专利名称：一株异戊酰螺旋霉素i组分高含量、高产量基因工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用调节基因技术构建获得抗生素单一组分高含量、高产量菌株。
背景技术：
必特螺旋霉素(原名生技霉素)[专利号ZL97104440. 6]是利用基因工程技术研 制的螺旋霉素衍生物。必特螺旋霉素对革兰氏阳性菌有较强的活性，尤其对肺炎链球菌、肺 炎支原体、衣原体活性强，对红霉素和内酰胺类抗生素耐药菌、流感杆菌、军团菌、产气 荚膜梭菌有抗菌活性；与同类药没有完全交叉耐药性。它有较高的亲脂性，口服吸收快，组 织渗透性强，分布广，体内维持时间长，有较好的抗生素后效应。目前已完成基因工程必特 螺旋霉素的三期临床试验研究，结果显示良好的疗效和安全性，目前正在申报国家一类新 药证书。临床研究已经证明，必特螺旋霉素是一个服用安全有效的抗生素，其疗效不亚于 目前公认最好的大环内酯类抗生素阿奇霉素。然而，其本身是多组分药物，尽管按照目前 建立的片剂生产工艺，可以得到产品组分比例可控、质量稳定的必特螺旋霉素，然而其对提 取、纯化工艺的控制要求比较高，质量检测过程也比较繁锁。同时为了提高其在临床的治 疗效率，有必要研制其注射剂，众所周注射剂药效迅速，适用于对危重病人或不宜口服的病 人。注射剂在质量控制方面要求更高。通常对于经发酵产生的多组分抗生素，按照化学药 品的质控方式很难控制其质量，而且工艺条件的细小变化均有可能导致物质基础的变化， 而这些质量上的变化较难通过终产品的质量标准加以控制，从而可能会引发不可预测的不 良反应。这就是至今尚无发酵产生的多组分注射剂问世的原因。必特螺旋霉素产生菌产生多组分是源于螺旋霉素的多组分。螺旋霉素是一个大环 内酯类抗生素，其主核是一个由16元环组成的内酯环，与普拉特内酯同质，含有三个糖分 子福洛糖胺、碳霉糖胺和碳霉糖，而必特螺旋霉素主组分是螺旋霉素碳霉糖4’位羟基被异 戊酰基酯化的衍生物。由于螺旋霉素产生菌中存在3-0酰基转移酶基因，因而使螺旋霉素 内酯环3位羟基可以进行乙酰化，形成螺旋霉素II组分和丙酰化，形成螺旋霉素III组分， 内酯环3位为羟基时为螺旋霉素I组分，所以必特螺旋霉素至少也含有异戊酰螺旋霉素I、 II、III三个组分。必特螺旋霉素主组分的化学结构如下福洛糖胺普拉特内酯碳霉糖胺碳霉糖必特螺旋霉素结构
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其中异戊酰螺旋·請IIIR =COCH2CH3R，= COCH2CH(CH3)2
异戊酰螺旋·請IIR =COCH3R，= COCH2CH(CH3)i
异戊酰螺旋·I素ιR =HR，= COCH2CH(CH3)已有研究表明，螺旋霉素的三种组分之间及异戊酰螺旋霉素的三种组分之间，其 抗菌活性无显著差异。为了减少菌种产生多种组分，本实验室利用基因重组技术，在必特 螺旋霉素产生菌WSJ-I中，通过阻断3-0酰基转移酶基因，构建了只产生异戊酰螺旋霉 素 I 组分的菌种 WSJ-2 [Chunyan Ma et al. CurrentMicrobiology, 2010, DOI 10. 1007/ S00284-010-9664-8]。但是，该菌种发酵单位很低，不利于进行规模化生产。本发明拟利用 调节基因acyB2，改造必特螺旋霉素产生菌，以提高异戊酰螺旋霉素I组分的含量及产量。已知来源于耐热链霉菌的异戊酰基转移酶基因ist与调节基因acyB2连锁，调节 基因的存在可以激活ist基因的表达，含有完整ist和acyB2调节基因的变铅青链霉菌可 以将67-79%泰洛菌素转化为4”异戊酰泰洛菌素，而仅含有单个ist或ist与不完整的 acyB2基因的变铅青链霉菌对泰洛菌素的转化率仅为0-2.4% [Arisawa A et al =Biosci Biotechnol Biochem 1993,57(12) :2020_2025]。