玉米花药特异性启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种玉米花药特异性启动子及其应 用。
【背景技术】
[0002] 高等植物花的结构主要包括：花托、子房、胚珠、萼片、花丝、花瓣、花药、和花柱等。 花药是花丝顶端膨大呈囊状的部分，是雄蕊的重要组成部分，是种子植物的微小孢子堆，成 熟的花药粒实为其小配子体，能产生配子。花药内有花粉囊，其内有花粉粒，花粉粒成熟即 可进行传粉，受精，进而形成新的个体。高等植物发育过程花器官的形成是一个十分复杂的 过程，它包括一系列器官分化及严格控制的细胞及生化变化，同时伴随大量基因的协同表 达。启动子是重要的顺式作用元件，调控基因的转录和表达，根据启动子的转录模式不同将 其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。选择何种启动子来驱动基因的表达，是当 前基因工程研宄的热点。
[0003] 组织特异性启动子亦称器官特异性启动子，在这类启动子的驱动下，基因的表达 往往只限定某些特定的器官和和组织部位，并表现发育调节等特性。组织特异性启动子不 仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避 免植物营养的不必要浪费。
[0004] 花药特异性启动子，可用于外源基因在花药中的特异表达，从而避免该外源基因 在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物花药生长发育相关基因的 功能分析和鉴定；也可以用于花粉败育实验中，从而避免由转基因漂移或花粉逃逸所带来 的生物安全问题，对植物雄性不育系和恢复系的创造具有重要意义。
[0005]目前，缺乏一种能够控制目的基因特异性表达的玉米花药特异性启动子及其应 用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供了能够控制目的基因特异性表达的玉米花药 特异性启动子及其应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明提供了一种玉米花药 特异性表达启动子，其具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。
[0008] 本发明所述的启动子用于在水稻花药中特异性表达目的基因的用途。
[0009] 本发明含所述的玉米花药特异性表达启动子的植物表达载体。
[0010] 进一步地，所述植物表达载体是用所述玉米花药特异性表达启动子取代植物双元 表达载体PCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的植物表达载体。
[0011] 本发明所述的启动子或所述的植物表达载体在制备转基因植物中的应用。
[0012] 进一步地，所述转基因植物为转基因水稻。
[0013] 本发明包含所述的启动子、所述的植物表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞 为根癌农杆菌宿主细胞。
[0014] 本发明一种转基因植物的制备方法，包括：
[0015] (a)将权利要求1所述的启动子、或权利要求3所述的植物表达载体导入植物细 胞，
[0016] (b)在促进植物生长的条件下培养所述植物细胞。
[0017] 进一步地，所述植物细胞为水稻组织细胞。
[0018] 有益效果：本发明能在转基因水稻的花药中特异性表达，该启动子能够控制目的 基因特异表达于花药，用于外源基因在花药中的特异表达，在其他器官组织中不表达，从而 避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，如：转基因漂移；花粉逃 逸所带来的生物安全问题。本发明与现有技术相比，具有如下优点：
[0019] (1)本发明的玉米花药特异性表达启动子为PZmC2H2,其来源于玉米属玉米Zea maysL.B73自交系，该启动子片段大小为2267bp，所述的启动子具有以下特点（a)位于 GRMZM2G359589基因的5'端及其上游；(b)碱基长度为2267bp;(c)具有引发转录的必要位 点及转录起始点；（d)在玉米的花药中特异性表达。
[0020] (2)本发明的花药特异表达启动子PZmC2H2的重组表达载体，可以用作花药特异 表达基因的启动子，在重组表达载体的花药特异表达启动子PZmC2H2调控下使下游基因定 位于花药表达，为植物基因工程领域研宄基因在花药特异表达提供了工具，具有广泛的应 用前景；本发明的一种花药特异性表达的载体，转入了花药特异性表达的启动子，并在水稻 中进行验证。利用前述的玉米花药特异性表达启动子取代植物表达载体PCAMBIA1301上的 CaMV35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为pCAM-PZmC2H2。
[0021] (3)通过农杆菌介导法转化水稻，获得了 14株转基因植株，PCR检测有8株阳性 株。并对阳性植株的的不同组织部位都进行了⑶S组织化学染色。⑶S组织化学染色鉴定 证实PZmC2H2启动子为花药特异性表达启动子，pCAM-PZmC2H2为一种花特异性表达的载 体。
【附图说明】
[0022] 图lPZmC2H2启动子分子检测结果图；
[0023] 图2为本发明的表达载体PZmC2H2的T-DNA区图谱；
[0024] 图3为本发明的⑶S基因的组织化学染色结果图；
[0025] 其中：1幼叶；2幼茎；3幼根；4成熟叶；5成熟茎；6成熟根；7颖壳；8花药；9胚 乳。
【具体实施方式】
[0026] 本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明 目的，而不用于限制本发明范围。
