简单快速高通量筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种简单快速高通量筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法，涉及芸薹属植物育种和种质资源筛选技术领域。本方法包括以下步骤：①种子消毒；②种子发芽床的制备；③摆放种子；④催芽处理；⑤萌芽生长；⑥胚根长度测量；⑦子叶期胚根长度抑制作用的评价；⑧筛选出参试组中低积累重金属镉的芸薹属植物。本发明只需要在种子发芽床上用一定浓度的镉溶液处理参试的芸薹属植物种子，即可筛选出低积累重金属镉的芸薹属植物，具有简单和省力的优点；筛选仅需要一周的时间，极大缩短了筛选周期，加快了筛选的进程；能够高通量地筛选出大群体中的低积累重金属镉的芸薹属植物；不依赖于昂贵测定仪器，成本低，很容易大范围推广应用。
【专利说明】
简单快速高通量筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法
技术领域
[0001]本发明涉及芸薹属植物育种和种质资源筛选技术领域，尤其涉及一种简单快速高通量筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法，用于筛选低积累重金属镉的优异芸薹属植物种质材料。
【背景技术】
[0002]镉(Cadmium，Cd)位于元素周期表第五周期IIB族，其分子量为112.41，是银白色有光泽的金属，广泛应用于化工行业。重金属镉是生物体非必需金属元素，是对人、动物和植物均有毒害作用的重金属元素之一；高浓度的重金属镉会抑制植物的生长发育，导致农作物的产量降低;另外，积累在农作物中的重金属镉会通过食物链富集在人体内，对人类的身体健康造成严重的威胁。
[0003]随着工业化和城镇化的发展，世界上的许多国家都面临着严重的镉污染问题。20世纪50至70年代，日本富山县神通川流域由于严重的镉污染，该地区发生了一种公害病一一“骨痛病”；此后，重金属镉污染的问题才引起全世界的广泛关注。在中国，2010年2月国家环境保护部、统计局和农业部联合发布了《第一次全国污染源普查公报》，其中数据显示全国重金属(镉、铬、砷、汞、铅)污染物排放总量高达0.09万吨。2014年4月发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国土壤总的点位超标率为16.1%，重金属镉点位超标率达7.0%，居污染物之首；另外，耕地的土壤点位超标率最高，达19.4%，可见，重金属镉污染已经严重威胁到我国大部分地区的农业生产。
[0004]芸薹属植物中的甘蓝型油菜是我国的主要油料作物，芸薹属植物中的大白菜、小白菜、甘蓝、西兰花等是主要的日常消费蔬菜，有报道称，湖南、江西等主产区重金属镉污染严重，极大地威胁了芸薹属植物的安全生产。研究表明，重金属镉污染会抑制芸薹属植物的生长和发育，导致发育延迟、生长不良等症状，最终降低芸薹属植物产量。研究证明，芸薹属植物极易富集土壤中的重金属镉，镉迀移至食用器官将会严重降低芸薹属植物的品质，生产出的农产品也不符合安全标准，误食还会对人体造成极大的伤害。
[0005]植物对重金属镉的富集作用不仅存在种间差异，在种内也存在显著的差异。低积累重金属镉的作物种质资源筛选和新品种的选育相关的研究已经成为当前国内外研究的一大热点;前人研究结果表明水稻、小麦、大麦等作物对重金属镉的积累量存在较大的种内变异。筛选和培育低积累重金属镉的芸薹属植物材料，保障芸薹属植物这一重要的经济作物体系的安全生产，将是芸薹属植物种质资源筛选和育种工作的一项重要任务。因此，急需探索有效的途径，在芸薹属植物种质资源中筛选和发掘低积累重金属镉的优异资源，大力开展低积累重金属镉的芸薹属植物新品种的培育。
