干扰lcyb、lcye表达同时异位表达tt8在制备红色花瓣芸薹属植物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及干扰LCYB、LCYE表达同时异位表达TT8在制 备红色花瓣芸薹属植物中的应用。
【背景技术】
[0002] 油菜是重要的油料作物，栽培历史悠久、经济价值高、用途广泛、适应性强，是我国 的第一大油料作物，也是世界性的重要油料作物。物种分类学上，油菜由芸薹属的三个物种 构成，分别为甘蓝型油菜（Brassicanapus，2n= 38,AACC)、白菜型油菜（Brassicarapa ssp.oleiferasyn.B.campestris，2n= 20,AA)、芥菜型油菜（Brassicajuncea，2n= 36， AABB)。甘蓝型油菜油菜是由白菜（Brassicarapa)与甘蓝（Brassicaoleracea，2n= 18,CC)通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种，虽然栽培历史仅有几百年， 但由于其生长势强，丰产性高，已占世界及我国油菜种植面积90%的以上。白菜型油菜是 芸薹属最早被驯化的物种之一，原产于我国西北地区的大白菜演化而来，世界范围内有广 泛的分布面积和悠久的栽培历史。芥菜型油菜是由白菜与黑芥（Brassicanigra，2n= 16,BB)天然杂交后再自然加倍形成的双二倍体复合种，中国是其原始起源与分化中心，种 植范围遍布世界。
[0003] 随着经济水平的持续发展和社会现代化程度的不断提升，大众对生活品味的追求 也与日俱增，不仅传统的名山大川式的旅游越来越火，田园休闲观光产业的发展也很迅速。 油菜大面积生产上形成金黄色花的海洋，是越来越重要的田园生态旅游资源。油菜花观赏 的时间为每年的十二月底到来年夏季。每个地方因为种植的时间略有不同，花期会有一点 差异。在我国已形成几十个知名油菜花观赏地区，油菜花开时，竞相怒放、流金溢彩、绵延数 十里，好似金浪滔滔的海洋。
[0004] 自然界花丼颜色虽然种类繁多，但除芥蓝（B.oleraceavar.alboglabra)的花瓣 是乳白色以外，芸薹属植物的花瓣普遍为黄色系列，商业油菜品种全是黄色花瓣，过于单 调。随着油菜花色田园生态观光产业的迅猛发展，迫切需要多姿多彩的花色性状，使之还可 以开出红色、蓝色等，在不影响油菜菜籽的出油率和其他传统用途之外，增加其赏花价值， 助推生态观光旅游。此外，特定的花色还是油菜育种界渴望的选择标记性状，而且花色的非 黄色化还有助于减少露尾甲等虫害。因此，需要解析油菜花色性状的分子机理，并开展新花 色的分子育种。
[0005] 萝卜（Raphanussativus)属于萝卜属，近年来的分子证据表明萝卜与白菜、甘蓝、 甘蓝型油菜的距离甚至远小于黑芥与它们的距离，意思是说萝卜与芸薹属核心物种的距离 小于芸薹属内部的种间距离。但另一方面，萝卜能开出红色系的花色，而芸薹属和众多近缘 属（如白芥属）则只能开出黄色系的花。这是一个奇怪的现象，因此开展芸薹属与萝卜花 色性状的比较研宄，不仅是这些生物花色性状基础研宄的需要，也可为油菜等芸薹属植物 花色性状的遗传改良提供指导。
[0006] 重要观花植物的花色分子机理和分子育种已取得显著进展，为研宄其它植物花色 机理和开展分子育种提供了重要参考。花色主要由类黄酮（flavonoids)和类胡萝卜素 (carotenoids)两大类色素决定。
[0007] 类黄酮是最见的花色素，贡献黄色、橙色、红色到紫色的一系列色系。类黄酮 为水溶性物质，具有一个C15骨架，按结构主要分为9类：查尔酮（chalcones)、橙酮 (aurones)、异黄酮（isoflavonoids)、黄酮（flavones)、黄酮醇（flavonols)、黄烧双 醇（flavandiols)、花色苷（anthocyanins)、缩合单宁（condensedtannins,即原花青 素，proanthocyanins)和親酐（phlobaphenes)，它们中对植物着色贡献最大的是花色苷、 黄酮醇、查尔酮和橙酮。花色苷是最大的一类类黄酮物质，为花朵或其它组织贡献品红、红 色、紫色、蓝色等色调，积累于细胞的液泡或色素细胞中，天竺葵素（pelargonidin)、矢车菊 素（cyanidin)、飞燕草素（delphinidin)是最常见的三类花色苷；而黄色色调则由查尔酮、 橙酮、黄酮醇、黄酮提供。