将 ist 和 acyB2 基因转入泰洛菌素产生 菌(Str印tomyces fradiae)，其转化子经发酵可以产生4”异戊酰泰洛菌素[Arisawa A. et al J Antibiotics 1996,49 (4) :349_354]。acyB2调节基因与螺旋霉素产生菌(Str印tomyces ambofaciens)中的转录调控 蛋白 Srm28c 同源[Fatma Karray et al Microbiology 2007，153，4111-4122]，其一致性 (identity)为69%，与泰洛菌素产生菌(Str印tomyces fradiae)中的调控蛋白tylR的 一致性为41%，tylR为泰洛菌素产生菌生物合成正调控蛋白，它调控泰洛菌素中一个聚 酮合酶模块(tylGI)的表达，同时还对泰洛菌素糖基的合成和聚酮环的氧化起调控作用。 tylR基因在产生菌的高表达，可以提高泰洛菌素的产量[GeorgeS. etal Mol. Microbiology 2004，54(5) 1326-1334]。本实验室曾利用基因工程技术将ist基因进行串连，使ist基因在螺旋霉素产生 菌中增加其拷贝数，通过增强其基因剂量提高产生菌异戊酰基化能力；同时也利用强启动 活性的启动子如红霉素抗性基因ermE启动子序列，替换原ist基因启动子序列，以增强 ist基因的表达，使基因工程菌产生异戊酰螺旋霉素主组分含量提高了 62% [专利申请号 200910148767. 8]。本发明的目的，旨在利用调节基因acyB2激活ist基因表达的特点，将ist与调节 基因acyB2在螺旋霉素产生菌中共表达，以获得必特螺旋霉素单组分异戊酰螺旋霉素I的 高含量及高产量菌株。
发明内容
本发明提供了异戊酰螺旋霉素I组分高含量、高产量菌株。本发明还提供了异戊酰螺旋霉素I组分高含量、高产量菌株的构建与制备，具体 包括以下步骤1、构建含ist_acyB2双基因重组质粒pSET52_ia ；2、将重组质粒pSET52_ia转入异戊酰螺旋霉素I产生菌，转化子发酵经培养，微生
4物法检测产生菌发酵效价，并以HPLC定量分析异戊酰螺旋霉素I的含量；3、以含ist单基因异戊酰螺旋霉素I产生菌作为对照，比较acyB2基因引入其中 后发酵效价及产生异戊酰螺旋霉素I组分的比例，证明acyB2调节基因的引入能明显提高 菌种产生异戊酰螺旋霉素I组分的含量及产量。发明效果本发明的积极效果在于证明acyB2调节基因引入异戊酰螺旋霉素I产生菌，可以 提高产生菌发酵单位414%，提高异戊酰螺旋霉素组分I含量170. 2%，不仅有利于简化单 组份抗生素工业化生产的质量控制与检测标准，为注射剂型的制备创造了条件，而且可为 进一步提高临床治疗效果增添一种手段。
图1 ist_acyB2基因重组质粒pSET52_ia的构建图2含ist-acyB2基因重组质粒pSET52_ia菌种WSJ-IA发酵产生异戊酰螺旋霉 素I组分HPLC分析其中A WSJ-2为含单ist基因菌种对照；B WSJ-IA为含ist和调节基因acyB2的 基因工程菌实施方案以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。《实施例1》构建含ist_acyB2双基因重组质粒pSET52_ia从本实验室原先构建的重组质粒pSW4中[尚广东等，生物工程学1999，15(2) 171]，用SmaI-BamHI酶切，获得含ist完整基因和部分acyB2基因1820bp片段，以 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供的耐热链霉菌(Str印tomyces thermotolarences CGMCC4. 