专利名称：鸭源性冠状病毒s1蛋白基因及其克隆方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种鸭源性冠状病毒ZZ2004的Sl蛋白基因 及其克隆方法与应用。
背景技术：
1937年，冠状病毒(Coronaviruses)首先从鸡身上分离出来。1965年，分离出第 一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其 形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。根据病毒的血清学特点和 核苷酸序列的差异，目前冠状病毒科分为冠状病毒和环曲病毒两个属。冠状病毒科的代表 株为禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。该病毒为有囊 膜、呈中等多形性球状或椭圆形的病毒粒子，表面有杆状突起。禽传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒科的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的 一种常见多发的急性高度接触性传染病，表现为呼吸型、肾型、肠型、腺胃型等多种病型。该 病可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低。IBV往往引起复合感 染，如新城疫(Newcastle Disease, ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可继发细菌性疾病，如 大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了对鸡群的危害。据《世界家禽》1999年资料，全世界 的禽病中，以呼吸系统疾病最为严重，其中IB是世界大多数地区危害养鸡业的主要疾病。 1988年以来，IB在我国大部分地区相继流行，疫区的发病率可达100%，死亡率可达10 30%。国内外已报道的IBV有26种以上血清型，因血清型及新变型众多，不同血清型之间 缺乏交叉保护，新的变异株不断出现和流行，是造成鸡群免疫失败的原因。这使得IB对养 鸡业造成的威胁持续存在。而掌握流行毒株的生物学特性和流行特点是正确使用疫苗的前 提。2004年5月，河南省郑州某养殖场发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB 疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100%，死亡率达 10%以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个 1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造成 大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落，腺胃乳头肿 大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”， 肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌 及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV 疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工 作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株，保 藏编号为CGMCC NO. 3842，其专利申请号为201010225577. 4，此为首次有关家鸭感染IBV的 报道。IBV粒子含有3种特异性蛋白，即核衣壳蛋白(N)，膜蛋白(M)和纤突蛋白(S) ；S 蛋白位于病毒粒子表面，由等摩尔的Sl和S2两个亚单位组成。S蛋白是IBV最重要的保护
3性抗原，可刺激机体产生中和抗体，在病毒吸附细胞过程中发挥作用，在血清学分类上起决 定性作用。Kochetal (1990)的研究证实IBV Sl蛋白上存在6个抗原决定簇，分别为A，B， C，D，E和F，其中Sl上A，B，C三个决定簇有部分重叠，而只有Sl的D产生的抗体同时具有 中和作用和血凝抑制作用；S蛋白变异很大，其中变异最突出的部位发生在Sl上，其中某些 氨基酸的改变将改变抗原决定簇的构象，导致新的变异株的产生；研究还表明，Sl蛋白与 宿主细胞膜粘附后，可诱导产生中和抗体及血凝抑制抗体，Sl还能诱导鸡的特异性CTL应 答；Sl蛋白的高变区(Hypervariable region,HVR)被认为与中和表位相关；IBV毒株的组 织亲和性及其毒力取决于Sl蛋白的N端。所以当前深入系统的研究IBV的Sl蛋白基因， 进而从分子水平上揭示IBV的流行和变异规律，对于研制开发有效基因工程亚单位蛋白疫 苗及防治IB的药物，进而预防和控制IB的发生与流行有着重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是对鸭源性冠状病毒ZZ2004中的Sl蛋白基因进行了分 析测序，给出了一种克隆该Sl蛋白基因的方法，并说明了其用途。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种鸭源性冠状病毒的Sl蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。一种鸭源性冠状病毒的Sl蛋白基因，其氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示。