[0006]传统筛选芸薹属植物中重金属镉积累量的方法主要是运用石墨炉原子吸收光谱、火焰原子吸收光谱和电感耦合等离子体发射光谱等仪器进行镉含量的测定，这些方法具有精度高的优点;但是，其检测成本很高，仪器操作、样品的制备也极其复杂，很难对育种群体和种质资源材料进行大规模筛选。为此，建立一种简单快速高通量筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法不仅可以加快低积累芸薹属植物优异种质资源的筛选和发掘工作，也可以提高育种群体中低积累芸薹属植物的早期筛选效率，对于促进重金属镉污染地区的芸薹属植物安全生产工作起着至关重要的作用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种简单快速高通量筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法。
[0008]本发明提供的筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法包括下列步骤:
①种子消毒
选取饱满、无病虫和大小均一的芸薹属植物种子若干参试组，每组300粒，用75%酒精消毒5min，并用蒸馏水冲洗干净，消毒结束后，用滤纸吸干种子表面的水分备用；
②种子发芽床的制备
种子发芽床分为处理组种子发芽床和对照组种子发芽床:
在培养皿(边长为12cm的方形塑料皿)中铺4层定性滤纸，又加l_50mg/L浓度的Cd2+溶液15mL，即所述的处理组种子发芽床；
在培养皿(边长为12cm的方形塑料皿)中铺4层定性滤纸，又加等量双蒸水，即所述的对照组种子发芽床；
每个处理组和对照组均分别设置3次重复；
③摆放种子
将步骤①中消毒的种子均匀摆放在步骤②中的发芽床上，发芽密度为每皿放置50粒种子，并用封口膜密封培养皿；
④催芽处理
将步骤③中密封的培养皿置于人工气候箱内，22°C黑暗培养2天，进行催芽处理；
⑤萌芽生长
催芽结束后，置于22°C人工气候箱内，光周期为16h光照、8 h黑暗的条件下培养5天；
⑥胚根长度测量
每皿选取生长一致的幼苗10株测量其胚根长度；
⑦子叶期胚根长度抑制作用的评价
根据步骤⑥中测量的对照组和处理组的根长，评价每个参试组镉胁迫下子叶期胚根长度的抑制作用；
⑧筛选出参试组中低积累重金属镉的芸薹属植物
选择参试组中镉胁迫下子叶期胚根长度抑制作用小的芸薹属植物即为低积累重金属镉的芸薹属植物。
[0009]所述步骤⑥中的胚根长度是指芸薹属植物子叶期幼苗从根尖到胚根与胚轴连接点的全部长度，单位为毫米。
[0010]所述步骤⑦中的镉胁迫下子叶期胚根长度的抑制作用其评价指标包括镉害系数(CTI ,Cadmium Toxicity Index)和相对胚根长度(RRL，Relative Radicle Length)；
其中:镉害系数 CTI=(RL_ck-RL_Cd)/RL_ckX 100;
相对胚根长度RRL=RL_Cd/RL_ck ； RL为胚根长度，
RL_ck为对照组胚根长度，
RL_Cd为镉处理组胚根长度。
[0011]所述步骤⑧筛选出参试组中低积累重金属镉的芸薹属植物的依据是:芸薹属植物种子在镉胁迫下子叶期胚根长度抑制作用越小的材料重金属镉的积累量越少，而胚根长度抑制作用越大的材料重金属镉的积累量越多。
[0012]本发明具有下列优点和积极效果:
①只需要在种子发芽床上用一定浓度的镉溶液处理参试的芸薹属植物种子，即可筛选出低积累重金属镉的芸薹属植物，相对于传统的水培、土培和大田栽培等方法具有简单和省力的优点；
②筛选仅需要一周的时间，极大缩短了筛选周期，加快了筛选的进程；
③能够高通量地筛选出大群体中的低积累重金属镉的芸薹属植物；
④不依赖于昂贵测定仪器，成本低，很容易大范围推广应用。
【附图说明】
[0013]图1是根长测量方法示意图；
其中A:胚根与胚轴的链接点;B:根尖;C:根长。
[0014]图2是不同甘蓝型油菜品种在镉溶液处理后子叶中镉含量的示意图。
[0015]该图的横坐标为甘蓝型油菜品种，纵坐标为甘蓝型油菜子叶中镉含量(mg/Kg);A1-A4为子叶期胚根长度受镉抑制作用小(低积累镉)的4个甘蓝型油菜品种；