1501)总DNA为模板，根据NCBI公布的acyB2序列，设计引物 pi 5' -CGCTCAGGGACGCAAGACC-3‘禾ΠΡ2 :5’ -CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTC-3， (EcoRI)，通过 PCR 反应获得 acyB2部分基因1013bp片段，将PCR产物用BamHI-Ec0RI酶切，获得934bp片段，将上述 SmaI-BamHI (1820bp)、BamHI-EcoRI (934bp)片段连入 pBluesript II KS (+)载体(Merck 公司)的SmaI-EcoRI酶切位点，获得含ist和完整acyB2基因重组质粒pBKS_ia。通过 XbaI-EcoRI酶切位点连入大肠杆菌/链霉菌接合转移质粒pSET152 (来自基因酷共享资源 www. genecool. com)，获得ist_acyB2双基因重组质粒pSET52_ia。构建流程见图1。《实施例2》重组质粒pSET52_ia转化异戊酰螺旋霉素I产生菌异戊酰螺旋霉素I产生菌WSJ-2为本实验室构建，发表在[Chunyan Ma et al. Current Microbiology 2010，DOI 10. 1007/s00284-010-9664_8]。菌种在斜面培养基 [黄豆饼粉 2.0%，葡萄糖 1.0%，淀粉 3.0%，CaCO3 0. 5%, NaCl 0.4%，琼脂 2.0%]上 28 °C 培养 7-10 天，按照文献[D. A. Hopwood 等 Genetic manipulation ofStreptomyces, A Laboratory Manual, Norwich John Innes Foundation UK，1985]描述的方法制备原 生质体，具体来说是将菌种挖块接种至含蔗糖R2YE培养基[蔗糖10. 3 %，葡萄糖1.0%， 酵母提取液0. 4 %，胰蛋白胨0. 2 %，蛋白胨0. 4%，酪蛋白氨基酸0.4%，K2SO4 0. 025 %，
5CaCl2 0. 216%, KH2PO4 0. 005%, MgCl2 · 6H201. 012%，在 IOOml 培养基中加入 NaOH(lmol/ L)0.5ml，Tris-HCl (0. 25mol/LpH7. 2) 10ml，微量元素溶液[ZnCl2 0.04 %，FeCl3 · 6H20 0. 02%, CuCl2 0. 001%, MnCl · 4H20 0. 001%, Na2B4O7 · 10H20 0. 001%, (MM)6MO7O2 · 4H20 0. 0012% ]0· 2ml，28°C培养2-4天，以10%接种量转种上述培养基，并加入0. 5%甘氨酸， 培养20小时，离心收集菌丝，用10. 3 %蔗糖溶液洗涤2-3次，在含溶菌酶2mg/ml的P溶 液[Tris-HCl (pH8.0)lmol/L 0. 31ml，CaCl2 · 2H20 0. 368 %, MgCl2 ‘ 6Η20 0.204%，蔗糖 10. 3%，葡萄糖0. 1%，微量元素溶液0. 2ml]中37°C溶菌15-60分钟，经棉花过滤获得原生 质体。将重组质粒pSET52-ia在PEG介导下转入原生质体，并涂布于R2YE固体培养基，28°C 培养24小时后，用含阿泊拉霉素溶液覆盖培养物，使阿泊拉霉素在培养基中的终浓度为50 微克/毫升，继续培养7-10天挑取转化子。获得含重组质粒pSET52-ia异戊酰螺旋霉素I 产生菌，参椐的生物材料为WSJ-IA，于2010年6月25日送交中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC 3942， 分类命名为螺方宠霉素链霉菌Streptomyces spiramyceticus。《实施例3》WSJ-IA菌种发酵效价检测WSJ-IA菌种在上述斜面培养基28°C培养7_10天，挖块接种接种于种子培养基黄 豆饼粉 1. 5%，淀粉 3. 0%，NaCl 0. 4%,CaCO3 0. 5%，鱼蛋白胨 0. 