上述鸭源性冠状病毒的Sl蛋白基因的克隆方法，包括以下步骤 1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5 ‘ -GACTGAACAAAAGACCGACT-3 ‘为上游引 物，以 5 ‘ -GCCATCGCTCTTAGTAACAT-3 ‘为下游引物；以 5 ‘ -GGTGGCTCTCGTATACAAAC-3 ‘为 上游引物，以5 ‘ -GCAGTAATACCACCAAAAGC-3 ‘为下游引物；2)分别通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒ZZ2004株Sl蛋白基因全长片 段，PCR 的扩增条件 94°C，5min ；94°C lmin, 53°C lmin，72°C lmin，共 35 个循环，最后于 72°C 延伸10min，4°C结束反应；3)然后将Sl蛋白基因片段分别与pMDIS-T载体连接。上述鸭源性冠状病毒的Sl蛋白基因在制备IBV基因工程亚单位蛋白疫苗中的应 用，该Sl蛋白基因可被克隆到质粒载体或真核表达载体上进一步研制出IBV核酸疫苗及活 载体疫苗对预防IBV将具有重要意义。上述鸭源性冠状病毒的Sl蛋白基因在制备防治鸡传染性支气管炎药物中的应 用，该Sl蛋白基因一旦被导入植物，并在植物中表达出活性蛋白，有望研制出转基因植物 可食疫苗，作为禽类饲料添加剂，家禽食用含有该种抗原的转基因植物，将激发肠道免疫系 统，从而产生对IBV的免疫能力。上述鸭源性冠状病毒(Avianinfectious bronchitis virus，IBV)ZZ2004，已 于2010年4月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为 CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该鸭源性冠状病 毒的保藏编号为CGMCC NO. 3842，其中国专利申请号为201010225577. 4。本发明具有积极有益的效果研究表明，Sl蛋白与宿主细胞膜粘附后，可诱导产生中和抗体及血凝抑制抗体，Sl 还能诱导鸡的特异性CTL应答，Sl蛋白同时决定着IBV毒株的组织亲和性及其毒力。鉴于
4本病毒Sl基因变异突出的特点，同时本病毒的感染谱明显不同于其它毒株，所以深入系统 的研究IBV的Sl蛋白基因，进而从分子水平上揭示IBV的流行和变异机制，研制出IBV核 酸疫苗、活载体疫苗及防治鸡传染性支气管炎药物，对于预防和控制IB的发生与流行有着 重要的意义。
图1为鸭源性冠状病毒ZZ2004的Sl基因推导的氨基酸序列同源性比对图谱(说 明书附图第1、2页为一幅连续的图谱)；图2为鸭源性冠状病毒ZZ2004分离株与参考毒株Sl蛋白系统进化树；图3为鸭源性冠状病毒ZZ2004的Sl基因RT-PCR扩增结果，图中左为Pl引物扩 增产物，右为P2引物扩增产物。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护内容并不局限于下述具 体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 试验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。实施例1鸭源性冠状病毒ZZ2004的Sl基因的克隆方法(I)PCR引物设计设计二对特异性引物，序列如下Pl 上游弓丨物 5 ‘ -GACTGAACAAAAGACCGACT-3 '，下游引物 5 ‘ -GCCATCGCTCTTAGTAACAT-3 ‘ ；P2 上游引物 5 ‘ -GGTGGCTCTCGTATACAAAC-3 ‘，下游弓丨 物 5 ‘ -GCAGTAATACCACCAAAAGC-3‘。(2)ZZ2004株的浓缩方法取ZZ2004株感染的尿囊液用灭菌PBS作1 10稀释，取 0. 2ml接种于9日龄的SPF鸡胚绒毛尿囊腔内，37°C下孵化36 48h，置4°C 12h后收获鸡 胚尿囊液。分别取50ml ZZ2004株感染的SPF鸡胚尿囊液于灭菌的离心管3管，5000rpm离心 20min ；分别弃沉淀，取上清液于另一灭菌的离心管中，12000rpm离心20min ；分别弃沉淀， 取上清液加入50ml的超速离心管，不足的以灭菌PBS补足，40000rpm离心4小时；弃上清 液，取沉淀用Iml灭菌PBS悬浮后_20°C保存备用。(3) ZZ2004 株总 RNA 的提取用 DNA/RNA 提取试剂盒(MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver. 3. 0)提取RNA，参照试剂盒说明书进行。(4) ZZ2004株基因片段的RT-PCR扩增①反转录反应在0. 2ml Microtube管中配制下列混合液(表1)，同时设空白对照。表1模板RNA/弓丨物反应混合液
上述提取的Template RNA8 μ L
Total Volume
IOnL
在PCR仪上进行变性、退火反应65°C 5min，4°C保存。 离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底。 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液(表2)。 表2反转录反应液
4°C保存。
眧
在PCR仪上按下列反应条件进行反转录反应30°C 10min,42°C 30min,95°C 5min, ②PCR反应按下列组成在Microtube管中配制PCR反应液(表3)。同时设空白对 表3PCR反应液 瞬时离心后，置PCR仪上扩增。反应条件为94°C，5min ；94°C lmin，55°C lmin， 72°C lmin，共35个循环，最后于72°C延伸lOmin，反应产物-20°C保存。(5)基因片段回收从1. 0%琼脂糖凝胶切胶回收不同大小的扩增片段，按TaKaRa 公司提供的试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0)操作说明进行。
