icallyCompetentCell购自北京全式金生物技术有限公司）。根 据载体上的氨苄青霉素抗性标记筛选阳性转化子，利用克隆载体检测引物（M13+: 5' -AGGGTTTTCCCAGTCACG-3'，如SEQIDNo. 4 所示，M13- :5' -GTGTGAAATTGTTATCCGCTC-3'， 如SEQIDNo. 5所示），按前述的PCR扩增方法和体系筛选阳性克隆，其PCR产物大小约 530bp，与HC-Pro基因片段长度基本一致。将阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，结果 与预期完全一致。
[0032] 实施例2VIGS载体（PTV00-HC-Pro重组载体）构建
[0033]病毒载体：烟草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus,TRV)，Ratciff等将其改造成 TRV的RNA1和RNA2cDNA的双元表达载体，通过进一步改造成PTV00和PBNTRA6,本实验亦 有保存。
[0034] 本发明中利用PTV00 -组酶切位点BamHI/Kpnl，将PCR扩增获得的HC-Pro基因片 段（480bp)连接到PTV00酶切位点中。将PTV00-HC-Pr〇质粒转化到大肠杆菌感受态细胞 中，扩大培养，提取质粒用于根癌农杆菌转化。酶切验证如图4,可结合参见图1。测序结果 显示序列构建位置正确。操作如下：
[0035] 步骤1.PTV00载体片段酶切与回收
[0036] 提取大肠杆菌中PTV00质粒（质粒DNA的小量提取试剂盒）。取25ul质粒，利用 BamHI和Kpnl内切酶，采用100ul酶切体系，37°C酶切45min，回收酶切产物中3K左右长度 的质粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光检测琼脂糖凝胶电泳分析判断回收片段的浓度。回 收片段标记为PTVOO-BamHI/Kpnl。
[0037] 步骤2.PVY-HC-Pro基因PCR片段酶切与回收
[0038] 分别纯化回收PCR产物得HC-Pro基因片段。各取25ul回收片段，利用Kpnl和 BamHI内切酶，采用100ul酶切体系，37。。酶切45min，回收酶切产物中对应序列长度的质粒 片段。取lul回收片段，进行凝胶电泳判断回收质量。HC-Pro回收片段标记为HC-Pro-Kpnl/ BamHI.
[0039] 步骤 3.PTVOO-BamHI/Kpnl和HC-Pro-KpnI/BamHI的连接与转化大肠杆菌
[0040] 取 5ulHC-Pro-KpnI/BamHI和 2ulPTVOO-BamHI/Kpnl以反应体系（10XT4 DNALigationBuffer4ul、T4DNALigase(lU/ul)2ul、酶切回收后PCR片段 10ul、载体 (50-400ng)4ul、无菌去离子水补足到20ul)分别进行接连，用PCR仪进行控温，16°C16h。
[0041] 将链接产物进入大肠杆菌感受态细胞，参照实施例1中的PCR扩增方法和反应体 系，于筛选平板加入50mg/L卡那霉素（Kan)为抗生素筛选阳性转化子，利用克隆载体检测 引物M13+/-检测转化子，选择PCR检测为阳性的转化菌，测序验证：得到重组载体，标记为 PTV00-HC-Pro。
[0042] 实施例3PTV00-HC-Pro重组载体转化农杆菌GV3101
[0043] 步骤1.根癌农杆菌感受态细胞制备
[0044] (1)挑选根癌农杆菌GV3101菌落，接种于含有50mg/L的利福平的液体LB培养基 中，28°C200rpm培养 16h。
[0045] (2)取500ulGV3101菌液至50ml液体LB培养基中摇陪至0D600值为0? 6左右。
[0046] (3)将菌液冰浴 30min，4°C。5000rmp离心 10min，收集菌。
[0047] (4)用40ml预冷的10%甘油重悬菌体，4°C4500rmp，离心10min，收集菌体。
[0048] (5)用20ml预冷的10%甘油重悬菌体，4°C4500rmp，离心10min，收集菌体。
[0049] (6)用10ml预冷的10%甘油重悬菌体，4°C4500rmp，离心10min，收集菌体。
[0050] (7)用2ml预冷的10%甘油重悬菌体，分装每管50ml液氮速冻。-80°C保存。步 骤 2.PTVOO-HC-PRO电击转化进GV3101
[0051] (1)从_80°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。
[0052] (2)取lul纯化后的PTV00-HC-PR0质粒于1. 5ml的离心管中，将其和0. 1cm的电 击杯一起置于冰上预冷。
[0053] (3)将100ul解冻的感受态细胞转移至1. 5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置 10min〇
[0054] (4)打开电转仪，调至Manal，使其电压2.lkv。
[0055] (5)将此混合物转移至已预冷的点击杯中，轻轻敲击电击杯，使其混合物均匀进 入电击杯的底部。
[0056] (6)将电击杯推入电转化仪，按⑷中设定的参数，听到蜂鸣后，向电击杯中迅速 加入lml的S0C液体培养基，重悬细胞后，转移到1. 5ml的离心管中。
[0057] (7) 28°C、2〇Ormp震荡培养汕。