3%，KH2PO4 0.05%。28°C 培养48小时，转入发酵培养基配方葡萄糖0.5%，淀粉6.0%，酵母粉0. 5 %，鱼粉2. 0 %， NH4NO3 0. 6%, NaCl 1. 0%, CaCO3 0. 5%, KH2PO4O. 05%, MgSO4 0.1% 28°C发酵培养 96 小 时。发酵液离心取上清液，用含3% NaCl的pH 7. 8 8. 0磷酸盐缓冲液进行稀释。采用芽 孢杆菌[CMCC(B) 63501]为检定菌，培养基[蛋白胨0. 6%，牛肉浸出粉0. 15%，酵母浸出膏 0. 6%，葡萄糖0. 2%，琼脂1. 5-2. 0% ]，按照中国药典2010版二部附录XI A所述标准曲线 方法，以乙酰螺旋霉素为标准品，计算发酵效价，WSJ-IA菌种发酵效价为1160微克/毫升， 见表一。《实施例4》WSJ-IA菌种发酵产生异戊酰螺旋霉素I组分的检测将上述发酵液调pH至8. 5，用等量乙酸乙酯提取，浓缩乙酸乙酯提取液至干，溶于 甲醇。采用Kromasil C18柱(4. 5mmX 150mm，5 μ m)；流动相甲醇磷酸二氢钠溶液(体 积比 53 47)；检测波长231nm;流速l.OmL .mirT1 ；柱温 25°C;进样量10-20 μ L。HPLC 检测以峰高法计算产物中异戊酰螺旋霉素I组分的含量，HPLC分析结果见图2Β，结果表明， WSJ-IA菌种发酵产生异戊酰螺旋霉素I总含量为12. 061%。《实施例5》调节基因提高菌种发酵效价和产生异戊酰螺旋霉素组分I含量检测WSJ-IA与含ist单基因的WSJ-2菌种对照，按实施例3进行发酵培养，微生物法 测定两个菌种发酵效价，乙酸乙酯提取产物并进行HPLC分析，结果见图2。比较两者产生 异戊酰螺旋霉素I组分的情况，分别计算两者产生异戊酰螺旋霉素I与螺旋霉素的比例，结 果显示，调节基因的引入提高WSJ-IA菌种发酵效价414%，产生异戊酰螺旋霉素I含量提高 170. 2%，相应地降低了螺旋霉素的产生，使异戊酰螺旋霉素I组分与螺旋霉素比例提高了 218% (表一)。本发明提供了一个含acyB2调节基因产生异戊酰螺旋霉素I的菌种，该菌种在一 定发酵条件下，比原来只含ist基因的菌种产生异戊酰螺旋霉素I组分含量提高了 1. 70 倍，发酵效价提高了 4. 14倍。
表一 .WSJ-IA与WSJ-2菌种性能比较
权利要求
一株异戊酰螺旋霉素I组分高含量、高产量基因工程菌，其特征是，所述基因工程菌是异戊酰基转移酶基因ist与acyB2调节基因连锁基因，在异戊酰螺旋霉素I产生菌中共表达的克隆菌株。
2.构建制备权利要求1所述基因工程菌的方法，其主要步骤包括A)构建含ist_acyB2双基因重组质粒pSET52_ia；B)将重组质粒pSET52-ia转入异戊酰螺旋霉素I产生菌，获得含重组质粒pSET52_ia 的异戊酰螺旋霉素I产生菌，命名为WSJ-IA，菌种保藏编号CGMCCNo3942 ；OffSJ-IA菌种发酵培养、提取；D)WSJ-IA菌种发酵液微生物法效价检测；E)HPLC定量分析WSJ-IA菌种发酵产物主组分异戊酰螺旋霉素I的含量。
全文摘要
本发明涉及利用调节基因技术构建获得抗生素单一组分高含量、高产量菌株，具体来讲，是将含有ist-acyB2双基因重组质粒pSET52-ia转入异戊酰螺旋霉素I产生菌，获得异戊酰螺旋霉素I组分高含量、高产量的基因工程菌株，为其工业化生产和制备注射剂型创造了良好条件。
文档编号C12R1/465GK101914482SQ20101023759
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者周红霞, 姜洋, 戴剑漉, 杨生武, 林灵, 武临专, 王以光, 赫卫清, 郝玉有, 马春燕 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所;沈阳同联集团有限公司