[0008] 矮牵牛、玉米、金鱼草、拟南芥等植物中的类黄酮生物合成途径已被充分解析。它 是公共体丙烷生物合成途径下游的一个重要分支途径，苯丙烷途径通过其它分支途径合成 木质素、芪类、香豆素、植保素等多种次生物质。类黄酮途径的第一步是由查酮合酶（CHS) 催化1分子P-香豆酰-CoA与3分子丙二酰-CoA缩合形成浅黄色的4, 2'，4'，6' -四羟基 查尔酮。花色苷配基如天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素等是以查尔酮为底物，经羟化、还原、 氧化、侧基修饰等几步酶的催化反应而形成，依次涉及CHI(查尔酮异构酶）、F3H(黄烷酮 3-羟化酶）、F3'H(类黄酮3' -羟化酶）、F3' 5'H(类黄酮3'，5' -羟化酶）、DFR/FNR(二 氢黄酮醇4-还原酶/黄烷酮4-还原酶）、ANS(花青素合成酶）等。由F3'H和F3' 5'H 决定的花青素（anthocyanidins)的B-环上的轻基越多，则颜色越偏向蓝色。通常情况下， 查尔酮和花青素被进一步修饰，如糖基化（糖基转移酶，GT)、甲基化（甲基转移酶，MT)、酰 基化（酰基转移酶，AT)，然后转运（谷胱甘肽S-转移酶，GST)到液泡中贮存。在黄色金鱼 草花的液泡中，查尔酮4' -0-葡萄糖苷被金鱼草素合成酶（AS)转变成亮黄色的金鱼草素 (6-0-葡萄糖苷）。艳桐草等植物的橙色至红色花朵中，黄烷酮经过几步反应而合成3-脱 氧花色苷。此外，黄酮和黄酮醇也对花色起一定贡献，它们为无色或浅黄色，可通过所谓共 色作用来促进蓝色花色苷的形成和稳定。黄酮和黄酮醇分别是以黄烷酮和二氢黄酮醇为底 物，在黄酮合酶（FNS)和黄酮醇合酶（FLS)的催化下合成的。除花青素外，黄酮醇、查尔酮 等其它类黄酮物质也可能涉及糖基化等修饰。
[0009] 模式生物的研宄表明，类黄酮途径结构基因的表达是被一个由R2R3-MYB(有PAP、 PFG、TT2 等）、碱性螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH，有IT8、GL3、EGL3 等） 和WD4〇重复（WDR，有TTG1等）形成的转录因子复合物所调控的，该三元复合物调控了观花 植物金鱼草、矮牵牛、牵牛花、非洲菊和龙胆花的花瓣中花色苷着色的过程，调控行为受器 官、组织等体内信号和光、紫外线等外部信号所影响。拟南芥的研宄表明，黄色调的黄酮醇 (苷）生物合成途径的表达则由PFG基因特异调控，其中成员MYB11、MYB12、MYB111在器官 特异性上发生明显分工。
[0010] 类胡萝卜素（carotenoids)是脂溶性的红色、橙色和黄色色素，嵌合在叶绿体和 有色体的膜中。类胡萝卜素是C40-四萜类化合物，由C5-异戊二烯基础单元合成而来，植 物、真菌、藻类和细菌均可合成，动物虽不能合成，但可从食物中摄入并用作色素和维生素A 的前体物。类胡萝卜素为许多花色贡献了黄色色系，并单独或与花色苷一道为玫瑰、菊花 等一些植物的花瓣贡献了橙/红、黄褐色和褐色色调。迄今，植物类胡萝卜素生物合成途径 的几乎全部关键酶基因已被克隆和鉴定，整个途径起始于质体中的C5的异戊二烯焦磷酸 (isopentenylpyrophosphate,IPP)单元，据认为该途径的有关酶之间形成复合物并结合 于质体膜上，4分子IPP缩合为1分子C20的香叶基香叶基焦磷酸（GGPP)，在八氢番茄红素 合酶（PSY)的催化下2分子GGPP头对头地偶合成C40的无色的八氢番茄红素，它是第一个 类胡萝卜素。随后，八氢番茄红素脱饱和酶（ros)和胡萝卜素脱饱和酶（ZDS)向分子 中顺序引入共轭双链，先后形成无色的六氢番茄红素、浅黄色的胡萝卜素、橙黄色的链 孢红素、红色的番茄红素。随着共轭双链数的增加，吸收波长向长波方向移动。脱饱和过程 中产生的一些顺式构象被类胡萝卜素异构酶（CRTI