B1-B4为子叶期胚根长度受镉抑制作用大(高积累镉)的4个甘蓝型油菜品种。
[0016]图3是不同白菜品种在镉溶液处理后子叶中镉含量的示意图。
[0017]该图的横坐标为白菜品种，纵坐标为白菜子叶中锦含量(mg/Kg)；
A1-A4为子叶期胚根长度受镉抑制作用小(低积累镉)的4个白菜品种；
B1-B4为子叶期胚根长度受镉抑制作用大(高积累镉)的4个白菜品种。
[0018]【具体实施方式】:
下面结合附图和实施例详细说明:
实施例1:
以测量8个甘蓝型油菜品种在对照(双蒸水处理)和50mg/L的Cd2+溶液处理后的子叶期胚根长度，以镉害系数为指标对镉溶液胁迫下参试甘蓝型油菜子叶期胚根长度的抑制作用进行评价，并对抑制作用进行分级，筛选出参试甘蓝型油菜品种中低积累重金属镉的品种，对本发明的【具体实施方式】进行说明；然后测定所试甘蓝型油菜种子镉胁迫后子叶中镉积累量，统计分析不同分级的甘蓝型油菜子叶中重金属镉的积累规律，来验证本发明的筛选结果O
[0019]1、筛选低积累镉甘蓝型油菜品种的具体实施方案如下:
1)种子消毒
选取待筛选甘蓝型油菜品种的饱满、无病虫、大小均一的种子各300粒，用75%酒精消毒5min，并用蒸馏水冲洗干净;消毒结束后，用滤纸吸干种子表面的水分备用；
2)种子发芽床的制备在培养皿(边长为12 cm的方形塑料皿)中铺4层定性滤纸，处理组加50 mg/L的Cd2+溶液15 mL，对照组加等量的双蒸水，每个处理设置3次重复；
3)摆放种子
将步骤I)中消毒后的种子均匀摆放在步骤2)中的发芽床上，发芽密度为每皿放置50粒种子，并用封口膜密封培养皿；
4)催芽处理
将步骤3)中密封的培养皿置于人工气候箱内22 °C黑暗培养2天，进行催芽处理；
5)萌芽生长
催芽结束后，置于22°C人工气候箱内，光周期为16 h光照、Sh黑暗的条件下培养5天；
6)子叶期胚根长度测量
每皿选取生长一致的幼苗10株测量其胚根长度；
7)子叶期胚根长度抑制作用的评价
用Excel 2003计算各品种的镉害系数[CTI =(RL_ck_RL_Cd)/RL_ckX 100，其中RL为胚根长度，RL_ck为对照组胚根长度，RL_Cd为镉处理组胚根长度)并并根据镉害系数的大小对胚根长度被抑制的程度进行分级，其中镉害系数小于50的为A级并编号为A1-A4，相应的镉害系数大于50的为B级并编号为B1-B4。
[0020]注:本次试验仅8个品种参试，故只分两级，如果供试材料群体很大，可以酌情进行多个分级。
[0021 ] 8)筛选出参试甘蓝型油菜中低积累重金属镉的材料
本实施例中A1-A4这四个品种的胚根抑制作用较小，为筛选出的低积累重金属镉的甘蓝型油菜品种。
[0022]2、验证本发明的筛选结果的具体实施方案如下:
1)样品收集
镉胁迫处理一周的甘蓝型油菜幼苗，用蒸馏水冲洗3次以上，洗净表面可能残留的Cd2+吸干幼苗表面的水分，分别分离每皿幼苗的子叶，并分别收集于牛皮纸袋中；
2)样品干燥处理
收集完成后，将材料置于烘箱中在105°C条件下杀青15 min，然后在烘箱中60V烘干48h至恒重；
3)样品消化
将完全烘干的样品粉碎，并称取0.3-0.5 g(记为G)于聚四氟乙烯消化管内，加入5 mL混合酸(HN03:HC104=4:1)过夜(12 h)消化；
4)样品消煮
消化后的样品，至于电热板上消煮，采用逐步升温:60°C，30 min，120°C，30 min，160°C,1 h，200°C消煮至溶液透明澄清；
5)过滤定容
消煮得到的溶液经漏斗过滤至5 mL的容量瓶中，并用双蒸水定容备用。
[0023]6)镉含量测定
定容后的样品采用电感親合等离子体发射光谱(仪器型号:热电Intrepid XSP等离子体原子发射光谱仪)检测其中的金属镉含量(记为Cl); 7)各组织样品中镉含量计算
