共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用基因工程培养植物领域，具体是一种利用转基因技术培育高青蒿 素含量的青蒿的方法。
【背景技术】
[0002] 青蒿（ArtemisiaeannieL.)，菊科，艾属。学名黄花蒿，另lj名臭蒿、香蒿、苦蒿。生 长于山坡、林缘及荒地，为一年生草本。老百姓用于消暑、头痛、退热和感冒等的治疗。提取 青蒿素则是利用青蒿地上部分叶片和未开放的花蕾，提取生产的有效生理活性成分如青蒿 素等产品，是低毒、高效、速效的抗疟新药（中国药典，2005;钟国跃，等，2007)。影响青蒿 青蒿素含量的因素有品种、土壤条件、播种时间、加工方法、收获时间、种植密度、光照条件、 施肥水平以及青蒿植株的不同部位等。青蒿素合成和贮存的主要器官是花蕾，青蒿野生资 源丰富，但青蒿素含量不高。不同地域的青蒿品种，花蕾中青蒿素含量的变化极显著，其中 以重庆地区酉阳和秀山青蒿的花蕾青蒿素含量最佳。为了降低制药厂提取青蒿素的制药成 本，除利用传统育种方法，近年来研宄利用基因工程方法提高青蒿的青蒿素含量，培育高青 蒿素含量的生物工程品种成为热点。
[0003] 青蒿主要药用成分及作用青蒿素化学结构含有过氧基团，是一种倍半萜内酯， 青蒿素的多种衍生物如双氢青蒿索（dihydroanemisin)、青蒿琥醋（anesunatc)、蒿甲醚 (ancmether)、蒿乙醚（aneether)，均是治疗疟疾的有效药物.研宄表明，二氢青蒿素对大 鼠C6细胞有选择性细胞毒作用.还可诱导肺癌细胞系PC-14细胞和SPC-A-1细胞凋亡。 青蒿琥酯对人大肠癌细胞有抑制作用，能抑制大肠癌细胞增殖和促进凋亡。蒿甲醚、蒿乙 醚和青篙琥酯作用于肿瘤细胞后，表达的mRNA与其对肿瘤细胞的抑制作用之间存在相关 性。结果显示青蒿素衍生物的药效作用方式与已知的抗癌药物不尽一致.随着对青蒿素类 药物药理作用研宄的不断深人，已证实其具有抗纤维化、抗弓形虫、抗疟、抗孕、抗血吸虫、 肿瘤细胞毒性和抗心律失常等作用。虽然该类药物作用广泛，但其作用机制、特点和应用仍 处于初级阶段，研宄表明青蒿素可通过抑制肺组织局部炎性反应来减轻脓毒症大鼠的肺损 伤。青蒿还含有挥发性成分，主要是挥发油包括篙酮、倍半褚醇、异篙酮、丁香烯、石竹烯氧 化物、按油精、旅烯、左旋樟脑、龙脑等成分。其中，篙酮、樟脑、丁香烯异篙酮、龙脑等含量较 高。挥发油具有抗菌消炎、解热镇痛、止咳平喘等功效。
[0004] 青蒿猫类化合物的合成主要通过MVA和DXP两个途径，S卩甲轻戊酸（mevalonate pathway，MVA)途径和 1_ 脱氧木酮糖 5_ 磷酸合酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)或甲基赤藓醇 4_ 磷酸（methylerythritol4-phosphatepathway，MEP) DXP途径。3-轻基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3_methylglutaryl coenzymeAreductase，HMGR)是MVA途径重要的限速酶，而1-脱氧木酮糖5-磷酸合 酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase，DXS)是DXP途径的关键性酶。在 3 种直接前体物质法呢基二磷酸（farnesyldiphosphate,FPP),香叶基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP)和香叶基香叶基二磷酸（geranylgeranyldiphosphate，GGPP)合 成之后，即进入猫稀合成过程，几种猫稀合酶（terpenesynthase，TPS)在此过程发 挥着重要的作用。GPP在单猫稀合酶（monoteterpenesynthase)作用下生成单猫稀 (monoterpene，CIO)，FPP在倍半猫稀合酶（sesquiterpenesynthase，SPS)作用下生成倍 半猫稀（sesquiterpene，C15)，GGPP在二猫稀合酶（diterpenesynthase)作用下成二猫稀 (diterpene，C20) 〇
[0005] 青蒿素是治疗疟疾的最主要的有效的临床用药，此外，药理学的深入研宄表明， 青蒿素及其衍生物是一种广谱性的天然药物。研宄表明，每年世界上有超过100万人死于 疟疾。疟原虫耐药性，使得抗疟药物氯喹的药物效果受限，而青蒿素对疟疾具有低毒和速 效的特点。目前青蒿素是公认有效的治疗疟疾首选药物，这使得提取青蒿素的原材料青 蒿需求量非常大。生物工程技术成为提高青蒿素含量的可行途径之一。Chen等利用在青 蒿中能够过量表达PEP基因，转化的青蒿植株中青蒿素含量比对照高3-5倍。Teoh等认 为cyp71avl基因在青蒿素生物合成途径中是关b键的限速基因，并从特异cDNA中克隆到 cyp71avl基因。Ro等也克隆cyp71avl基因及其氧还伴侣基因cpr,并将cyp71avl基因和 cpr基因导入酵母并成功地提高了青蒿素含量。文献中有利用A0C基因（唐克轩，等）以及 ADS，CYP71AV1，CPR(唐克轩，等）三个基因通过根瘤农杆菌介导获得生物工程青蒿的报道， 均是利用目的基因提高青蒿素含量的方法。
