LB培养基：蛋白胨20g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂15-20g(液体不加琼脂)，最后蒸馏水定容至1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。1.4方法1.4.1供试菌拮抗真菌病原菌性能测定采用平板对峙方法，于不同PDA平板中央接不同病原菌菌丝块(直径为4mm)，同时在距平板中央20mm位置接供试菌菌块(直径为4mm)，重复4次，以只接对应病原菌的平板为对照，28℃培养，当对照组平板长满病原菌，测量C1拮抗处理后的病原菌菌苔直径，并计算抑菌率＝(对照组病原菌菌苔直径－处理组病原菌菌苔直径)/对照组菌苔直径×100％。1.4.2菌株C1的鉴定根据菌株C1的形态学特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析进行鉴定。16SrDNA基因序列以通用引物为引物进行扩增：27f(SEQIDNO.1)：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；1541r(SEQIDNO.2)：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’；用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析序列，通过MEGAversion5.1软件，以邻近法建立系统进化树，采用1000次重复取样进行Bootstrap检验(Kumaretal.,2004)。1.4.3不同培养条件对菌株C1的影响1.4.3.1温度对菌株C1的影响：将C1菌液按0.1％的接种量接种试管中的LB培养基(10mL/管)，分别在4℃、11℃、18℃、25℃、32℃、39℃、46℃、53℃条件下培养12h，以LB培养基为空白对照，测定各管中菌液的OD600。重复三次。1.4.3.2pH值对菌株C1的影响：将C1菌液按0.1％的接种量接种不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的LB培养基(5mL/管)，150rpm、37℃摇床培养12h，测定各管中菌液的OD600。重复三次。1.4.3.3装液量对菌株C1的影响：将C1菌液按0.1％的接种量接种到不同装液量(25mL、50mL、75mL、100mL、150mL、200mL/250mL三角瓶)的LB中，150rpm、37℃摇床培养12h，测定各瓶中菌液的OD600。重复三次。1.4.4菌株C1生长曲线的测定将C1菌液按0.1％的接种量接种LB培养基(5mL/管)，150rpm、37℃摇床培养，分别培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18h，以LB培养基为空白对照，测定各管中菌液的OD600。重复三次。1.4.5脂肽类物质的提取及抗禾谷镰刀菌活性的检测将菌株C1接种于液体LB培养基中，37℃170rpm摇床培养72h。8000rpm离心15min，取上清，上清液加入6mol/LHCl调pH至2.0，4℃过夜。离心收集沉淀，加入甲醇后用1mol/LNaOH调节pH至7.0，再用甲醇抽提2次，获得脂肽类化合物粗提物。采用牛津杯法检测脂肽粗提物抑菌效果。取禾谷镰刀病原菌平板，用无菌水将禾谷镰刀孢子洗下，吸取100μL禾谷镰刀菌孢子悬液涂布于PDA平板上，每平板放4个牛津杯，其中2个杯中加入脂肽粗提物100μL，一个杯中加入甲醇100μL，一个杯中加入上清100μL。28℃培养72h，观察抑菌效果。1.4.6蛋白质的提取及抗禾谷镰刀菌活性的检测将菌株C1培养液离心，取上清液，加入固体硫酸铵分别至四个饱和度(0～30％、30％～50％、50％～80％和80％～100％)进行分级沉淀，得到四种蛋白质，4℃下过夜。10000rpm、4℃离心20min。每50mL培养液所得沉淀用2mL浓度为20mmol/LTris-HCl(pH7.5)缓冲液悬浮。牛津杯法比较不同饱和度盐沉淀的蛋白的抑菌活性。用无菌水将禾谷镰刀病原菌孢子洗下，吸取100μL孢子悬液涂布于PDA平板上，每个平板放五个牛津杯，其中四个牛津杯加入不同饱和度盐沉淀蛋白100μL，另一杯加入20mmol/LTris-HCl(pH7.5)100μL作为对照。28℃培养72h，观察抑菌效果。1.4.7菌株C1对玉米种子的促生作用将菌株C1接种于200mL液体LB培养基中，37℃170rpm摇床培养72h。8000rpm离心15min，取沉淀，加入200mL无菌水混匀。配制得C1菌悬液。取重量相近的玉米种子60粒，均分到6个铺有无菌滤纸的培养皿中，其中3为个实验组，3个为对照组。在3组实验组培养皿内各加入600μLC1菌悬液，另外3组对照组内各加入600μL无菌水作为对照，都置于28℃恒温生化培养箱中培养48h。培养结束后，取出观察玉米长势，实验组和对照组随机选出10粒玉米种子，分别称量玉米种子根的总质量、茎的总质量和种子总质量，玉米根的长度、茎的长度。记录实验结果。1.4.8菌株C1分泌植物生长素测定挑取菌株C1的单菌落分别接种到含有L-色氨酸(100mg/L)的LB液体培养基中，37℃、180rpm的条件下摇床培养24h。