一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒。所述含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒由产碱菌Alcaligenes?sp.的菌液经过提取与纯化得到的。向加入苯并[a]芘及基础培养基、微量金属液和维生素c溶液的玻璃瓶内接种产碱菌Alcaligenes?sp.，培养20天后得到菌液，对菌液经过提取与纯化得了到含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒。本发明得到的含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒可以构建对苯并[a]芘具有降解功能的菌株，提高以苯并[a]芘为代表的多环芳烃污染物的生物降解效果，对于多环芳烃苯并[a]芘污染土壤及水体有应用潜力。
【专利说明】一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物学与分子生物学【技术领域】，具体涉及一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒。
【背景技术】
[0002]多环芳经(PolycyclicAromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环的有毒有机污染物，具有强烈的致癌作用、致畸作用和致突变作用。PAHs能通过生物累积及食物链的传递作用对生态环境和人体健康造成极大危害，已引起各国环境科学家的高度重视。对环境中多环芳烃的治理技术主要有物理法、化学法和生物法，其中生物法具有操作简单、运行费用低、无二次污染等优点。一般来说，随着多环芳烃苯环数量的增加，其降解速率降低。低分子量的多环芳烃在环境中能较快被降解，在环境中存在的时间较短，而高分子量的多环芳烃，例如芘、荧蒽、苯并[a]花、苯并[a]蒽、茚并[l，2，3_cd]花、苯并[b]荧蒽及苯并[k]荧蒽等则难于降解，较长期存在于环境中。因此，构建多环芳烃高效降解菌来强化降解已成为去除多环芳烃污染的一种重要方法。
[0003]多环芳烃降解质粒是细胞内能够自我复制的双链环状的小分子DNA，能降解芳香族化合物的代谢酶通常是由降解质粒基因编码的。因此，多环芳烃降解质粒上携带了部分的降解基因信息，可通过转化作用连接到宿主细菌中构成重组菌，从而使重组菌表现相应的降解多环芳烃的性能。从多环芳烃降解菌株中提取与纯化得到多环芳烃降解质粒对于构建新的多环芳烃高效降解菌以及提高多环芳烃的降解性能都具有重要的意义。但是，国内外缺少关于多环芳烃降解质粒方面的研究报道。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种 含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒。所述含有能够降解苯并[a]花基因的降解质粒由产碱菌Alcaligenes sp.的菌液经过提取与纯化得到的。提取与纯化含有能够降解苯并[a]花基因的降解质粒所用的产碱菌Alcaligenes sp.在2010年3月I日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心位于北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC N0.3638。从产碱菌Alcaligenes sp.中提取与纯化含有能够降解苯并[a]花基因的降解质粒的具体方案为:
[0005](I)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为=NH4NO3:1.7g.L—1，KH2PO4:1.0g.?ΛΚ.2HP04:1.0g.L—1，MgCl2:0.30g.?Λ CaCl2.2H20:0.15g.L-1 ;微量金属液的组成为:CoCl2.6H20:55mg.?Λ CuCl2:0.35mg.?Λ H3BO3:11.0mg.?Λ MnCl2.4Η20:45mg.L \ Na2MoO4.2Η20:5.5mg.L1, NiCl2.2Η20:4.5mg.L1, ZnCl2:4.5mg.L 1 ；
[0006](2)在超净工作台中向体积为IOOmL的锥形瓶中加入6.0mL浓度为lg/L的苯并[a]芘丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天；
[0007](3)向步骤(2)中的锥形瓶内加入60mL按步骤(I)配制的液体培养基；[0008](4)在超净工作台中挑取产碱菌Alcaligenes sp.,将其接种至步骤(3)中的锥形瓶中，在温度为25-30°C、转速为100r/min的振荡器中培养20-22天；
[0009](5)将步骤(4)中的菌液转移到容积为15mL的离心管中，在10000r/min条件下离心10min,弃去上清液；
[0010](6)向步骤(5)中的离心管中加入IOmL pH值为9.0浓度为0.08M的NaH2PO4缓冲液，旋润振荡5min后再进行超声波振荡15min,在10000r/min条件下离心IOmin,弃去上清液分离出菌体；
[0011](7)向由步骤(6)的离心管中加入7mL溶液A，然后混匀；溶液A的组成为:50mL0.45M三羟基甲基氨基甲烷_HCl，20mL0.25M EDTA, 20mL0.9M KCl，IOmL百分比浓度为
2.0%的氯化十六烷基三甲胺，pH8.2 ;然后加入2.2mg N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，在O-4°C条件下振荡IOmin后加入1.5mL浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在55?条件下水浴振荡Ih,在10000r/min条件下离心IOmin,收集上清液；
[0012](8)向由步骤(7)得到的上清液中加入ImL浓度为5.5M的醋酸钾和0.5mL异丙醇，在O-4°C条件下振荡15min,在10000r/min条件下离心IOmin,收集上清液；