计算各品种在50 mg/L的Cd2+溶液处理下子叶中镉含量C，计算公式为:C= (:1*5/6。八级(镉害系数小于50)和B级(镉害系数大于50)甘蓝型油菜子叶中镉含量的均值分别为163.08^404.52 mg/Kg；
8)数据统计分析
统计分析A级和B级甘蓝型油菜子叶中镉含量(见图2)规律，根据统计分析结果，可得出结论:镉害系数小(A级，胚根长度抑制作用小)的甘蓝型油菜品种(A1-A4)积累的镉量显著低于镉害系数大(B级，胚根长度抑制作用大)的甘蓝型油菜品种(B1-B4)。
[0024]因此本发明的筛选方法是可行的，能够简单、快速、准确地筛选出参试甘蓝型油菜中低积累重金属镉的材料。
[0025]实施例2:
以测量8个白菜品种在对照(双蒸水处理)和30mg/L的Cd2+溶液处理后的子叶期胚根长度，以镉害系数为指标对镉溶液胁迫下参试白菜子叶期胚根长度的抑制作用进行评价，并对抑制作用进行分级，筛选出参试白菜品种中低积累重金属镉的品种，对本发明的【具体实施方式】进行说明；然后测定所试白菜种子镉胁迫后子叶中镉积累量，统计分析不同分级的白菜子叶中重金属镉的积累规律，来验证本发明的筛选结果。
[0026]1、筛选低积累镉白菜品种的具体实施方案如下:
1)种子消毒
选取待筛选白菜品种的饱满、无病虫、大小均一的种子各300粒，用75%酒精消毒5min，并用蒸馏水冲洗干净;消毒结束后，用滤纸吸干种子表面的水分备用；
2)种子发芽床的制备
在培养皿(边长为12 cm的方形塑料皿)中铺4层定性滤纸，处理组加50 mg/L的Cd2+溶液15 mL，对照组加等量的双蒸水，每个处理设置3次重复；
3)摆放种子
将步骤I)中消毒后的种子均匀摆放在步骤2)中的发芽床上，发芽密度为每皿放置50粒种子，并用封口膜密封培养皿；
4)催芽处理
将步骤3)中密封的培养皿置于人工气候箱内22 °C黑暗培养2天，进行催芽处理；
5)萌芽生长
催芽结束后，置于22°C人工气候箱内，光周期为16 h光照、Sh黑暗的条件下培养5天；
6)子叶期胚根长度测量
每皿选取生长一致的幼苗10株测量其胚根长度；
7)子叶期胚根长度抑制作用的评价
用Excel 2003计算各品种的镉害系数[CTI =(RL_ck_RL_Cd)/RL_ckX 100，其中RL为胚根长度，RL_ck为对照组胚根长度，RL_Cd为镉处理组胚根长度)并并根据镉害系数的大小对胚根长度被抑制的程度进行分级，其中镉害系数小于50的为A级并编号为A1-A4，相应的镉害系数大于50的为B级并编号为B1-B4。
[0027]注:本次试验仅8个品种参试，故只分两级，如果供试材料群体很大，可以酌情进行多个分级。
[0028]8)筛选出参试白菜中低积累重金属锦的材料
本实施例中A1-A4这四个品种的胚根抑制作用较小，为筛选出的低积累重金属镉的白菜品种。
[0029]2、验证本发明的筛选结果的具体实施方案如下:
1)样品收集
镉胁迫处理一周的白菜幼苗，用蒸馏水冲洗3次以上，洗净表面可能残留的Cd2+吸干幼苗表面的水分，分别分离每皿幼苗的子叶，并分别收集于牛皮纸袋中；
2)样品干燥处理
收集完成后，将材料置于烘箱中在105°C条件下杀青15 min，然后在烘箱中60V烘干48h至恒重；
3)样品消化
将完全烘干的样品粉碎，并称取0.3-0.5 g(记为G)于聚四氟乙烯消化管内，加入5 mL混合酸(HN03:HC104=4:1)过夜(12 h)消化；
4)样品消煮
消化后的样品，至于电热板上消煮，采用逐步升温:60°C，30 min，120°C，30 min，160°C,1 h，200°C消煮至溶液透明澄清；
5)过滤定容
消煮得到的溶液经漏斗过滤至5 mL的容量瓶中，并用双蒸水定容备用。
[0030]6)镉含量测定
定容后的样品采用电感親合等离子体发射光谱(仪器型号:热电Intrepid XSP等离子体原子发射光谱仪)检测其中的金属镉含量(记为Cl);
7)各组织样品中镉含量计算
