织中的表达活性，从而间接证明了其在棉纤维细胞次生壁发育中的功能表达。
[0015] 2.GhDUF231Ll蛋白定位于细胞膜上，表明该蛋白极有可能参与到细胞壁的建成及 修饰过程中。
[0016] 3.在拟南芥中过量表达GhDUF231Ll基因，导致转基因植株生长加快，株高增加， 细胞壁纤维素含量升高，次生细胞壁中单糖组分含量发生改变。这表明GhDUF231Ll参与调 控植物次生细胞壁的建成，可能在棉纤维细胞次生壁合成过程中发挥重要调控功能。
【附图说明】：
[0017] 图1实时定量RT-PCR分析GhDUF231Ll在棉花组织及不同发育阶段的纤维中的表 达。
[0018] 图2GhDUF231Ll启动子及其顺式作用元件的表达活性分析。A-F，GhDUF231Ll启 动子：⑶S转基因拟南芥的⑶S活性的组织化学染色分析。A.生长6天的转基因拟南芥小 苗；B.生长12天的转基因拟南芥小苗；C.生长6周的转基因拟南芥植株叶片；D.生长6周 的转基因拟南芥植株的茎；E.生长6周的转基因拟南芥植株的荚果；F.生长6周的转基因 拟南芥植株的花。G-K，转基因拟南芥茎横切切片的⑶S活性染色分析。G.GhDUF231Ll基 因启动子在拟南芥茎中的表达模式；H.GhDUF231Ll基因启动子区域所含顺式作用元件在 拟南芥茎中的表达模式；I.GhDUF231Ll基因启动子缺失其中一个顺式作用元件后在拟南 芥茎中的表达模式；J.GhDUF231Ll基因启动子缺失另外一个顺式作用元件后在拟南芥茎 中的表达模式；K.GhDUF231Ll基因启动子缺失两个顺式作用元件后在拟南芥茎中的表达 模式。
[0019]co,皮层；if，束间纤维；ph，韧皮部；ve，导管元件；pi，髓；NBS1和NBS2,两个 顺式作用元件；ANBS1，缺失第一个顺式作用元件；ANBS2,缺失第二个顺式作用元件； ANBS1NBS2,缺失两个顺式作用元件；5xNBS2, 5个NBS2顺式作用元件串联。
[0020] 图3GhDUF231Ll基因结构及其亚细胞定位分析。A.GhDUF231Ll基因结构图；B.暗 视野下GhDUF231Ll:eGFP融合蛋白在烟草叶片表皮细胞中的表达荧光；C.明视野下同一烟 草叶片表皮。图中箭头所指即为绿色荧光所在位置，即融合蛋白所在位置。
[0021] 图4过量表达GhDUF231Ll转基因拟南芥植株表型分析。
[0022] A.过量表达GhDUF231Ll转基因拟南芥在DNA水平上的PCR检测分析。 11&^1?^;-.阴性对照；11'，野生型 ；1-6,6个随机选取的过量表达611〇耶23111转基因 拟南芥植株株系。B.过量表达GhDUF231Ll转基因拟南芥在RNA水平上的RT-PCR检测分 析。WT，野生型；LI-L4,4个过量表达GhDUF231Ll转基因拟南芥株系；AtActin2,拟南芥 Actin2基因内参。C.过量表达GhDUF231Ll转基因拟南芥表型。WT，野生型；tbl3,拟南芥 TBL3突变体；2310EL3和2310EL4,两个过量表达GhDUF231Ll转基因拟南芥株系。
[0023] 图5过量表达GhDUF231Ll转基因拟南芥植株茎中纤维素含量分析。
[0024]A.纤维素含量的标准曲线；B.过量表达GhDUF231Ll转基因拟南芥茎中纤维素含 量分析。WT，野生型；tbl3,拟南芥TBL3突变体；LI-L4,4个不同的过量表达GhDUF231Ll 转基因拟南芥株系。
[0025] 图6.过量表达GhDUF231Ll转基因拟南芥茎中细胞壁单糖组分分析。
[0026] WT，野生型；tbl3,拟南芥TBL3突变体；DUF2310E，过量表达GhDUF231Ll转基因拟 南芥植株；星号表示统计分析证明与野生型相比，二者有显著差异（P〈〇. 05)。
【具体实施方式】：
[0027] 本发明通过以下附图和实施方式作进一步阐述，但不限制本发明的范围。
[0028] 一个棉花DUF231家族成员GhDUF231Ll基因全长序列的克隆鉴定和功能分析：
[0029] 1.GhDUF231Ll基因序列及其cDNA序列的分离鉴定