[0013](9)将由步骤(8)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中，在10000r/min条件下离心lOmin，倒去离心管中的液体；重复这一过程，直至所有由步骤(8)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化；
[0014](10)向经步骤(9)处理后的离心纯化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的组成为:5mL4.5M盐酸胍，10mL3.5M醋酸钾与85mL无水乙醇，pH7.0 ;在O-4°C条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心5min,倒去离心管中的液体；
[0015](11)向经步骤(10)处理后的离心纯化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的组成为:40mL10mM三羟基甲基氨基甲烷-HCl，30mL3.0M NaCl,30mLl.5mM EDTA,pH8.5 ;在55°0条件下振荡20min,在10000r/min条件下离心5min ;将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min条件下离心5min ;离心管中液体即为含有
能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒溶液，在_20°C保存备用。
[0016]本发明得到的含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒可以构建对苯并[a]芘具有降解功能的菌株，提高以苯并[a]芘为代表的多环芳烃污染物的生物降解效果，对于多环芳烃苯并[a]芘污染土壤及水体有应用潜力。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实例进一步说明本发明。
[0018]材料:
[0019](1)产碱菌Alcaligenes sp.,该菌株在2010年3月I日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心位于北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC N0.3638。
[0020](2)大肠杆菌BL21感受态细胞(天津博美科生物技术有限公司)。
[0021](3)苯并[a]花(纯度> 99%, Sigma Aldrich)。
[0022](4)丙酮、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、异丙醇。
[0023](5) pH值为9.0浓度为0.08M的NaH2PO4缓冲液。[0024](6)浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液。
[0025](7)浓度为5.5M的醋酸钾溶液。
[0026](8)溶液AlOOmL，其组成为:50mL0.45M三羟基甲基氨基甲烷-HCl，20mL0.25MEDTA, 20mL0.9M KCl，IOmL百分比浓度为2.0 %的氯化十六烷基三甲胺，pH8.2。[0027](9溶液BlOOmL，其组成为:5mL4.5M盐酸胍，10mL3.5M醋酸钾与85mL无水乙醇，ρΗ7.0。
[0028](10)溶液ClOOmL，其组成为:40mL10mM三羟基甲基氨基甲烷-HCl，30mL3.0MNaCl，30mLl.5mM EDTA,pH8.5。
[0029](I I)基础培养基1L，其组成及各组分的浓度为=NH4NO3:1.7g.L-1，KH2PO4:1.0g.ΙΛ K.2HP04:1.0g.ΙΛ MgCl2:0.30g.ΙΛ CaCl2.2Η20:0.15g.L'
[0030](12)微量金属液1L，其组成及各组分的浓度为=CoCl2.6H20:55mg.L-1，CuCl2:0.35mg.L \ H3BO3:11.0mg.L \ MnCl2.4H20:45mg.L \ Na2MoO4.2H20:5.5mg.L \NiCl2.2H20:4.5mg.L S ZnCl2:4.5mg.L10
[0031]实施例[0032]向已加入苯并[a]芘及基础培养基、微量金属液和维生素c溶液的玻璃瓶内接种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的产碱菌Alcaligenes sp.,然后将培养瓶在培养温度为25-28°C、转速为100r/min的振荡器中培养20d，得到扩增培养后的菌液。将菌液在10000r/min条件下离心IOmin,向分离的菌体中加入IOmL pH值为9.0浓度为0.08M的NaH2PO4缓冲液，旋涡振荡5min后再进行超声波振荡15min，在10000r/min条件下离心IOmin,弃去上清液后加入7mL溶液A并混合均勻。然后加入2.2mg N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，在O-4°C条件下振荡IOmin后加入1.5mL浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液，旋润振荡5min后在55°C条件下水浴振荡Ih,在10000r/min条件下离心IOmin,收集上清液。然后向收集到的上清液中加入ImL浓度为5.5M的醋酸钾和0.5mL异丙醇，在O-4°C条件下振荡15min,在10000r/min条件下离心IOmin,收集上清液。将收集到的上清液加入到离心纯化柱中，然后在10000r/min条件下离心lOmin，倒去离心管中的液体。重复这一过程,直至所有的上清液都经过离心纯化柱纯化。向离心纯化柱中加入