[0027] 如图1至图3所示，图1为PZmC2H2启动子分子检测结果图。A为PCR结果；B为 双酶切结果。M:DL-50001:条带大小为2267bp2 和Bglll双酶切条带
[0028] 图2为本发明的表达载体PZmC2H2的T-DNA区图谱；LB和RB分别表示为T-DNA的 左边界和右边界；Hyg表不潮霉素抗性基因；Mcs表不多克隆位点；Nos表不基因的终止子； BamHI和Bglll分别表示限制性内切酶BamHI和Bglll的酶切位点；
[0029] 图3为本发明的⑶S基因的组织化学染色结果图；其中：1幼叶；2幼茎；3幼根；4 成熟叶；5成熟茎；6成熟根；7颖壳；8花药；9胚乳。
[0030] 本发明提供了一种玉米花药特异性表达启动子，其具有SEQIDNO. 1所示的核苷 酸序列。
[0031] 本发明所述的启动子用于在水稻花药中特异性表达目的基因的用途。
[0032] 本发明含所述的玉米花药特异性表达启动子的植物表达载体。
[0033] 所述植物表达载体是用所述玉米花药特异性表达启动子取代植物双元表达载体 PCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的植物表达载体。
[0034] 本发明所述的启动子或所述的植物表达载体在制备转基因植物中的应用。
[0035] 所述转基因植物为转基因水稻。
[0036] 本发明包含所述的启动子、所述的植物表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞 为根癌农杆菌宿主细胞。
[0037] 本发明一种转基因植物的制备方法，包括：
[0038] (a)将权利要求1所述的启动子、或权利要求3所述的植物表达载体导入植物细 胞，
[0039] (b)在促进植物生长的条件下培养所述植物细胞。
[0040] 所述植物细胞为水稻组织细胞。
[0041] 所用引物均由深圳华大生物工程有限公司合成，上海生工公司测序；pTEAY-Tl、 Taq酶、Trans5a感受态及相关的试剂盒购置北京全式金公司；限制性内切酶BamHI和 Bglll,T4连接酶购自TaKaRa公司；相应的抗生素来自上海生工和SIGMA公司；其余试剂均 为国产分析纯。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0042] 实施例1
[0043] 玉米花药特异性启动子PZmC2H2的克隆
[0044] 根据NCBI网站上公布的PZmC2H2启动子全长序列，设计PCR扩增该片段的引物， 上游引物加BamHI的CGGGATCC酶切位点，下游引物加Bglll的GAAGATCT酶切位点。
[0045] 引物序列如下：
[0046] 引物 1(上游引物）：5'-CGGGATCCTACATGGTTCGCATTCGGTT-3?
[0047] 引物 2(下游引物）：5'-GAAGATCTCATCTTCGTGGAGATGAGAG-3'
[0048] 以全式金公司植物基因组试剂盒提取的玉米B73基因组DNA为模板，用上游引物 和下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示：
[0049] 表 1
[0050]
【主权项】
1. 一种玉米花药特异性表达启动子，其特征在于其具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序 列。
2. 权利要求1所述的启动子用于在水稻花药中特异性表达目的基因的用途。
3. 包含如权利要求1所述的玉米花药特异性表达启动子的植物表达载体。
4. 根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是用所述玉 米花药特异性表达启动子取代植物双元表达载体PCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建 得到的植物表达载体。
5. 权利要求1所述的启动子或权利要求3所述的植物表达载体在制备转基因植物中的 应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，所述转基因植物为转基因水稻。
7. 包含权利要求1所述的启动子、权利要求3或4所述的植物表达载体的宿主细胞，其 中所述宿主细胞为根癌农杆菌宿主细胞。
8. -种转基因植物的制备方法，包括： (a) 将权利要求1所述的启动子、或权利要求3所述的植物表达载体导入植物细胞， (b) 在促进植物生长的条件下培养所述植物细胞。
9. 根据权利要求8所述转基因植物的制备方法，其特征在于：所述植物细胞为水稻组 织细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种玉米花药特异性表达启动子，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明所述的启动子用于在水稻花药中特异性表达目的基因的用途。本发明包含所述的玉米花药特异性表达启动子的植物表达载体。所述植物表达载体是用所述玉米花药特异性表达启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建得到的植物表达载体。本发明能在转基因水稻的花药中特异性表达，该启动子能够控制目的基因特异表达于花药，用于外源基因在花药中的特异表达，在其他器官组织中不表达，从而避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响。
【IPC分类】C12N15-84, A01H5-00, C12N1-21, C12N15-113
【公开号】CN104711262
【申请号】CN201510172508
【发明人】项艳, 吴敏, 董庆, 吴胜男, 江海洋, 蔡荣号, 杨建平
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年4月13日