[0058] (8)取50-100ul菌液涂布在加有抗生素Kan和Rif?的LB培养基上，平板正向放置 lh，28°C倒置培养2-3天，直至菌落长出。
[0059] (9)以实施例1中的PCR扩增方法和反应体系，利用克隆载体检测引物M13+/-检 测转化子，阳性结果为PVY-HC-Pro基因片段长度为480bp，选择PCR检测为阳性转化菌，测 序验证：得到根癌农杆菌阳性菌液，标记为PTV00-HC-Pr〇-GV3101。
[0060] 实施例4含HC-Pro基因烟草的获得
[0061] 步骤1.PTV00-HC-Pro导入被试烟草
[0062] (1) 28°C、200rmp培养PTV00-HC-Pr〇-GV3101 和PBNTRA6-GV3101 菌液，摇至 0D600 为0. 4-0. 6左右；
[0063] (2)将PTV00-HC-PR0-GV3101 和PBNTRA6-GV3101 以 1:1 比例混合在一起，放置 30min；
[0064] (3)选取将剪叶的烟草苗，进行剪叶'喷施（2)中所述的混合菌液；
[0065] (4) 10min后，用清水喷施，将叶片菌液洗净；
[0066] (5)每隔3天喷施1次，连续喷施3次。
[0067] 步骤2.被试烟草RT-PCR检测
[0068] 待育苗盘烟草长至足够移苗，提取被试烟苗RNA，反转录合成cDNA，利用引物（PTV 00R:5'-TAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTC-3'，如SEQIDNo. 6 所示；PTV00F:5'-GGCAATCAGGTG CGACAATC-3'，如SEQIDNo. 7所示），RT-PCR检测HC-Pro基因是否成功转入被试烟草中。 结果如图5所示，显示HC-PR0基因成果转入。
[0069] 实施列5VIGS技术处理烟草的抗性确定
[0070] 本实验原理，TRV侵染烟草引起防卫反应，同时由于TRV的侵染将PVYHC-Pro基 因导入烟草，启动VIGS，PVY侵染烟草时引起HC-Pro基因同源降解，抑制PVY的侵染。
[0071] 待田间烟草进入旺长初期，摩擦接种马铃薯Y病毒脉坏死株系病毒。
[0072] (1)配置 0? 01mol/L、pH7. 0 磷酸缓冲液。PBS配置KC1 0? 2g、KH2P040. 2g、NaCl 8. 0g、Na2HP04 ? 2H20 1. 56g、溶于1000ml三蒸水中，分装消毒，高压锅中121°C20min消毒；
[0073] (2)病毒制备：取实验室保存含马铃薯Y病毒脉坏死株系烟草发病叶片。按1:200 比例加磷酸缓冲液，捣碎，双层纱布过滤后立即使用；
[0074] (3)借种方法：选取长成新叶，在表面均匀撒上碳化硅（600目），用毛笔蘸取接种 悬浮液，在叶面轻度摩擦造成微伤，每株接种1片叶，接种后20min用清水冲洗叶面上多余 的病毒汁液。接种当天温度为20-30°C，正常栽培管理；
[0075] (4)病情调查与分级标准，根据国家病害调查标准GB/T233222-2008。
[0076]
【主权项】
1. 一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，该方法步骤如下： (1) 制备含VIGS载体的根癌农杆菌；该VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒HC-Pro 序列； (2) 烟苗剪叶后喷施上述根癌农杆菌和PBNTRA6根癌农杆菌的体积比为1 :1的混合菌 液，使根癌农杆菌侵染剪叶烟苗，通过侵染将HC-Pro基因片段导入烟草。
2. 根据权利要求1所述的一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，其特征在于，所述 VIGS 载体为 PTVOO-HC-Pro 载体。
3. -种以马铃薯Y病毒基因为靶标的VIGS载体，其特征在于，所述VIGS载体的靶标序 列为马铃薯Y病毒HC-Pro序列。
4. 一种转化有权利要求3所述VIGS载体的菌株。
5. 根据权利要求4所述的菌株，其出发菌株为根癌农杆菌GV3101。
【专利摘要】一种使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法，该方法是首先制备含VIGS载体的根癌农杆菌；该VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒HC-Pro序列；再于烟苗剪叶后，喷施上述根癌农杆菌和PBNTRA6根癌农杆菌的混合菌液，使根癌农杆菌侵染剪叶烟苗，通过侵染将HC-Pro基因片段导入烟草。本发明同时提供一种以马铃薯Y病毒基因为靶标的上述VIGS载体。本发明以种植普通烟草为试材，以烟田危害广泛的马铃薯Y病毒为靶标病毒进行具体实验验证，实验数据显示，导入HC-Pro基因的烟草获得良好的PVY病毒抗性。
【IPC分类】C12N1-21, C12R1-01, C12N15-84, A01H5-00
【公开号】CN104531756
【申请号】CN201410544639
【发明人】蔡海林, 李帆, 曾维爱, 杨红武, 彭曙光, 唐前君, 魏润洁
【申请人】湖南省烟草公司长沙市公司, 湖南农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年10月15日