0.5mL溶液B，在10000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体。然后向离心纯化柱中加入0.6mL溶液C,在55°C条件下振荡20min,在10000r/min条件下离心5min。将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min条件下离心5min。离心管中液体即为含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒溶液，在_20°C保存备用。
[0033]运用电转化的方法将含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒转入到大肠杆菌BL21中，得到的重组菌能够在以苯并[a]芘为唯一碳源的无机盐培养基中生长，且对苯并[a]芘具有降解功能，运用得到的重组菌对初始浓度为0.09mg/L的苯并[a]芘溶液进行降解试验，结果表明7天后苯并[a]芘的去除率达到84.1 %。
[0034]通过导入质粒的方法创造新菌株，获得高效的降解能力。
[0035]目的基因产物的保护通过方法进行保护。具体的氨基酸序列保护。
[0036]目的基因表达的载体
[0037]用电转化法将菌株ZL5的质粒导入[0038]大肠杆菌BL21感受态细胞
[0039]接合子Pseudom onas.stu tzeri能利用邻氯硝基苯为唯一碳源、氮源与能源,表明该质粒为降解质粒。
【权利要求】
1.一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒，其特征在于，该降解质粒由产碱菌Alcaligenes sp.的菌液经过提取与纯化得到的,产碱菌Alcaligenes sp.的菌种保藏号为CGMCCN0.3638，其中，从产碱菌Alcaligenes sp.中提取与纯化含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒的具体方案为: (1)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为=NH4NO3:1.7g.L—1，KH2PO4:1.0g.?ΛΚ.2HP04:1.0g.L—1，MgCl2:0.30g.?Λ CaCl2.2H20:0.15g.L-1 ;微量金属液的组成为:CoCl2.6H20:55mg.?Λ CuCl2:0.35mg.?Λ H3BO3:11.0mg.?Λ MnCl2.4Η20:45mg.L \ Na2MoO4.2Η20:5.5mg.L1, NiCl2.2Η20:4.5mg.L1, ZnCl2:4.5mg.L 1 ； (2)在超净工作台中向体积为IOOmL的锥形瓶中加入6.0mL浓度为lg/L的苯并[a]花丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天； (3)向步骤(2)中的锥形瓶内加入60mL按步骤(I)配制的液体培养基； (4)在超净工作台中挑取产 碱菌Alcaligenessp.,将其接种至步骤(3)中的锥形瓶中，在温度为25-30°C、转速为100r/min的振荡器中培养20-22天； (5)将步骤(4)中的菌液转移到容积为15mL的离心管中，在10000r/min条件下离心IOmin,弃去上清液； (6)向步骤(5)中的离心管中加入IOmLpH值为9.0浓度为0.08M的NaH2PO4缓冲液，旋润振荡5min后再进行超声波振荡15min,在10000r/min条件下离心IOmin,弃去上清液分离出菌体； (7)向由步骤(6)的离心管中加入7mL溶液A，然后混匀；溶液A的组成为:50mL0.45M三羟基甲基氨基甲烷-HCl，20mL0.25M EDTA, 20mL0.9M KCl，IOmL百分比浓度为2.0%的氯化十六烷基三甲胺，PH8.2 ;然后加入2.2mgN-乙酰胞壁质聚糖水解酶，在O-4°C条件下振荡IOmin后加入1.5mL浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在55°C条件下水浴振荡Ih,在10000r/min条件下离心IOmin,收集上清液； (8)向由步骤(7)得到的上清液中加入ImL浓度为5.5M的醋酸钾和0.5mL异丙醇，在O-4°C条件下振荡15min,在10000r/min条件下离心IOmin,收集上清液； (9)将由步骤(8)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中，在10000r/min条件下离心lOmin，倒去离心管中的液体；重复这一过程，直至所有由步骤(8)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化； (10)向经步骤(9)处理后的离心纯化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的组成为:5mL4.5M盐酸胍，10mL3.5M醋酸钾与85mL无水乙醇，pH7.0 ;在O-4°C条件下振荡15min，在IOOOOr/min条件下离心5min,倒去离心管中的液体； (11)向经步骤(10)处理后的离心纯化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的组成为:40mL10mM 三羟基甲基氨基甲烷-HCl，30mL3.0M NaCl,30mLl.5mM EDTA,pH8.5 ;在55°0条件下振荡20min,在10000r/min条件下离心5min ;将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min条件下离心5min ;离心管中液体即为含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒溶液，在_20°C保存备用。
【文档编号】C12N15/10GK103451178SQ201310159883
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2013年4月26日
【发明者】豆俊峰, 秦伟, 王营营, 丁爱中, 杜勇超 申请人:北京师范大学