[0006] 从中药材青蒿花蕾中提取的青蒿素（ArtemisiaannuaL.)用于抗疱疾，原材料 青蒿需求量大，但野生青蒿得青蒿素含量很低，只占青蒿植株干重〇. 01-0. 1%，如何提高 青蒿素含量，成为热点课题，通过生物工程办法改造提高青蒿素含量是一种有效途径。
【发明内容】
[0007] 针对现有生产中对高青蒿素含量青蒿的需求，本发明所要解决的技术问题是在青 蒿基因组中导入能增加青蒿素合成的基因，并增强其原有基因的表达，获得转基因青蒿新 品系，以提高其青蒿素合成能力，使其花蕾中能超量蓄积青蒿素，使这种转基因青蒿品系成 为工业化大规模生产的原材料。
[0008] 倍半猫稀合酶（sesquiterpenesynthase，Sps,EC4. 3. 1. 8)是青蒿植株合 成青蒿素的关键酶，而3-轻基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3_methyl glutarylcoenzymeAreductase,HMGR,EC: 1. 1. 1. 34)，1-脱氧木酮糖 5_ 磷酸合酶 (1-deoxy-D-xylulose5-phosphatesynthase，DXS,EC4. 1.3. 37)，是合成青蒿素的限速 酶。增强Sps，HMGR和DXS三个酶的活性，可以提高植株青蒿素的含量，本发明将关键酶基 因Sps，Hmgr和Dxs三基因转化青蒿，提高青蒿中的青蒿素合成，获得高青蒿素含量的基因 工程青蒿品种，为培育高青蒿素含量的青蒿提供一种新的方法。本发明旨在构建Sps，Hmgr 和Dxs三基因的两两组合构建植物表达载体，并获得重组工程植株，利用生物工程技术培 育高青蒿素含量的青蒿奠定基础。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花 蕾高青篙素含量青蒿的方法，包括如下步骤：
[0010] 1)克隆倍半萜烯合酶的基因片段，记为Sps基因片段，并将Sps基因片段构建成 Anti-Sps基因植物表达载体；
[0011] 2)克隆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段，记为Hmgr基因片段，并 将Hmgr基因片段构建成Anti-Hmgr基因植物表达载体；
[0012] 2)克隆1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶的基因片段，记为Dxs基因片段，并将Dxs基因 片段构建成Anti-Dxs基因植物表达载体；
[0013] 4)将利用转基因技术将Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs导入青蒿，获得包含 Sps、Hmgr基因和Dxs基因的青蒿植株。该步中可以将Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs 同时导入同一青蒿，获得包括SpS、Hmgr和Dxs基因片段的转基因青蒿。还可以采用电击法 将Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs导入同一农杆菌感受态细胞LBA4404,然后采用农杆 菌介导法将所述农杆菌感受态细胞LBA4404导入青蒿，构成包含Sps、Hmgr和Dxs基因的青 蒿植株。
[0014] 本发明所述的构建Sps、Hmgr和Dxs基因植物表达载体包括：从亚克隆中酶切出 目的基因片段，电泳回收后与植物表达载体，例如PCAMBIA2301连接成转化质粒，然后转化 (AgrobacteriumTumefaciens)大肠杆菌DH5a感受态细胞，并进行抗性筛选。按照英文影印 版5拟南芥实验手册6.DetlefweigelandJaneGlaZebrook.化学工业出版社.2004年3月 第1版，第1次印刷的方法制备）
[0015] 本发明所述的生物工程方法，采用农杆菌介导法。其中，优选农杆菌介导法（参见 SambrookT，TanaKaK，MonmaT.MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpring HarborLaboratorypress，NewYork，1989)。经由农杆菌感受态细胞LBA4404感染的青蒿 外植体（如无菌苗下胚轴）再生为正常植株。
[0016] 本发明用于作为Sps、Hmgr和Dxs基因受体亲本的青蒿素含量相对高的青蒿是同 一品种。利用本发明获得花蕾青篙素含量提高的转基因青篙植株，在非转化对照青篙含量 为6. 20mg/g干重时，本发明得到的基因工程青篙植株中花蕾青篙素含量最高12. 10mg/g 干重，其含量是非转化对照青篙含量的1. 95倍，本发明的方法对于以青篙为原料的药厂 节约成本具有重要意义。
【附图说明】
[0017] 图1植物双元表达载体载体结构图；
[0018] 图中A为pCAMBIA23(U-Sps-Hmgr，B为