计算各品种在30 mg/L的Cd2+溶液处理下子叶中镉含量C，计算公式为:C= (:1*5/6。八级(镉害系数小于50)和B级(镉害系数大于50)白菜子叶中镉含量的均值分别为315.35、505.38 mg/Kg；
8)数据统计分析
统计分析A级和B级白菜子叶中镉含量(见图2)规律，根据统计分析结果，可得出结论:镉害系数小(A级，胚根长度抑制作用小)的白菜品种(A1-A4)积累的镉量显著低于镉害系数大(B级，胚根长度抑制作用大)的白菜品种(B1-B4)。
[0031 ]因此本发明的筛选方法是可行的，能够简单、快速、准确地筛选出参试白菜中低积累重金属镉的材料。
【主权项】
1.一种简单快速高通量筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法，其特征在于: ①种子消毒 选取饱满、无病虫和大小均一的芸薹属植物种子若干参试组，每组300粒，用75%酒精消毒5min，并用蒸馏水冲洗干净，消毒结束后，用滤纸吸干种子表面的水分备用； ②种子发芽床的制备 种子发芽床分为处理组种子发芽床和对照组种子发芽床: 在培养皿即边长为12cm的方形塑料皿中铺4层定性滤纸，又加1-50mg//L浓度的Cd2+溶液15mL，即所述的处理组种子发芽床； 在培养皿即边长为12cm的方形塑料皿中铺4层定性滤纸，又加等量双蒸水，即所述的对照组种子发芽床； 每个处理组和对照组均分别设置3次重复； ③摆放种子 将步骤①中消毒的种子均匀摆放在步骤②中的发芽床上，发芽密度为每皿放置50粒种子，并用封口膜密封培养皿； ④催芽处理 将步骤③中密封的培养皿置于人工气候箱内，22°C黑暗培养2天，进行催芽处理； ⑤萌芽生长 催芽结束后，置于22°C人工气候箱内，光周期为16h光照、8 h黑暗的条件下培养5天； ⑥胚根长度测量 每皿选取生长一致的幼苗10株测量其胚根长度； ⑦子叶期胚根长度抑制作用的评价 根据步骤⑥中测量的对照组和处理组的根长，评价每个参试组镉胁迫下子叶期胚根长度的抑制作用； ⑧筛选出参试组中低积累重金属镉的芸薹属植物 选择参试组中镉胁迫下子叶期胚根长度抑制作用小的芸薹属植物即为低积累重金属镉的芸薹属植物。2.按权利要求1所述的筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法，其特征在于: 所述步骤⑥中的胚根长度是指芸薹属植物子叶期幼苗从根尖到胚根与胚轴连接点的全部长度，单位为毫米。3.按权利要求1所述的筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法，其特征在于: 所述步骤⑦中的镉胁迫下子叶期胚根长度的抑制作用其评价指标包括镉害系数CTI和相对胚根长度RRL; 其中:镉害系数 CTI=(RL_ck-RL_Cd)/RL_ck X 100; 相对胚根长度RRL=RL_Cd/RL_ck ； RL为胚根长度， RL_ck为对照组胚根长度， RL_Cd为镉处理组胚根长度。4.按权利要求1所述的筛选低积累重金属镉芸薹属植物的方法，其特征在于: 所述步骤⑧筛选出参试组中低积累重金属镉的芸薹属植物的依据是:芸薹属植物种子在镉胁迫下子叶期胚根长度抑制作用越小的材料重金属镉的积累量越少，而胚根长度抑制作用越大的材料重金属镉的积累量越多。
【文档编号】A01H1/04GK106069739SQ201610416316
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610416316.8, CN 106069739 A, CN 106069739A, CN 201610416316, CN-A-106069739, CN106069739 A, CN106069739A, CN201610416316, CN201610416316.8
【发明人】伍晓明, 张付贵, 肖欣, 高桂珍, 闫贵欣, 陈碧云, 许鲲
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所