[0030] 利用生物信息学方法筛查棉花基因组公共数据库，分析鉴定了GhDUF231Ll基因 序列。提取棉花基因组DNA，设计特异引物GhDUF231L10E-up(CTITCTAGAATGAGCITTGCGGCAT CTCCT)和GhDUF231L10E-dn(CTTCTCGAGCTACAAATGTGCCAAAAATAITC)，利用PCR技术分离克 隆了GhDUF231Ll基因。提取了开花后20天（20DPA)的棉纤维RNA，反转录成cDNA，利用PCR 技术分离克隆了GhDUF231Ll的cDNA全长序列。分别对其进行DNA测序验证。GhDUF231Ll 基因DNA序列如SEQ.ID.No. 1所示，cDNA全长序列如SEQ.ID.No. 2所示。
[0031] 序列分析表明，该基因编码区（0RF)由5个外显子组成，其间插入了 4个内含子。 其中，第一个内含子长97bp，插入第146位氨基酸密码子内；第二个内含子长131bp，插入第 236位氨基酸密码子内；第三个内含子长94bp，插入第345位氨基酸密码子内；第四个内含 子长85bp，插入第429与430位氨基酸密码子之间。GhDUF231Ll基因结构图如图3A。
[0032]GhDUF231Ll的cDNA包含了一个1293bp的开放阅读框，编码一个含有430氨基酸 的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ.ID.No. 3所示。该蛋白的N端包含一个跨膜结构域和TBL 结构域，而C端则含有一个典型的DUF231结构域。通过同源进化分析发现，该蛋白与拟南 芥TBL3同源性较高。已有研宄表明，AtTBL3能够调控拟南芥果胶甲基酯化酶的活性，进而 影响次生细胞壁中纤维素的含量，这暗示GhDUF231Ll可能在棉纤维中发挥着类似的功能。
[0033] 2.定量RT-PCR分析GhDUF231Ll基因的表达
[0034] 提取棉花组织总RNA(按LiXB,CaiL,ChengNH,LiuJW, 2002.Molecular characterizationofthecottonGhTUBlgenethatpreferentiallyexpressedin fiber.PlantPhysiol. 130:666-674进行），采用实时荧光定量RT-PCR技术研宄基因 表达（按照LiXB，FanXP，WangXL,CaiL，YangWC，2005.TheCottonACTIN1gene isfunctionallyexpressedinfibersandparticipatesinfiberelongation. PlantCell17:859 - 875 进行）。首先，利用反转录酶（M-MLVRNaseFReverse Transcriptase，Promega)将棉花不同组织（包括根、下胚轴、子叶、花瓣、花药、开花 后2天、3天和10天的胚珠、开花后6天、9天、12天、15天、18天和20天的纤维）的总 RNA(2yg/样品）反转录成cDNA;然后，以cDNA为模板，用基因特异引物GhDUF231LlRT-u p(CAGCAGTTGCCTACCAAATAG)和GhDUF231LlRT-dn(ACCACACTCATCATCTCCTTG)和Real-time PCRMasterMix(T0Y0B0，Japan)进行定量PCR反应。棉花GhUBIl基因作为RT-PCR反 应的内标（引物序列分别为GhUBIRT-up:CTGAATCTTCGCTITCACGTTATC和GhUBIRT-dn: GGGATGCAAATCTTCGTGAAAAC)，目标基因每一个循环的扩增都被SYBR-Green荧光检测。每 个基因的表达水平相对值按公式Y=10AGt/3 57X100%计算（其中ACt=CtGhUB11 -CtGhDUF231Ll，3. 57是利用GhUBIl制备的标准曲线y= -0. 28x+9. 87中斜率的倒数，表示 基因表达相差10倍的PCR循环数）。重复3次，统计分析实验结果（见图1)。结果显示 GhDUF231Ll基因在开花后15 - 20天的棉纤维中优势高量表达，表明该基因可能参与棉纤 维细胞次生壁合成的调控过程。
[0035] 3.GhDUF231Ll基因启动子的分离克隆及表达活性分析
[0036] GhDUF231Ll基因启动子分离克隆按照基因组步移法（TakaraGenomeWalking Kit)进行。根据GhDUF231Ll基因的DNA序列，设计出退火温度较高，同向且特异的引物，以 及退火温度较低的兼并引物，以棉花基因组DNA为模板，进行不对称PCR反应。一般情况下，