(6)连接将回收得到的DNA按如下体系(表4)与pMD18_T载体在16°C下连接 30min,同时用不连接外源基因的载体作对照。表4载体连接体系 (7)JM109感受态细胞的制备①从37°C培养16h的平板上挑取一个单菌落，接种到3ml LB培养基中，37°C下振 摇过夜，次日取菌液Iml接种于100ml LB (A-)培养基中，37°C下振摇2 3h，使0D600值达 到 0. 3 0. 4 ；②转入预冷的50ml离心管中，冰浴IOmin ；③4°C下以4000rpm离心lOmin，弃上清液；④将离心管倒置于滤纸上lmin，除尽残留的培养液；⑤加入预冷的0. lmol/L CaCl2 10ml，重悬菌体，冰浴30min ；⑥重复步骤③、④；⑦用预冷的0. lmol/L CaCl2 4ml，重悬菌体，(需用于-30°C较长期保存的含有 15%甘油的0. lmol/L CaCl2)，分装0. Iml/管，_80°C保存备用，随时使用时4°C保存备用。(8)转化将连接产物转化JM109感受态细胞，按TaKaRa公司生产的试剂盒说明操作。(9)阳性转化子的筛选与鉴定用无菌牙签挑取Amp+/LB琼脂平板上的单个转化菌落(白色菌落)，按菌落编号顺 序接种于含50ug/ml Amp+/LB液体培养基上；37°C下震荡培养12 16h，用质粒小量提取试剂盒提取质粒并采用测序用通用引 物进行鉴定；(10)质粒提取按宝生物生物工程(大连)有限公司生产的质粒提取试剂盒操作说 明进行。(11)采用通用引物PCR鉴定阳性克隆按下列组成在0. 2ml Microtube管中配制PCR反应液(表5)，同时设空白对照。表5PCR反应液 反应程序95°C，3min-MV lmin, 55°C, 30sec, 72°C 30sec，共 35 个循环，最后于 72°C延伸5min，4°C保存。反应产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。(12)测序使用ABI 377全自动测序仪(上海生工生物工程技术服务有限公司)以 通用引物对插入片段进行序列测定。Sl基因RT-PCR扩增结果见图3。实施例2S1基因推导的氨基酸序列同源性比对ZZ2004毒株Sl蛋白的氨基酸序列与6个参考毒株的同源率介于73. 7 % 85. 9 % 之间，其裂解位点的氨基酸序列为RRHRR，明显不同于其他参考毒株(RRF/SRR)；与经典毒 株Beaudette株比较其变异区域主要集中在3 26aa，53 57aa，62 81aa，88 136aa， 199 209aa，270 294aa，382 395aa，487 538aa等区域内，其它区域仍存在较多散在 的点突变；与同源率最高的SAIBK株比较，其变异区段主要集中在23 25aa，62 82aa， 89 131aa，175 202aa，455 538aa等区域，其它区域还有一些散在的点突变，而大多数 变异位于前4个区域内，即在前300个氨基酸残基内，这符合IBV Sl基因变异的特征，参见 图1。将ZZ2004株与代表性参考毒株的Sl蛋白的氨基酸序列进行遗传进化树的绘制 与分析，参见图2。结果表明分离株Sl蛋白与GD毒株属同一分支，与肾型毒株SAIBK、 SC021212毒株的亲缘关系较近，与呼吸型Beaudette、经典毒株M41、腺胃型毒株ZJ971及肾 型毒株Gray等的亲缘关系较远。
8
权利要求
一种鸭源性冠状病毒的S1蛋白基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
2.一种鸭源性冠状病毒的Sl蛋白基因，其特征在于，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示。
3.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的Sl蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括 以下步骤1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5'-GACTGAACAAAAGACCGACT-3‘为上游引物， 以 5 ‘ -GCCATCGCTCTTAGTAACAT-3 ‘为下游引物；以 5 ‘ -GGTGGCTCTCGTATACAAAC-3 ‘为上 游引物，以 5 ‘ -GCAGTAATACCACCAAAAGC-3 ‘为下游引物；2)分别通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒ZZ2004株Sl蛋白基因全长片段， PCR 的扩增条件 94°C，5min ;94°C lmin，53°C lmin，72°C lmin，共 35 个循环，最后于 72°C延 伸10min，4°C结束反应；3)然后将Sl蛋白基因片段分别与pMDlS-Τ载体连接。
4.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的Sl蛋白基因在制备IBV基因工程亚单位蛋 白疫苗中的应用。
5.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的Sl蛋白基因在制备防治鸡传染性支气管炎 药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种鸭源性冠状病毒S1蛋白基因。其具有SEQ ID No.5、6所示的基因序列；其克隆方法为选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5′-GACTGAACAAAAGACCGACT-3′为上游引物，以5′-GCCATCGCTCTTAGTAACAT-3′为下游引物；以5′-GGTGGCTCTCGTATACAAAC-3′为上游引物，以5′-GCAGTAATACCACCAAAAGC-3′为下游引物；RT-PCR扩增S1蛋白基因全长片段，再与pMD18-T载体连接。与同类冠状病毒相比，该病毒变异程度大、感染谱广，研究其S1蛋白基因结构，对于研制开发基因工程亚单位蛋白疫苗及防治药物，进而防控IB的发生与流行有着重要意义。
文档编号C12N15/10GK101914554SQ201010237670
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者刘兴友, 刘金华, 姚四新, 王丽荣, 王宪文, 王自良, 王青, 赵坤, 赵朴, 赵淑秋 申请人:河南科技学院