分别取2mL菌悬液于小试管中，加入等量的Salkowski比色液；以2mL无菌水加入等量的比色液为对照，将小试管室温避光放置30min后观察其颜色变化，若溶液颜色变红，说明此菌可以分泌生长素，颜色越深表示此菌分泌生长素的能力越强。若颜色无变化，则表明该菌不能分泌生长素。2结果与分析2.1供试菌拮抗真菌病原菌性能测定平板对峙法培养结果显示：C1对5株病原菌都具有抑制作用，见图1，抑菌率在38.63％～58.9％之间(表1)，且对禾谷镰刀菌的抑制作用最好(抑制率为58.9％)，即C1具有广谱抑菌活性。表1病原菌串珠镰刀菌禾谷镰刀菌瓜类炭疽病菌尖孢镰刀菌玉米弯孢菌抑制率(％)4558.940.8338.6356.432.2菌株C1的鉴定菌株C1短杆状，0.5～1.7×1.6～4.3μm；革兰氏染色呈紫色(见图2)，属于革兰氏阳性菌；菌落乳白色、圆形、较湿润、边缘较规则(见图3)。将菌株C1进行生理生化特性检测，结果见表2、表3。表2表3提取菌株C1基因组，以该基因组为模板，采用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，将PCR产物进行测序，其大小为1,422bp，所得序列已提交至Genebank；并将测得的序列通过BLASTN软件进行比对，比对结果显示菌株C1属于芽孢杆菌属(Bacillus)，与甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)CBMB205基因序列EU194897的同源性高达99.93％，并在系统发育树中C1与甲基营养芽孢杆菌EU194897聚在一起(图4)，表明菌株C1是甲基营养芽孢杆菌。2.3不同培养条件对菌株C1的影响2.3.1温度对菌株C1的影响如图5所示，C1在25℃～46℃温度范围内生长明显，在39℃时生长最好。2.3.2pH值对菌株C1的影响如图6所示，在pH值4～9范围内，菌株C1在pH值为7时生长最好。2.3.3装液量对菌株C1的影响装液量明显影响菌株C1的生长(图7)，当装液量为25mL时菌体生长最好，并且菌体的生长量随装液量的增加呈下降趋势。2.4菌株C1生长曲线的测定菌株C1接种后摇床培养，0～4h处于延滞期，4～14h处于指数期，14～16h处于稳定期，随后菌体生长进入了衰亡期(图8)。2.5脂肽类物质的提取及抗禾谷镰刀菌活性的检测牛津杯法检测甲醇提取保存的脂肽类物质抗禾谷镰刀菌活性。结果如图9所示，没有抑菌圈的形成，C1菌中的脂肽类物质对禾谷镰刀菌没有抑制作用。2.6蛋白质的提取及抗禾谷镰刀菌活性的检测利用分级饱和的硫酸铵(0～30％、30％～50％、50％～80％和80％～100％)从C1发酵上清液中提取得到1、2、3、4四种蛋白质。牛津杯法，将四种蛋白质分别加入杯中，置于涂有禾谷镰刀菌孢子的PDA平板上，28℃培养48h，取出观察。由图10可见添加的蛋白1、2、3对禾谷镰刀菌具有明显的抑制作用，且抑菌圈直径分别为1.4cm、1.1cm、1.7cm，而蛋白4对禾谷镰刀菌无抑制作用。2.7菌株C1对玉米种子的促生作用将实验组与对照组玉米种子28℃培养48h，取出测定、称量。由图11可见，含有C1菌培养的实验组玉米长势比仅用无菌水培养的对照组好，测量相关数据(表4)。由表2可见：实验组的根、茎都明显比对照组长，分别是对照组的3.15倍、3.05倍；实验组的根、茎、种子重量也明显比对照组的重，分别是对照组5.02倍、4.33倍、1.4倍。因此，菌株C1具有明显的促生作用。表4玉米种子平均茎长(cm)平均根长(cm)根的质量(g)茎的质量(g)种子总质量(g)对照组1.992.690.0650.3634.908实验组6.088.260.9752.0147.3452.8菌株C1分泌植物生长素的定性测定由图12可见，实验组C1与对照组无菌水进行比较，含菌株的实验组呈浅红色，表明菌株C1仅产生少量的生长素。综上所述，本发明获得了1株菌株C1，即本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)C1，保藏号为GDMCCNo.60046，对玉米弯饱菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌和瓜类炭疽菌都具有抑制作用，具有广谱抑菌活性。综合菌株C1的形态学特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析，确定菌株C1为甲基营养芽孢杆菌。当PDA培养基pH值为7、装液量为25mL/250mL三角瓶、39℃培养时菌株C1生长最好；生长曲线测定的结果表明菌株C1在4～14h处于指数期，稳定期较短(14～16h)。菌株C1不产生对禾谷镰刀菌具有抑制作用的脂肽类物质，但产生对对禾谷镰刀菌具有抑制作用的蛋白质；并且，菌株C1对玉米的生长具有促进作用，与对照相比，实验组玉米的根长、茎长分别是对照组的3.15倍、3.05倍，根、茎、种子重量分别是对照组的5.02倍、4.33倍、1.4倍。但是，菌株C1仅产生少量的生长素。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页1 2 3